Microbiologia Laboratorial

Escola Superior de Saúde
Politécnico do Porto
Relatório de Estágio
Microbiologia
Sérgio José Pinto Teixeira

10120508
Análises Clínicas e Saúde Pública, 4º Ano
05 de dezembro a 29 de dezembro de 2016
Índice Geral
ÍNDICE GERAL ....................................................................................................................................................... II
ÍNDICE DE FIGURAS ............................................................................................................................................. IV
ÍNDICE DE QUADROS..........................................................................................................................................VII
SIGLAS E ABREVIATURAS...................................................................................................................................VIII
INTRODUÇÃO ....................................................................................................................................................... 1
ENQUADRAMENTO TEÓRICO – MICROBIOLOGIA CLÍNICA LABORATORIAL .......................................................... 3
MICROBIOLOGIA CLÍNICA LABORATORIAL NO IPO PORTO ................................................................................... 3

RECEÇÃO E PROCESSAMENTO DE AMOSTRAS ...................................................................................................................... 4
Meios de cultura ................................................................................................................................................. 5
Classificação dos meios de cultura .....................................................................................................................................6
CLED - Cystine Lactose Electrolyte Deficient ..................................................................................................................7
PVX - Gelose de Chocolate .............................................................................................................................................7
COS - Gelose de Sangue ................................................................................................................................................7
MCK – MacConkey .........................................................................................................................................................7
MSA2 – Manitol Salt Agar ..............................................................................................................................................8
SGC2 - Sabouraud Gentamicin Chloramphenicol ...........................................................................................................8
MRSA - Methicillin-Resistant Strains of Staphylococcus aureus ....................................................................................8
SS - Salmonella-Shigella .................................................................................................................................................8
SM2 - ChromID Salmonella ............................................................................................................................................9
SCS - Schaedler 5% Sheep Blood ....................................................................................................................................9
SNVS - Schaedler Neomycin Vancomycine 5% Sheep Blood ..........................................................................................9
GN - Gram Negative Broth .............................................................................................................................................9
Todd Hewitt Broth .........................................................................................................................................................9
MH2 - Mueller Hinton 2 .................................................................................................................................................9
Sementeiras....................................................................................................................................................... 10
Técnica de sementeira por estria central .........................................................................................................................10
Técnica de sementeira por quadrantes ............................................................................................................................10
Técnica de sementeira por 3 planos.................................................................................................................................11
Técnica de sementeira por rolamento .............................................................................................................................11
Técnica de sementeira por gota .......................................................................................................................................11
Sementeira por picada em profundidade ........................................................................................................................11
Sementeira em rampa ......................................................................................................................................................12
Sementeira em anaerobiose ............................................................................................................................................12
Colorações ......................................................................................................................................................... 13
Coloração de Gram...........................................................................................................................................................13
Coloração de Ziehl-Neelsen ..............................................................................................................................................15
Produtos Biológicos ........................................................................................................................................... 16
Urina .................................................................................................................................................................................16
Fezes.................................................................................................................................................................................17
Pesquisa de Clostridium difficile ..................................................................................................................................19
Exame parasitológico ...................................................................................................................................................20
Hemocultura ....................................................................................................................................................................20
Ponta de catéter ...............................................................................................................................................................22
Exsudados (zaragatoas) ....................................................................................................................................................22
Exsudados da orofaringe ..................................................................................................................................................23
Exsudados nasais ..............................................................................................................................................................23
Exsudados e líquidos biológicos .......................................................................................................................................23
LCR....................................................................................................................................................................................23
Expetoração/secreções brônquicas/ lavado alveolar/lavado brônquico .........................................................................24
ii
Relatório de estágio – Microbiologia
Fragmentos de tecido.......................................................................................................................................................25
BACTERIOLOGIA – LEITURA DE PLACAS, CONTINUAÇÕES, IDENTIFICAÇÕES, ANTIBIOGRAMAS E VALIDAÇÃO ... 25

LEITURA DE PLACAS .................................................................................................................................................... 26
Leitura das placas em meio de cultura CLED ..................................................................................................... 26
Leitura das placas em meio de cultura Gelose de Chocolate (PVX) .................................................................. 28
Leitura das placas em meio de cultura Gelose de Sangue (COS) ....................................................................... 29
Leitura das placas em meio de cultura MacConkey (MCK) ............................................................................... 31
Leitura das placas em meio de cultura Manitol Salt Agar (MSA2) .................................................................... 32
Leitura das placas em meio de Sabouraud Gentamicin Chloramphenicol (SGC) .............................................. 33
Leitura das placas de “Methicillin-Resistant Strains of Staphylococcus aureus” (MRSA) ................................. 33
Leitura das placas em meio Salmonella-Shigella (SS) ....................................................................................... 33
Leitura das placas em meio ChromID Salmonella (SM2) ................................................................................... 34
IDENTIFICAÇÃO DE MICRORGANISMOS ........................................................................................................................... 34
Prova da catalase .............................................................................................................................................. 35
Prova da coagulase ........................................................................................................................................... 35
Prova da oxidase ............................................................................................................................................... 36
Prova da filamentação ...................................................................................................................................... 37
Pastorex Staph Plus ........................................................................................................................................... 38
Slidex Strepto Plus ............................................................................................................................................. 38
Prova de satelitismo .......................................................................................................................................... 38
Sistema Automático Vitek2 Compact BioMérieux ............................................................................................ 39
Sistema Automático MicroScan® WalkAway®-96 Plus System (Siemens/Beckman Coulter Diagnostics) .......... 41
Sistema Automático MALDI TOF MS microflex (Bruker) ................................................................................... 42
Teste de sensibilidade à novobiocina (figura 40) .............................................................................................. 45
Teste de sensibilidade à optoquina e à solubilidade da bílis (figura 41) ........................................................... 45
Teste de sensibilidade à bacitracina (figura 42) ................................................................................................ 46
Teste da hidrólise da bílis-esculina e da tolerância ao sal (figura 43) ............................................................... 46
Teste da fermentação da lactose ...................................................................................................................... 46
Teste da produção de urease ............................................................................................................................ 47
ANTIBIOGRAMA E FUNGIGRAMA ................................................................................................................................... 47
SEROLOGIA ........................................................................................................................................................ 49
DETEÇÃO DE ANTIGÉNIO FEBRIS POR AGLUTINAÇÃO........................................................................................................... 50
Widal Test ......................................................................................................................................................... 50
Weil-Felix Test ................................................................................................................................................... 50
Wright Test........................................................................................................................................................ 51
DETEÇÃO DE ANTICORPOS ANTI-TREPONEMA PALLIDUM POR HEMAGLUTINAÇÃO INDIRETA (TPHA) .......................................... 51
SERODIAGNÓSTICO DE SÍFILIS POR VENEREAL DISEASE RESEARCH LABORATORY (VDRL) ................................. 52
SERODIAGNÓSTICO DE SÍFILIS POR IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA (FTA-ABS) .................................................................... 53
DETEÇÃO DE ANTICORPOS (IGG E IGM) ANTI-TOXOPLASMA GONDII POR ELFA (VIDAS TOXO)............................................... 53
DETEÇÃO DE ANTICORPOS (IGG E IGM) ANTI-BORRELIA BURGDORFERI POR ELFA (VIDAS LYME) ............................................. 55
MICOBACTÉRIAS ................................................................................................................................................ 56
PRÉ-TRATAMENTO DA AMOSTRA ................................................................................................................................... 56
SEMENTEIRAS ............................................................................................................................................................ 57
Mycobacteria Growth Indicator Tube (MGIT) ................................................................................................... 57
Lowenstein Jensen ............................................................................................................................................. 58
CONTROLO DA QUALIDADE ............................................................................................................................... 60
CONTROLO DA QUALIDADE INTERNO (CQI) .................................................................................................................... 60
CONTROLO DA QUALIDADE EXTERNO ............................................................................................................................. 60
CONCLUSÃO ....................................................................................................................................................... 61
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .......................................................................................................................... 62
iii
Índice de Figuras
Figura 1. Técnica de sementeira por quadrantes ----------------------------------------------------------------11
Figura 2. Técnica de sementeira por picada em profundidade ------------------------------------------------12
Figura 3. Técnica de sementeira em rampa ----------------------------------------------------------------------12
Figura 4. Coloração de Gram --------------------------------------------------------------------------------------13
Figura 5. Parede celular de bactérias Gram+ e Gram- ----------------------------------------------------------14
Figura 6. Cocos Gram+ num esfregaço com coloração de Gram ---------------------------------------------14
Figura 7. Bacilos Gram- num esfregaço com coloração de Gram --------------------------------------------15
Figura 8. Coloração de Ziehl Neelsen ----------------------------------------------------------------------------16
Figura 9. Kit Alere BinaxNOW® Legionella --------------------------------------------------------------------17
Figura 10. Kit Alere BinaxNOW® S. pneumoniae -------------------------------------------------------------17
Figura 11. Kit de deteção de antigénios fecais “Certest Clostridium difficile antigen GDH --------------20
Figura 12. Equipamento Bactec™ 9000MB (Becton Dickinson) ---------------------------------------------21
Figura 13. Colónias características de Escherichia coli no meio CLED ------------------------------------27
Figura 14. Colónias características de Klebsiella spp no meio CLED ---------------------------------------27
Figura 15. Colónias de cocos Gram-positivo no meio CLED -------------------------------------------------28
Figura 16. Colónias características de Pseudomonas aeruginosa no meio CLED --------------------------28
Figura 17. Colónias de cocos no meio Gelose de Chocolate --------------------------------------------------29
iv
Figura 18. Colónias características de Haemophilus influenzae no meio Gelose de Chocolate ----------29
Figura 19. Colónias de cocos no meio Gelose de Sangue ------------------------------------------------------30
Figura 20. Colónias características de Staphylococcus aureus no meio Gelose de Sangue ---------------30
Figura 21. Colónias características de Streptococcus pneumoniae no meio Gelose de Sangue -----------30
Figura 22. Colónias características de Escherichia coli no meio MacConkey ------------------------------31
Figura 23. Colónias características de Klebsiella spp no meio MacConkey ---------------------------------31
Figura 24. Colónias características de Pseudomonas aeruginosa no meio MacConkey -------------------32
Figura 25. Colónias características de Staphylococcus aureus no meio Manitol Salt Agar ---------------32
Figura 26. Colónias características de Candida albicans no meio SGC -------------------------------------33
Figura 27. Colónias características de Staphylococcus aureus resistentes à meticilina no meio MRSA-33
Figura 28. Colónias características de Salmonella spp no meio SS -------------------------------------------34
Figura 29. Colónias características de Salmonella spp no meio ChromID Samonella ---------------------34
Figura 30. Prova da catalase ---------------------------------------------------------------------------------------35
Figura 31. Prova da coagulase em tubo e em lâmina -----------------------------------------------------------36
Figura 32. Prova da oxidase ----------------------------------------------------------------------------------------37
Figura 33. Kit Bichrolatex Albicans Fumouze ------------------------------------------------------------------37
Figura 34. Kit Pastorex Staph-plus -------------------------------------------------------------------------------38
Figura 35. Prova de satelitismo ------------------------------------------------------------------------------------39
Figura 36. VITEK®2 Compact -------------------------------------------------------------------------------------40
v
Figura 37. Cartas de identificação do sistema VITEK®2 -------------------------------------------------------41
Figura 38. Microscan® WalkAway®-96 Plus System -----------------------------------------------------------41
Figura 39. Sistema RENOK® --------------------------------------------------------------------------------------42
Figura 40. Microflex Biotyper MALDI-TOF MS ---------------------------------------------------------------43
Figura 41. Placa metálica para colocação de amostras no microflex MALDI-TOF MS -------------------43
Figura 42. Princípios da tecnologia MALDI-TOF --------------------------------------------------------------44
Figura 43. Teste de sensibilidade à novobiocina ----------------------------------------------------------------45
Figura 44. Teste de sensibilidade à optoquina -------------------------------------------------------------------45
Figura 45. Teste de sensibilidade à bacitracina ------------------------------------------------------------------46
Figura 46. Teste da hidrólise da bile-esculina -------------------------------------------------------------------46
Figura 47. Antibiograma/Fungigrama por método de difusão de disco e por método Etest ---------------48
Figura 48. Teste TPHA ---------------------------------------------------------------------------------------------52
Figura 49. Teste FTA-Abs ------------------------------------------------------------------------------------------53
Figura 50. Toxoplasma gondii -------------------------------------------------------------------------------------54
Figura 51. Borrelia burgdorferi e Ixodes scapularis -----------------------------------------------------------55
Figura 52. BactecTM MGITTM 960 ---------------------------------------------------------------------------------57
Figura 53. Meio de cultura MGIT ---------------------------------------------------------------------------------58
Figura 54. Meio de cultura Lowenstein Jensen ------------------------------------------------------------------58
Figura 55. Colónias características de Mycobacterium tuberculosis no meio Lowenstein Jensen -------59
vi
Figura 56. Mycobacterium tuberculosis visualizado por microscopia de fluorescência -------------------59
Figura 57. UK NEQAS ---------------------------------------------------------------------------------------------60
Índice de Quadros
Quadro 1. Microorganismos álcool ácido resistentes ------------------------------------------------------------4
Quadro 2. Exemplos de coproculturas em meios seletivos e diferenciais requisitadas pelo clínico -------9
Quadro 3. Características morfológicas das colónias observadas na leitura de placas ---------------------12
Quadro 4. Características das colonias nas placas de meio CLED -------------------------------------------19
Quadro 5. Características das colonias nas placas de Gelose de Chocolate (PVX) ------------------------21
Quadro 6. Características das colonias nas placas de Gelose de Sangue (COS) ----------------------------21
Quadro 7. Características das colonias nas placas de MacConkey (MCK) ----------------------------------24
Quadro 8. Cartas de identificação do Vitek2 e respetivas turvações das suspensões ----------------------25
Quadro 9. Limiar e interpretação dos resultados do VIDAS TOXO. IgM -----------------------------------26
Quadro 10. Limiar e interpretação dos resultados do VIDAS TOXO. IgG ----------------------------------27
Quadro 11. Limiar e interpretação dos resultados do VIDAS Lyme. IgM-----------------------------------28
Quadro 12. Limiar e interpretação dos resultados do VIDAS Lyme. IgG ----------------------------------30
vii
Siglas e abreviaturas
BAAR – bacilo álcool ácido resistente

BK – bacilo de Koch
CLED - Cystine Lactose Electrolyte Deficient
CMI - Concentração Mínima Inibitória
COS - Gelose de Sangue
CQE - controlo da qualidade externo
CQI – controlo da qualidade interno
ESBL - Extended Spectrum β-Lactamase
EUCAST - European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing
GDH – glutamato desidrogenase
GN - Gram Negative Broth
IACS – infeções associadas aos cuidados de saúde
LB – lavado brônquico
LBA – lavado broncoalveolar
LCR – líquido cefalorraquidiano
MALDI - “Mass Assisted Laser Desorption/Ionization”
MCK – MacConkey
MH2 - Mueller Hinton 2
MRSA - Methicillin-Resistant Strains of Staphylococcus aureus
MS – espetrometria de massa
MSA2 – Manitol Salt Agar
NAD - nicotinamida adenina nucleótido
PVX - Gelose de Chocolate
SCS - Schaedler 5% Sheep Blood
SGC2 - Sabouraud Gentamicin Chloramphenicol
SM2 - ChromID Salmonella
SNVS - Schaedler Neomycin Vancomycine 5% Sheep Blood
SS - Salmonella-Shigella
TOF – “time of flight”
UFC - unidades formadoras de colónias
viii
Introdução
Serve o presente relatório para descrever, sinteticamente, o trabalho realizado ao longo

do estágio da valência de microbiologia, que faz parte da Unidade Curricular de Educação
Clínica III, e relacioná-lo com os conhecimentos apreendidos.
A Educação Clínica III é uma unidade curricular de regime obrigatório e anual, inserida
no plano de estudos do 4º ano da Licenciatura de Análises Clínicas e Saúde Pública da Escola
Superior de Saúde do Porto (ESS) do Politécnico do Porto (P. Porto).
O estágio proporciona ao aluno, futuro profissional de Análises Clínicas, o contacto
alargado com a prática profissional, permitindo que este aprofunde e integre os conhecimentos
adquiridos ao longo da sua formação académica, no âmbito do exercício profissional,
supervisionado.
O presente estágio curricular em contexto hospitalar foi realizado num período de quatro
semanas, de 5 de dezembro a 29 de dezembro de 2016, no Serviço de Microbiologia do Instituto
Português de Oncologia do Porto (IPO) Francisco Gentil, E.P.E. – Escola Portuguesa de
Oncologia do Porto (EPOP).
O Centro do Porto do Instituto Português de Oncologia (IPO) Francisco Gentil iniciou as
suas atividades em Abril de 1974, distinguindo-se ao longo dos anos pelo peculiar dinamismo e
lugar cimeiro na qualidade com que acolhe e trata os doentes, pela atividade científica de alta
credibilidade que desenvolve e pela qualidade do ensino que realiza na área da oncologia. O
nome desta instituição advém do seu fundador, o professor Francisco Gentil.
O IPOFG, EPE tem como missão primordial a prestação de cuidados de
saúde centrada no doente assim como a prevenção, investigação, formação e ensino no
domínio da Oncologia, garantindo elevados níveis de qualidade, humanismo e
eficiência.
O Serviço de Microbiologia do IPO-Porto é composto por uma equipa multidisciplinar,
empenhada no diagnóstico microbiológico de todos os doentes do IPO-Porto e/ou qualquer
outra Instituição que solicite os seus serviços. Está integrado no Departamento de Diagnóstico
Laboratorial do IPO-Porto e está organizado em setores distintos: bacteriologia;
mycobacterium; micologia; parasitologia; serologia e biologia molecular.
1
Os objetivos desta valência de estágio são os seguintes:

 identificar as normas de seleção de meios de cultura;
 realizar exames bacteriológicos de diversos produtos biológicos;
 fetuar colorações de Gram e Ziehl-Neelsen;
 realizar isolamentos para obtenção de subculturas puras;
 efetuar testes de identificação de microrganismos (catalase, coagulase, oxidase,
identificação serológica, entre outros);
 identificar bactérias aeróbias e anaeróbias, Gram-positivo e negativo, através de sistemas
comerciais e automatizados;
 realizar antibiogramas pelos métodos de difusão de discos e E-test e através de sistemas
automatizados;
 pesquisar antigénios em produtos biológicos, tais como sangue, urina, fezes, entre
outros;
 efetuar exames parasitológicos em fezes;
 efetuar exames parasitológicos em fezes;
 contactar com sistemas automatizados e outros equipamentos e conhecer o princípio do
método e o modo operatório dos mesmos;
 conhecer o controlo de qualidade em Microbiologia.
2
Enquadramento Teórico – Microbiologia Clínica Laboratorial

A microbiologia clínica pode ser definida como a ciência que estuda os microrganismos
(bactérias, fungos, vírus, parasitas) responsáveis por doenças infetocontagiosas. As análises
microbiológicas fazem parte dos chamados meios complementares de diagnóstico, cujas
investigações e conclusões são utilizadas na prática hospitalar como complementaridade a
determinado diagnóstico, confirmando ou rejeitando as suspeitas do clínico.
A importante tarefa do laboratório de microbiologia consiste em analisar os mais
diversos produtos biológicos (urina, fezes, sangue, líquidos biológicos, exsudados, secreções e
lavados brônquicos, entre outros), utilizando as metodologias adequadas a cada situação, tais
como: cultura, identificação e antibiograma dos microrganismos, testes serológicos e pesquisa
de micobactérias.
Os resultados dos testes microbiológicos podem ser determinantes para a conclusão de
um diagnóstico correto ou para uma decisão clínica, em relação a determinada terapêutica.
Assim, um bom laboratório de microbiologia em contexto hospitalar deve sempre procurar uma
melhoria contínua e empenhar-se em programas de controlo de qualidade, os quais permitem
detetar erros e avaliar o desempenho do trabalho analítico aí realizado, com o objetivo de
manter a sua credibilidade e ser reconhecido por outras instituições, tanto nacionais como
internacionais.
O grande objetivo de todo o trabalho realizado no laboratório de microbiologia clínica é
pesquisar e tentar encontrar o agente responsável por determinada infeção, com o intuito de
fornecer informação de elevada qualidade e utilidade clínica, relativamente ao estado do doente,
auxiliando o médico no diagnóstico, no prognóstico e na escolha do melhor tratamento.
Microbiologia Clínica Laboratorial no IPO Porto

O serviço de Microbiologia do IPO Porto está integrado no Departamento de
Diagnóstico Laboratorial e está organizado em setores distintos(1):
 Laboratório de Bacteriologia;
 Laboratório de Mycobacterium;
 Laboratório de Micologia;
 Laboratório de Parasitologia;
 Laboratório de Serologia.
Dentro do edifício do IPO Porto, encontra-se localizado no edifício dos laboratórios,
piso 4, ala norte. Todo o trabalho aqui desenvolvido flui através de um sentido lógico desde a
3
receção de amostras até à validação dos resultados e o seu envio para os clínicos de serviço do
IPO, ou entidades externas. O espaço reservado ao diagnóstico laboratorial e investigação em
microbiologia clínica do IPO Porto está assim dividido em várias salas:
 Sala de receção de produtos e sementeiras;
 Sala das continuações e identificações;
 Laboratório de BK (Bacilo de Koch);
 Laboratório de serologia;
 Laboratório de micologia;
 Sala de colorações e lavagem de material;
 Gabinete de investigação (Biologia Molecular).
Nesta área, todos os dias se realizam diferentes testes microbiológicos, tais como:
 exames micobacteriológicos de urina, exsudados de orofaringe, exsudados
nasais, ponta de cateter, pus, fezes, LCR, lavado broncoalveolar (LBA), lavado
brônquico (LB) e líquidos;
 pesquisa de antigénios de Legionella pneumophila na urina e LBA;
 pesquisa de antigénios de Streptococcus pneumoniae na urina;
 pesquisa de antigénio de Clostridium difficile nas fezes e suas toxinas A e B;
 pesquisa de Pneumocystis jirovecci em LB e LBA e
 antibiogramas;
 deteção de antigénios febris;
 deteção de anticorpos anti-Treponema pallidum;
 deteção manual da sífilis;
 deteção de imunoglobulinas IgG e IgM anti-toxoplasmáticas;
 deteção de imunoglobulinas IgG e IgM anti-Borrelia burgdorferi;
 pesquisa de Bacilo de Koch (BK).
Receção e processamento de amostras

Todos os produtos biológicos provenientes dos vários serviços hospitalares do IPO
(colheitas, internamentos, SANP, cirurgias, etc), são entregues na sala de receção de amostras,
através de um sistema de vácuo ou por auxiliares de ação médica. Estes produtos, neste caso,
são amostras de doentes oncológicos e vêm obrigatoriamente identificados com uma etiqueta, a
qual contêm as seguintes informações: código de barras, número de processo, nome do doente e
o número de registo da amostra. Estas informações são de extrema importância para se efetuar o
registo de entrada da amostra no programa informático hospitalar e-DeiaLab.
4
A primeira tarefa do técnico de laboratório, após a amostra ser entregue, é confirmar os

dados da identificação da amostra com a informação inscrita na requisição, para confirmar que a
amostra rececionada corresponde ao doente e ao pedido presentes na requisição, e se a mesma
se encontra conforme as condições exigidas: volume suficiente, transporte e acondicionamento
correto, ausência de vazamento de produto. De seguida, valida-se a receção informaticamente,
através do código de barras existente na etiqueta, e, dependendo do tipo de produto biológico, a
amostra é processada e analisada (todas as requisições, lâminas para colorações e meios de
cultura utilizados têm de ser identificados com uma etiqueta igual à da amostra, pelo que se
devem imprimir tantas etiquetas quanto for necessário).
Os produtos biológicos aqui rececionados, são preparados para a sua posterior análise,
por exames diretos (ex: coloração de Gram, coloração de Ziehl-Neelsen) e/ou através de
culturas em meios apropriados (sementeiras). Estas últimas permitem, posteriormente,
identificar os microrganismos presentes (essencialmente, bactérias e fungos), pelo tipo de
colónias existentes nos meios de cultura e pela reação às provas de identificação, bem como
determinar a sua sensibilidade ou resistência aos antimicrobianos.
Meios de cultura
Os meios de cultura são preparações químicas que contêm substâncias capazes de
promover o crescimento microbiano, principalmente de bactérias e fungos(2). Quando se
realizam culturas “in vitro” dos microrganismos, é possível efetuar o seu isolamento e a sua
caracterização morfológica, fisiológica, bioquímica e/ou genética(3). No entanto, para que os
microrganismos cresçam, os meios de cultura têm de apresentar determinadas condições
ambientais favoráveis, isto é, devem-lhes fornecer nutrientes [fontes de carbono, azoto, fósforo,
carbohidratos (glicose/lactose), vitaminas, aminoácidos, entre outros], e condições de pH,
temperatura, humidade e atmosfera adequadas, tendo em conta que o crescimento microbiano
depende das suas exigências nutricionais, variando de acordo com a constituição dos meios.
Para além dos nutrientes requeridos às exigências dos microrganismos, os meios de
cultura devem ser estéreis, ou seja, não devem conter quaisquer organismos vivos(4).
É também importante ter em conta, que é necessário ter precauções durante o seu
manuseamento a fim de evitar possíveis contaminações. Para isso utilizam-se técnicas de
assepsia, com vista a prevenir as possíveis contaminações durante a manipulação de culturas e
meios de cultura estéreis(5).
5
Classificação dos meios de cultura

Os meios de cultura podem ser classificados como líquidos (caldos),
semissólidos ou sólidos, quanto ao estado físico, e como simples, diferenciais, seletivos ou
enriquecidos, quanto à sua composição química e função.
Os meios líquidos são utilizados para enriquecer determinadas estirpes e não apresentam
qualquer agente solidificante.
Os meios sólidos, contêm a substância solidificante agar, que é um complexo
polissacarídeo composto por galactose e ácido galacturónico(6). O agar não é degradado pelos
microorganismos, tornando-o de grande utilidade em microbiologia. Estes meios são
normalmente utilizados no laboratório de microbiologia clínica com o objetivo de se obter
culturas puras e representativas da situação em que se encontra o doente.
Os meios semissólidos têm uma consistência intermédia e são úteis para estudar a
mobilidade e o crescimento dos microrganismos em ambientes de diferentes concentrações de
oxigénio.
Os meios diferenciais contêm um ingrediente especial que se modifica com o
metabolismo do microorganismo que se pretende estudar permitindo desta forma distingui-lo
entre uma população diversa. Um exemplo de um meio diferencial é o meio de CLED.
Os meios seletivos contêm ingredientes (agentes seletivos) que permitem o crescimento
de um tipo de microorganismos em detrimento de outros cujo crescimento é inibido. O
MacConkey é um exemplo de um meio seletivo.
Os meios enriquecidos estimulam o crescimento de microrganismos exigentes e
fastidiosos. A Gelose de Sangue é um exemplo de meio enriquecido.
Os meios de cultura utilizados no laboratório de microbiologia do IPO são os seguintes:
 CLED - Cystine Lactose Electrolyte Deficient
 PVX - Gelose de Chocolate
 COS - Gelose de Sangue
 MCK – MacConkey
 MSA2 – Manitol Salt Agar
 SGC2 - Sabouraud Gentamicin Chloramphenicol
 MRSA - Methicillin-Resistant Strains of Staphylococcus aureus
 SS - Salmonella-Shigella
 SM2 - ChromID Salmonella
 SCS - Schaedler 5% Sheep Blood
 SNVS - Schaedler Neomycin Vancomycine 5% Sheep Blood
6
 GN - Gram Negative Broth

 Todd Hewitt Broth
 MH2 - Mueller Hinton 2
CLED - Cystine Lactose Electrolyte Deficient
Meio de cultura sólido e diferencial para fermentação da lactose, em que as bactérias

fermentadoras surgem em colónias amarelas (ex.: Escherichia coli) e as não fermentadoras em
colónias translúcidas (ex.: Proteus vulgaris). Deteta se a lactose é metabolizada, pela presença
de um indicador (azul de bromotimol). Usado para cocos Gram + e bacilos Gram - . É capaz de
inibir o swarming de Proteus spp, porque é deficiente em eletrólitos, contudo não inibe o seu
crescimento. Permite o isolamento e a quantificação (UFC/mL = unidades formadoras de
colónias por mL) de microrganismos em amostras de urina.
PVX - Gelose de Chocolate
A Gelose de Chocolate é um meio de cultura enriquecido indicado para o crescimento de

estirpes exigentes, pertencentes aos géneros Neisseria, Haemophilus e Streptococcus (S.
pneumoniae). Este meio é composto por uma base nutritiva enriquecida em factores X (hemina)
e V (NAD), introduzidos pela hemiglobina e PolyViteX respectivamente. Estes fatores resultam
do aquecimento prévio, a uma temperatura de ± 80ºC, de 10% de sangue de animal estéril,
adicionado ao meio, o qual provoca hemólise dos eritrócitos e, consequentemente, liberta os
fatores presentes no seu interior. Este meio deve ser incubado a 37ºC, numa estufa com 5 a 10%
de dióxido de carbono, permitindo o crescimento de microorganismos que utilizam CO2 como
única fonte de carbono(6)(7).
COS - Gelose de Sangue
Meio de cultura sólido e enriquecido que permite o crescimento de alguns

microorganismos exigentes e fastidiosos (ex.: Streptococcus spp) e a visualização de padrões
hemolíticos (α, β e γ), pelo facto de conter 5 a 10% de sangue de animal estéril (eritrócitos
intactos) e o fator X (hemina) exposto. Este meio deve ser incubado a 37ºC, numa estufa com 5
a 10% de dióxido de carbono, permitindo o crescimento de microrganismos que utilizam CO2
como única fonte de carbono(8)(6).
MCK – MacConkey
A gelose MacConkey é um meio seletivo e diferencial para a pesquisa de bactérias da

família Enterobactereaceae a partir de produtos biológicos. Este meio permite evidenciar a
7
fermentação da lactose pela viragem do indicador vermelho neutro, correspondendo a esta

viragem a formação de colónias cor-de-rosa ou vermelhas (por vezes contornadas por um halo
de sais biliares) pelos microorganismos fermentativos. Os microorganismos que não fermentam
a lactose originam colónias incolores ou de cor ligeiramente bege. A seletividade em relação às
bactérias Gram+ é conferida pelos sais biliares e o cristal violeta (inibidor do crescimento de
microrganismos Gram+). A Gelose MacConkey é incubada a 37ºC numa atmosfera de
aerobiose(6)(8).
MSA2 – Manitol Salt Agar

Meio de cultura sólido, seletivo para Staphylococcus spp, devido à elevada concentração
de cloreto de sódio, e diferencial para a fermentação do manitol, em que as bactérias
fermentadoras surgem em colónias amarelas (Staphylococcus aureus) e as não fermentadoras
em colónias translúcidas (ex.: Staphylococcus epidermidis)(6)(8).
SGC2 - Sabouraud Gentamicin Chloramphenicol
É um meio seletivo utilizado na cultura de leveduras e fungos filamentosos a partir de

amostras biológicas. A presença de peptonas e glucose favorece o desenvolvimento de
diferentes estirpes fúngicas, como é o exemplo da levedura Candida albicans. A presença do
antibiótico gentamicina permite inibir a maioria das bactérias Gram- e Gram+. O cloranfenicol
melhora a seletividade em relação a algumas espécies por vezes resistentes à gentamicina, como
estreptococos, Proteus, entre outros(6)(9).
MRSA - Methicillin-Resistant Strains of Staphylococcus aureus
Meio sólido, seletivo e cromogéneo que permite detetar Staphylococcus aureus

resistentes à meticilina (sabe-se que está na origem de um número elevado de infeções
nosocomiais), devido à presença de colónias rosa/roxas(6)(10)(11).
SS - Salmonella-Shigella
Meio sólido, seletivo para Salmonella spp e Shigella spp, devido à presença de sais
biliares, citrato de sódio e verde brilhante (inibidores do crescimento de microrganismos
Gram+), e diferencial para a fermentação da lactose, em que as bactérias fermentadoras surgem
em colónias rosa e as não fermentadoras em colónias incolores. Este meio também é diferencial
para a produção de sulfureto de hidrogénio (H2S), sendo que as bactérias produtoras surgem em
colónias com centro negro, devido à presença de tiossulfato de sódio e citrato férrico(6)(12).
8
SM2 - ChromID Salmonella

Meio sólido, seletivo e cromogéneo que permite detetar Salmonella spp, devido à
presença de colónias roxas(6)(8).
SCS - Schaedler 5% Sheep Blood

microrganismos exigentes e fastidiosos, pelo facto de conter 5% de sangue de animal estéril. O
qual é utilizado para o isolamento de microrganismos anaeróbios estritos e facultativos, devido
à presença de L-cistina e dextrose(6).
SNVS - Schaedler Neomycin Vancomycine 5% Sheep Blood

microorganismos exigentes e fastidiosos, pelo facto de conter 5% de sangue de animal estéril.
Utilizado para o isolamento de microrganismos anaeróbios estritos e facultativos, devido à
presença de neomicina e vancomicina(6).
GN - Gram Negative Broth
Meio líquido e de enriquecimento para microrganismos entéricos Gram-, principalmente

Salmonella spp e Shigella spp, pelo facto de conter peptona, manitol, citrato de sódio e
desoxicolato de sódio (inibidores do crescimento de microrganismos Gram+)(6).
Todd Hewitt Broth
O Caldo Todd Hewitt é um meio líquido seletivo e de enriquecimento para

Streptococcus β-hemolíticos do grupo A, pelo facto de conter peptona, vitaminas e dextrose
(estimulador da produção de hemolisina). A seletividade deste caldo é garantida graças à adição
de gentamicina e ácido nalidíxico(6)(4).
MH2 - Mueller Hinton 2
Meio não selectivo destinado à realização de antibiogramas por difusão de discos

(método de Kirby-Bauer) ou Etest. A sua composição química permite o crescimento das
bactérias pouco exigentes, nomeadamente: enterobactérias, bacilos Gram- não fermentadores,
estafilococos e enterococos. Também é utilizado para a prova de satelitismo de Haemophilus
spp(6)(8).
9
Sementeiras
As sementeiras são técnicas de inoculação de microorganismos em meios de cultura, que

variam consoante o tipo de produto biológico. Assim como os esfregaços, devem ser realizadas
em ambiente de assepsia, preferencialmente em câmara de fluxo laminar, de forma a eliminar o
risco de contaminação por aerossóis(13). A obtenção de colónias puras é essencial para
determinar o microrganismo em estudo, sendo que na presença de culturas mistas é necessário
realizar repicagens com vista à obtenção de colónias isoladas exclusivas de uma estirpe
bacteriana, para que se obtenha um resultado conclusivo e válido(14).
Existem várias técnicas de sementeira que variam de acordo com o produto a analisar e
com o tipo de análise a efetuar:
 Técnica de sementeira por estria central
 Técnica de sementeira por quadrantes
 Técnica de sementeira por 3 planos
 Técnica de sementeira por rolamento
 Técnica de sementeira por gota
 Sementeira por picada em profundidade
 Sementeira em rampa.
Técnica de sementeira por estria central
É traçada uma estria central a dividir a placa ao meio e posteriormente, espalha-se esse
inóculo por estrias perpendiculares à central ao longo de toda a placa. Esta técnica tem como
finalidade a avaliação quantitativa de colónias, para se ter uma noção da carga microbiana
presente, avaliando-a como significativa ou não(4)(13).
Técnica de sementeira por quadrantes
Consiste em espalhar o inóculo a partir da parte superior da placa até meio e, rodando a
placa, esgota-se o inóculo, arrastando algumas estrias do quadrante anterior, até obter 3 a 4
quadrantes. Com esta técnica, é possível obter-se colónias isoladas(13)(figura 1).
10
Figura 1 Técnica de sementeira por quadrantes(13).

Técnica de sementeira por 3 planos
É a técnica ideal para a realização de antibiogramas manuais. Este método consiste em

espalhar o inóculo desde a parte superior da placa até ao fim, de modo a preencher toda a
superfície da placa. Este processo é efetuado três vezes, em três direções diferentes.
Técnica de sementeira por rolamento
É utilizada para semear pontas de catéter. Com a ajuda de uma ansa, rola-se a ponta de
catéter cuidadosamente sobre toda a superfície do meio.
Técnica de sementeira por gota

Nesta técnica coloca-se três gotas equidistantes sobre o meio. Deste modo, obtém-se um
maior volume de amostra inoculado e maior concentração de microrganismos. É utilizada para
semear líquido cefalorraquidiano (LCR)(13)(10).
Sementeira por picada em profundidade
Com uma ansa estéril de 1µL recolhe-se o produto a semear e introduz-se, em posição
vertical, no centro do meio de cultura. Remove-se a ansa no mesmo trajeto(15)(figura 2).
11
Figura 2 Técnica de sementeira por picada em profundidade(15).

Sementeira em rampa
Com uma ansa estéril de 1µL recolhe-se o produto e semeia-se em zig zag arrastando a
ansa sobre a rampa do meio de cultura (slant) conforme ilustrado na figura 3(15).
Figura 3 Técnica de sementeira em rampa(15).
Sementeira em anaerobiose
A sementeira em anaerobiose é uma técnica que pode ser executada em qualquer

produto biológico, mas que apresenta maior interesse em alguns, como as hemoculturas.
Semeia-se o produto em duas placas de meio SCS e em duas placas de meio SNVS, sendo que
uma placa de cada meio é colocada num saco, juntamente com o gerador de anaerobiose
AnaeroGen compact, e são incubadas a 37ºC, tal como qualquer outro meio (exceto as geloses
de sangue e chocolate). As outras duas placas são incubadas numa estufa de CO2. Esta diferença
atmosférica permite verificar se os microrganismos são anaeróbios estritos ou facultativos.
12
Colorações
As colorações são técnicas laboratoriais que permitem uma primeira diferenciação dos
microrganismos presentes nos produtos biológicos, através da observação em microcopia de
certos aspetos morfológicos, tais como o seu tamanho, forma, estrutura e a capacidade de
reterem ou não determinados corantes(2)(15). Neste sentido, existem dois tipos de colorações
diferenciais capazes de fornecer informação preliminar sobre os microrganismos:
 coloração de Gram
 coloração de Ziehl-Neelsen
No laboratório de microbiologia do IPO Porto, as colorações são realizadas com recurso ao
equipamento caso, são efetuadas no equipamento Mirastainer® da companhia Merck.
Coloração de Gram
Coloração diferencial que permite distinguir os dois tipos principais de bactérias, cocos
e bacilos, quanto à capacidade de retenção de corantes(16). O seu princípio consiste em efetuar
um esfregaço sobre uma lâmina e fixá-lo pelo calor, à chama de um bico de Bunsen, para,
posteriormente, ser corado com violeta de cristal, seguido de um mordente, o lugol, capaz de
aumentar a afinidade celular para o corante básico; o excesso de corante é removido com
álcool-acetona, e finalmente cora-se o esfregaço uma segunda vez, agora com outro corante
(contra-corante), a safranina(12)(4)(17)(15)(figura 4).
Figura 4 Coloração de Gram(18).

A coloração de Gram baseia-se em algumas diferenças estruturais existentes entre a
parede celular de uma bactéria Gram- e de uma Gram+. A principal delas é que a parede celular
13
de uma bactéria Gram+, embora mais espessa, é quimicamente mais simples, ou seja, apresenta
predominantemente um único tipo de macromolécula (90% peptidoglicano)(9) (figura 5).
Figura 5 Parede celular de bactérias Gram+ e Gram-(18).
Já a parede celular de uma bactéria Gram- é mais complexa. É formada por uma ou poucas
camadas de peptidoglicano e por uma membrana externa, separadas entre si por um espaço
periplasmático, contendo uma série de enzimas e proteínas(9).
Assim sendo, enquanto as bactérias Gram+ coram de púrpura/roxo (figura 6), visto que
o corante violeta de cristal fica retido pela camada espessa de peptidoglicano existente na
parede celular. As bactérias Gram- coram de vermelho/rosa (figura 7), tendo em conta que
possuem uma camada fina de peptidoglicano, e que esta é incapaz de reter o corante
primário(13)(9).
Figura 6 Cocos Gram+ num esfregaço com coloração de Gram(16).
14
Figura 7 Bacilos Gram- num esfregaço com coloração de Gram(19).
Coloração de Ziehl-Neelsen
Coloração diferencial que permite identificar bactérias álcool-ácido resistentes,
principalmente micobactérias, ou seja, microrganismos com paredes celulares constituídas por
ácidos micólicos.(20) Depois de corados a quente com fucsina, estes microorganismos (Quadro
1) resistem à descoloração por álcool-ácido. A importância do uso quotidiano desta coloração
está muito associada ao diagnóstico de tuberculose, doença infeciosa provocada pelo bacilo
álcool-ácido resistente (BAAR) Mycobacterium tuberculosis(8)(15). Assim sendo, quando
observamos uma preparação ao microscópio, enquanto as bactérias álcool-ácido resistentes
coram de vermelho/rosa, as não resistentes coram de azul, devido à posterior coloração do
esfregaço com azul-de-metileno (figura 8).
Quadro 1 Microorganismos álcool ácido resistentes(21).
Lista de microorganismos álcool ácido resistentes

Mycobacterium spp Álcool ácido resistente
Cistos de Cryptosporidium Álcool ácido resistente
Cyst of Isospora Álcool ácido resistente
Nocardia spp Parcialmente resistente
Rhodococcus spp Parcialmente resistente
Legionella micdadei Parcialmente resistente
em fragmentos de tecido
15
Figura 8 Coloração de Ziehl Neelsen.

Os bacilos álcool ácido resistentes podem ser visualizados a vermelho (21).
Produtos Biológicos
Urina
O exame bacteriológico de urina é, normalmente, requisitado quando o clínico suspeita

de infeção do trato urinário. A origem deste tipo de infeção poderá estar em microrganismos
existentes na comunidade, nomeadamente Escherichia coli, Klebsiella spp, Enterococcus
faecali, Staphylococcus saprophyticus e Proteus spp, ou em ambiente hospitalar, tais como
Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus epidermidis, entre outros(17). A pesquisa e
identificação de microorganismos na cultura de urina é muito importante no diagnóstico deste
tipo de infeção, uma vez que permite determinar se é ou não significativa, através da contagem
do número de colónias e da presença ou ausência de mais do que dois tipos de colónias
diferentes. A urocultura é efetuada em meio CLED. As colónias das bactérias fermentadoras da
lactose são distinguíveis das não fermentadoras, pela técnica de sementeira por esgotamento
total em superfície, com ansa de 1µL. No entanto, se a urina tiver sido colhida através de uma
nefrostomia, semeia-se a mesma em meio CLED e Gelose de Sangue, com o objetivo de se
poder aumentar a probabilidade de encontrar os microrganismos causadores do estado infecioso
do doente.
Por vezes o clínico requisita outro tipo de análises a efetuar na urina. Para o auxiliar nos
diagnósticos de legionelose e pneumonia ou meningite pneumocócica, o médico assistente pode
requer ao laboratório pesquisas de antigénios de Legionella pneumophila e Streptococcus
pneumoniae.
Estas pesquisas são feitas com recurso a ensaios imunocromatográficos de membrana
capazes de detetar esses antigénios solúveis na urina. O princípio de funcionamento dos kits de
diagnóstico para pesquisa desses antigénios baseia-se na presença de anticorpos anti-Legionella
16
pneumophila e anti-Streptococcus pneumoniae adsorvidos à membrana de nitrocelulose, na

zona de teste, e anticorpos de controlo, na zona de controlo. Se a amostra contiver os antigénios
que se está a pesquisar, então eles vão reagir com os anticorpos do reagente, e para que se detete
a reação é necessário existir um segundo anticorpo “anti-espécie”, conjugado com ouro
coloidal, revelador da ligação antigénio-anticorpo. O resultado pode ser visualizado através do
aparecimento de uma linha com coloração rosa/violeta (figuras 9 e 10).
Figura 9 Resultado positivo de uma amostra de urina.

Kit Alere BinaxNOW® Legionella(22).
Figura 10 Resultado positivo de uma amostra de urina.

Alere BinaxNOW® S. pneumoniae(23).
Fezes
As fezes são formadas no intestino grosso, e a sua consistência varia desde líquida a
sólida. O exame bacteriológico é realizado sempre que há suspeita clínica de infeção bacteriana
do trato gastrointestinal(17). Os agentes etiológicos que é mais comum aparecerem em amostras
de fezes são:
 Escherichia coli
 Campylobacter
 Vibrio colerae
17
 Shigella spp
 Salmonella spp
 Yersínia enterolítica
 Helicobacter pilory
 Clostridium perfringens.
A cultura de fezes (coprocultura) tem como objetivo isolar (de entre a flora
polimicrobiana existente) o microrganismo causador da infeção. Deve ser efetuada nos meios
SS, SM2, MCK, MSA2 e SGC2, por esta ordem. As técnicas de sementeira por estrias paralelas
em superfície (quadrantes), realizadas nesses meios, devem ter como ponto de partida uma
inoculação prévia em meio GN Broth. Neste último, com a ajuda de uma ansa ou pipeta de
Pasteur esterilizada, consoante o tipo de consistência das fezes, é feita uma suspensão com uma
pequena porção da amostra, posteriormente inoculada em cada meio de cultura.
Os meios enriquecidos, como as Geloses de Sangue e de Chocolate, não são utilizados
para a cultura de fezes, por se tratar de um produto polimicrobiano. O isolamento do
microorganismo em causa tornar-se-ia muito difícil ou mesmo impossível de se conseguir obter.
No entanto, caso seja pedido pelo médico requisitante, a amostra poderá ser semeada em meios
seletivos e diferenciais para determinados microrganismos, tais como (quadro 2):
 Escherichia coli Ø157:H7
 Yersinia enterocolitica
 Campylobacter spp
 Vibrio cholerae
Quadro 2 Exemplos de coproculturas em meios seletivos e diferenciais requisitadas pelo clínico (24)(25)(2)(17).
Microorganismo Meio de cultura Função

Escherichia coli MacConkey com Sorbitol A presença de sorbitol, sais biliares e
Ø157:H7 telurito permite identificar esta
bactéria, visto que a mesma não é
fermentadora do sorbitol, produzindo
colónias incolores com centro
acastanhado (as restantes E. coli,
fermentadoras do sorbitol, surgem
em colónias rosa/vermelhas).
Yersinia enterocolitica Yersinia Selective Agar ou

Cefsulodin Irgasan A presença de manitol, violeta de
Novobiocin (CIN) cristal, entre outros, permite
identificar esta bactéria, uma vez que
18
a mesma é produtora de colónias

características, tipo “olho-de-boi”,
com centro vermelho e bordo
transparente.
Campylobacter spp Campylosel A presença de sangue de animal
estéril e antibióticos/antifúngicos
permite identificar esta bactéria, uma
vez que a mesma é produtora de
colónias pequenas, convexas e
acinzentadas.
Vibrio cholerae Thiosulfate Citrate Bile A presença de sacarose no meio de
Sucrose (TCBS) cultura permite identificar esta
bactéria, visto que ela fermenta este
carbohidrato e cresce em colónias
amarelas (as restantes Vibrio, não
fermentadores da sacarose, surgem
em colónias verdes).
Pesquisa de Clostridium difficile

O Clostridium difficile é um microrganismo Gram +, anaeróbio estrito, abundante no
solo e águas imóveis. O C. difficile produz a enzima Glutamato Desidrogenase (GDH) e esse
fato foi aproveitado o desenvolvimento de testes imunocromatográficos de deteção desses
microoganismos em amostras de fezes. Aquando do pedido para pesquisa de Clostridium, é
realizada a pesquisa do seu antigénio e caso o resultado seja positivo, pesquisa-se a presença de
toxinas. A pesquisa dos antigénios fecais de Clostridium é efetuada com recurso ao kit “Certest
Clostridium difficile antigen GDH”(26). O card utilizado neste kit é constituído por uma
membrana de nitrocelulose sensibilizada com anticorpos monoclonais anti-GDH na linha de
teste (T) e na linha de controlo (C).
A execução deste teste é fácil e rápida e encontra-se esquematizada na seguinte figura 11.
Realiza-se uma suspensão de uma pequena porção de fezes num tubo que contém solução
diluidora e adiciona-se 4 gotas da suspensão no card 15 minutos depois observa-se o resultado.
Obtém-se um resultado positivo quando o complexo conjugado com o antigénio é capturado
pelos anticorpos anti-GDH presentes na membrana, observando-se assim as duas linhas (T e C),
indicando a existência de infeção por C. difficile no paciente. Quando o resultado da pesquisa é
positivo, procede-se posteriormente à pesquisa das toxinas A e B do C. difficile com recurso a
técnicas de Biologia Molecular.
19
Figura 11 Esquema reprsentativo da urilização do kit de deteção

de antigénios fecais “Certest Clostridium difficile antigen GDH”(26).
Exame parasitológico
O exame parasitológico das fezes é realizado numa situação de suspeita clínica da presença de
parasitas. O kit utilizado permite a análise de fezes humanas num ambiente
fechado. Contém formalina para fixar os parasitas e Triton X, que consiste num
detergente que rompe as membranas celulares. Estes dois reagentes, em conjunto,
estabilizam os parasitas e separam-nos dos restos alimentares utilizando um sistema
de filtração.
Hemocultura
O exame bacteriológico do sangue é, normalmente, requisitado quando o clínico

suspeita de uma infeção provocada por microrganismos na circulação sanguínea, tais como
doenças relacionadas com bacteriemia e septicemia (ex.: febre tifoide, brucelose, pneumonia,
meningite, endocardite). A origem deste tipo de infeção encontra-se mormente associada a
determinados microrganismos, tais como Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae,
Enterococcus spp, Candida spp, e Enterobacteriaceae, os quais apresentam significado clínico
relevante, ou a microoganismos considerados agentes contaminantes (relacionados com uma
desinfeção inadequada do local de punção, no momento de colheita), tais como: Staphylococcus
20
spp coagulase negativa, Streptococcus viridans, Micrococcus spp e Corynebacterium

spp(17)(7)(3).
A hemocultura, após a colheita, e da receção da amostra, é colocada com posterior
incubação a 37ºC, durante cinco dias, no equipamento Bactec™ 9000MB (Becton Dickinson)
(figura 12).
Figura 12 Equipamento Bactec™ 9000MB (Becton Dickinson)(27).
O volume colhido para os frascos de hemocultura é diferente consoante o tipo de paciente. isto
No caso de se tratar de um adulto, deve-se colher entre 8 a 10mL de sangue (garrafas azuis ou
rosa), enquanto se for uma criança ou um adulto em que não se possa colher um volume normal,
a colheita deverá conter entre 1 a 3mL de sangue (garrafas cinzentas). As garrafas azuis
correspondem à cultura de microrganismos aeróbios e as garrafas cor de rosa à cultura de
microrganismos anaeróbios.
Quando a hemocultura positiva durante o período de incubação, imprime-se um gráfico
que demonstra o tempo que a hemocultura demorou a positivar. Retira-se a garrafa do
equipamento, e efetua-se um isolamento da amostra para os meios Gelose de Sangue e MCK,
em caso de aerobiose, e/ou SCS e SNVS, em caso de anaerobiose. Esta
passagem da amostra para os meios de cultura é feita pela técnica de sementeira por estrias
paralelas em superfície (quadrantes). O topo da garrafa deve ser previamente desinfetado com
álcool a 70%, para minimizar risco de contaminações, e depois insere-se uma agulha estéril para
inocular uma gota de sangue nos respetivos meios e numa lâmina, efetuando-se também um
esfregaço para coloração de Gram e posterior visualização ao microscópio. Num par de
hemoculturas, quando apenas uma se torna positiva, é provável que se trate de uma
contaminação e não de uma infeção provocada por microrganismos em circulação. Estes e
outros casos são sempre avaliados pelo médico patologista do serviço de microbiologia
laboratorial.
21
Ponta de catéter
O exame bacteriológico de ponta de cateter é, normalmente, requisitado quando o

clínico suspeita de infeção com ponto de partida no mesmo, principalmente em doentes
internados com terapêutica intravenosa e que apresentem síndrome febril indeterminado
associado a bacteriemia. Depois de rececionadas as ponta de catéter são semeadas no meio de
cultura Gelose de Sangue, pela técnica de sementeira por rolamento, em três direções diferentes.
Tal como na amostra de urina, também, neste caso, é importante efetuar uma
contagem do número de colónias existentes, de forma a determinar se se trata ou não de uma
infeção significativa (valor superior ou igual a 15 UFC). Para esclarecimento de dúvidas é usual
efetuar-se também uma hemocultura, em conjunto com a cultura de ponta de cateter. A análise
do gráfico do tempo em que a hemocultura demora a positivar, permite concluir se a infeção
tem ou não origem no cateter. Quando a hemocultura positiva antes de existir crescimento na
Gelose de Sangue, onde foi semeada a ponta de cateter, isso significa que a infeção não teve
origem na ponta de catéter.
Exsudados (zaragatoas)
O exame bacteriológico de exsudados (zaragatoas) é, normalmente, requisitado quando

o clínico suspeita de infeção local, por exemplo, devido à existência de uma ferida aberta ou que
não cicatrizada. A origem deste tipo de infeção pode estar associada a bactérias ou fungos(7)(17).
As amostras recolhidas por zaragatoa podem ser de diversos tipos, como por exemplo:
 exsudado de orofaringe
 exsudado vaginal e uretra
 pus de ouvido
 pus de ferida
 outros.
Os agentes bacterianos encontrados nestas infeções variam consoante o local, sendo assim
necessário efetuar a cultura em meios enriquecidos (gelose de sangue e de chocolate) e também
em meios seletivos para auxiliar presuntivamente o diagnóstico, tais como o MCK, o MSA2 e o
SGC2. A sementeira deve é efetuada nos meios Gelose de Chocolate, Gelose
de Sangue, MCK, MSA2 e SGC2, por esta ordem (do meio menos seletivo para o mais seletivo)
Em alguns exsudados, dependendo da amostra, são também realizados esfregaços para
coloração Gram ou Ziehl-Nelseen. No caso de exsudados cervicais, inguinais ou mamários, é
22
efetuado um esfregaço para coloração de Ziehl-Neelsen, enquanto para exsudados vaginais ou

uretrais é realizado um esfregaço para coloração de Gram.
Exsudados da orofaringe
Nos exsudados de orofaringe, a amostra é também inoculada em caldo Todd Hewitt,

para crescimento de Streptoccoccus β-Hemolíticos. Estes são responsáveis por inúmeras
infeções do trato respiratório. A cultura de exsudado da orofaringe é efetuada nos meios Gelose
de Chocolate, Gelose de Sangue, MCK, MSA2 e SGC2, por esta ordem. A sementeira ser
realizada tendo como ponto de partida uma inoculação prévia da zaragatoa em meio Todd
Hewitt Broth.
Exsudados nasais
O exame bacteriológico de exsudado nasal (zaragatoa) é, normalmente, efetuado à

entrada e à saída de doentes que ficam internados. Este teste serve de controlo de infeção
provocada por Staphylococcus aureus resistentes à meticilina, microrganismo relacionado com
as Infeções Associadas aos Cuidados de Saúde (IACS). A cultura de exsudado nasal é efetuada
apenas no meio MRSA, pela técnica de sementeira por estrias paralelas em superfície
(quadrantes), sendo que, anteriormente ao esgotamento, toda a superfície da zaragatoa é
inoculada no primeiro quadrante do meio.
Exsudados e líquidos biológicos
Quando existe suspeita de infeção tecidual ou de cavidades serosas no doente, o clínico

solicita exames microbiológicos de exsudados e líquidos biológicos. A cultura de exsudados e
líquidos biológicos é efetuada nos meios Gelose de Chocolate, Gelose de Sangue, MCK, MSA2
e SGC2, por esta ordem, pela técnica de sementeira por estrias paralelas em superfície
(quadrantes). Nestes produtos, também são efetuados dois esfregaços, um para coloração de
Gram e outro para coloração de Ziehl-Neelsen.
LCR
Geralmente as suspeitas clínicas de qualquer infeção ao nível do sistema nervoso central

requer a análise bacteriológica do LCR. A meningite é um dos exemplos mais comuns. Este tipo
de infeção encontra-se normalmente associada à presença de Streptococcus pneumoniae,
Neisseria meningitidis e Haemophilus influenzae. Estes microrganismos podem atingir o
23
sistema nervoso através da corrente sanguínea ou invadi-lo a partir de uma lesão (ex.:
traumatismo crânio-encefálico). Como estes microoganismos são sensíveis às diferenças de
temperatura, a amostra deve ser enviada rapidamente ao laboratório e mantida a uma
temperatura de aproximadamente 37ºC até à sua análise(17)(28)(3). A cultura do LCR é efetuada
nos meios Gelose de Chocolate, Gelose de Sangue e SGC2, por esta ordem, pela técnica de
sementeira por gota, em que três gotas de amostra são dispostas sob forma de triângulo. Os
meios utilizados e o tipo de sementeira facilitam o crescimento de microrganismos fastidiosos e
nutricionalmente exigentes, aumentando a probabilidade de encontrar o microrganismo
responsável pela infeção. Com este produto, também se efetuam dois esfregaços, um para
coloração de Gram e outro para coloração de Ziehl-Neelsen, e a pesquisa de antigénio de
Cryptococcus spp, através de um ensaio imunocromatográfico de membrana capaz de detetar
esse antigénio no LCR (de uma forma muito semelhante às pesquisas de antigénios na urina e
nas fezes, mas utilizando um kit específico pesquisa de antigénio de Cryptococcus spp).
Expetoração/secreções brônquicas/ lavado alveolar/lavado brônquico
A suspeita de infeções respiratórias do trato superior (ex.: amigdalite, faringite, laringite,

otite) e inferior (ex.: bronquite, bronquiolite, pneumonia) estão na origem da requisição médica
dos exames bacteriológicos das amostras respiratórias (Expetoração/secreções brônquicas/
lavado alveolar/lavado brônquico). Os microrganismos (bactérias e fungos) normammente
associados às infeções respiratórias podem ser:
 Streptococcus pneumoniae
 Haemophilus influenzae
 Legionella pneumophila
 Klebsiella pneumoniae
 Pseudomonas aeruginosa
 Mycobacterium tuberculosis
 Staphylococcus aureus
 Pneumocystis jiroveci
 Candida spp
 Aspergillus spp
A cultura de amostras respiratórias é efetuada nos meios Gelose de Chocolate, Gelose de
Sangue, MCK, MSA2 e SGC2, por esta ordem, pela técnica de sementeira por estrias paralelas
em superfície (quadrantes). Nestes produtos, também são efetuados dois esfregaços, um para
24
coloração de Gram (permite pré-avaliar as amostras e ver se são representativas ou não, visto
que um número elevado de células epiteliais e um número baixo de células polimorfonucleares
indicam que houve contaminação da amostra com saliva) e outro para coloração de Ziehl-
Neelsen. Amostras com volume superior a 5mL são transferidas para tubos cónicos de 50mL e
centrifugadas, para que o sedimento se torne homogéneo e representativo da infeção. Nos casos
em que é pedido pesquisa de Mycobacterium tuberculosis, as amostras também têm de ser
transferidas para esses tubos cónicos, de forma a que, posteriormente, possam ser tratadas
(descontaminadas). Amostras muito mucosas requerem homogeneização com auxilio de pérolas
(esferas de vidro) e água esterilizada, com agitação no vortex. Este procedimento facilita a
sementeira de tais amostras.
Fragmentos de tecido
Os fragmentos de tecido são triturados num almofariz e diluídos para obtenção de uma
solução homogénea, antes da sementeira. Posteriormente, são semeados em COS, PVX, MCK,
MSA2 e SGC2.
Bacteriologia – Leitura de placas, continuações, identificações,

antibiogramas e validação
A área de Bacteriologia é a secção do laboratório de microbiologia do IPO Porto onde se

dá continuidade à análise dos produtos biológicos. Uma vez finalizadas as sementeiras desses
produtos, os meios de cultura semeados são colocados nas respetivas estufas (as geloses na
estufa a 37ºC, com 5 a 10% de CO2, e os restantes meios na estufa a 37ºC), durante 48 horas. Às
24 horas de incubação, os meios de cultura são sujeitos a uma primeira avaliação, no entanto se
as colónias ainda estiverem muito pequenas, os meios são novamente incubados até às 48 horas.
Se for possível distinguir bem as colónias, verificar que se trata de colónias puras e
características de determinado microrganismo, então pode-se proceder à sua identificação, com
posterior realização do antibiograma/fungigrama.
O meio de cultura CLED não necessita de estar as 48 horas a incubar, e ao fim de 24
horas de incubação podem-se ler as placas e avaliar se é ou não necessário continuar o estudo
para identificação (e antibiogramas/fungigramas) ou fazer repicagens quando há mais do que
uma população de colónias predominantes.
25
O meio SGC2, utilizado para o crescimento de fungos, necessita de mais tempo de

incubação, porque os fungos têm uma taxa de crescimento mais lenta. O resultado é fornecido
somente após 5 dias de incubação, caso não ocorra crescimento durante esse período.
Leitura de placas
A leitura de meios de cultura é uma tarefa fundamental para a orientação do estudo

microbiológico (bactérias e fungos), uma vez que se trata de uma avaliação presuntiva do
microrganismo responsável pela infeção. As características macroscópicas das colónias que são
avaliadas nesta etapa estão resumidas no quadro 3.
Quadro 3 Características morfológicas das colónias observadas na leitura de placas
Característica observada Avaliação

Tamanho Deve ser considerado na sua totalidade e permite distinguir,
presuntivamente, cocos e bacilos, visto que os cocos
apresentam-se em colónias menos volumosas que os
bacilos(25).
Cor Varia consoante o meio de cultura utilizado. Em meios
diferenciais, sofre interferência das reações que ocorrem com
os compostos existentes nos mesmos(4).
Forma Varia consoante o tipo de microrganismo. Os cocos
apresentam-se em colónias mais arredondadas que os
bacilos(4).
Aparência da superfície Permite distinguir, presuntivamente, cocos e bacilos, visto
que os bacilos se apresentam mais mucoides que os cocos.
Permite também identificar determinados microrganismos
pelas características típicas das suas colónias(4)(7).
Odor Permite identificar, presuntivamente, determinados
(4)
microrganismos .
Leitura das placas em meio de cultura CLED
Quadro 4 Características das colonias nas placas de meio CLED.

Microrganismo Colónias
Escherichia coli Médias, opacas, amarelas e com odor ácido
Klebsiella spp Grandes, muito mucosas, amarelas ou translúcidas
Proteus spp Menores que as de E. coli, azuis translúcidas e com
propagação (swarming) inibida
Enterococcus faecalis Pequenas, redondas e amarelas
Staphylococcus aureus Maiores que as de E. faecalis, redondas, lisas e amarelas
Pseudomonas aeruginosa Médias, achatadas, verdes ou azuis, com bordos
irregulares e odor a feno fresco
26
Figura 13 Colónias características de Escherichia coli no meio CLED(29)
Figura 14 Colónias características de Klebsiella spp no meio CLED(30)
27
Figura 15 Colónias de cocos Gram-positivo no meio CLED(31)
Figura 16 Colónias características de Pseudomonas aeruginosa no meio CLED(32).
Leitura das placas em meio de cultura Gelose de Chocolate (PVX)
Quadro 5 Características das colonias nas placas de Gelose de Chocolate (PVX).

Cocos (em geral) Pequenas a médias e redondas
Staphylococcus spp Bege-amareladas
Streptococcus spp Cinzentas
Bacilos (em geral) Grandes e muito mucosas
Haemophilus influenzae Pequenas, castanho-acinzentadas, tipo gotas de água e
com odor sui generis a “ninho de rato”
28
Figura 17 Colónias de cocos no meio Gelose de Chocolate(33)
Figura 18 Colónias características de Haemophilus influenzae no meio Gelose de Chocolate(34)
Leitura das placas em meio de cultura Gelose de Sangue (COS)
Quadro 6 Características das colonias nas placas de Gelose de Sangue (COS)

Cocos (em geral) Pequenas a médias e redondas
Staphylococcus aureus Bege-amareladas (produção de pigmento amarelo) com
β-hemólise
Streptococcus pneumoniae Cinzentas com colapso central e α-hemólise
Streptococcus pyogenes Cinzentas com β-hemólise
Enterococcus faecalis Cinzentas com γ-hemólise
Bacilos (em geral) Grandes e muito mucosas
29
Figura 19 Colónias de cocos no meio Gelose de Sangue(35)
Figura 20 Colónias características de Staphylococcus aureus no meio Gelose de Sangue(35)
Figura 21 Colónias características de Streptococcus pneumoniae no meio Gelose de Sangue(36)
30
Leitura das placas em meio de cultura MacConkey (MCK)
Quadro 7 Características das colonias nas placas de MacConkey (MCK)

Escherichia coli Médias, umbilicadas/convexas e rosa
Klebsiella spp Grandes, mucosas e amarelas ou rosa
Pseudomonas aeruginosa Médias, brilhantes, amarelas, com bordos irregulares e
odor característico
Figura 22 Colónias características de Escherichia coli no meio MacConkey(37)
Figura 23 Colónias características de Klebsiella spp, não fermentadora da lactose, no meio MacConkey(38)
31
Figura 24 Colónias características de Pseudomonas aeruginosa no meio MacConkey(39)
Leitura das placas em meio de cultura Manitol Salt Agar (MSA2)
Figura 25 Colónias características de Staphylococcus aureus no meio Manitol Salt Agar(40)
32
Leitura das placas em meio de Sabouraud Gentamicin Chloramphenicol (SGC)
Figura 26 Colónias características de Candida albicans no meio Sabouraud Gentamicin Chloramphenicol(41)
Leitura das placas de “Methicillin-Resistant Strains of Staphylococcus aureus” (MRSA)
Figura 27 Colónias características de Staphylococcus aureus resistentes à meticilina no meio MRSA(42)
Leitura das placas em meio Salmonella-Shigella (SS)

Salmonella spp Pequenas, translúcidas e com centro negro
Shigella spp Pequenas e translúcidas
33
Figura 28 Colónias características de Salmonella spp no meio Salmonella-Shigella(43)
Leitura das placas em meio ChromID Salmonella (SM2)
Figura 29 Colónias características de Salmonella spp no meio ChromID Salmonella(44)
Identificação de Microrganismos
Nesta fase do processo é feita a identificação de microrganismos é feita. Primeiro, e de

uma forma presuntiva, identificam-se as colónias de bactérias e/ou fungos, que cresceram nas
placas de meios de cultura semeadas e incubadas. No seguimento, e consoante
o tipo de colónias encontradas, são efetuadas diferentes provas de
identificação presuntiva, de forma a se confirmar ou excluir as suspeitas iniciais. As provas
presuntivas auxiliam a identificação dos microrganismos devido à visualização da atividade das
34
enzimas resultantes do seu metabolismo ou a reações de aglutinação. Algumas provas

presuntivas usadas são:
 prova da catalase
 prova da coagulase
 prova da filamentação
 Pastorex Staph Plus,
 Slidex Strepto Plus
 prova de satelitismo.
Prova da catalase
A catalase é uma enzima intracelular que decompõe o peróxido de hidrogénio

(H2O2), produzido durante o seu metabolismo, em água e oxigénio. A libertação de O2
resultante dessa reação, pode ser visualizada através da formação de bolhas ou
efervescência(45)(9).
A prova da catalase é um teste diferencial para a identificação de microorganismos
capazes de produzir a enzima catalase. Distingue os Staphylococcus spp (catalase positiva) dos
Streptococcus spp (catalase negativa) (figura 30). Esta prova é realizada numa lâmina. Mistura-
se uma pequena porção de colónias das placas em estudo H2O2 e espera-se a ocorrência ou não
de efervescência, indicativa da presença de oxigénio(9)(24)(12).
Figura 30 Prova da catalase. Exemplo de resultados negativo e positivo(46)
Prova da coagulase
A coagulase é uma enzima com capacidade para coagular o plasma sanguíneo através de
um mecanismo similar ao da coagulação normal(45), reagindo com um fator plasmático, o
qual vai atuar sobre o fibrinogénio, formando-se a fibrina. A atividade da coagulase é utilizada
para distinguir espécies patogénicas de Staphylococcus de espécies não patogénicas(47). A prova
da coagulase pode ser feita em lâmina (10-15 segundos) ou em tubo (4h)(14). A prova da
35
coagulase em tubo é executada com adição de um pouco de plasma a um tubo e de seguida

adicionam-se as colónias suspeitas. Após incubação a 37ºC durante 4 observa-se os resultados.
A formação de coágulo é uma reação positiva(13). Caso se verifique aglutinação o teste é
positivo (Staphylococcus aureus). Pelo contrário, se não ocorrer formação de coágulo, então o
teste é negativo (Staphylococcus coagulase negativa – ex: S. epidermidis, S.
saprophyticus)(24)(17)(4)(14).
Figura 31 Prova da coagulase em tubo e em lâmina(48)
Prova da oxidase
A prova da oxidase é um teste diferencial para identificação de bactérias Gram-.

Distingue os microrganismos da família Enterobacteriaceae dos que não pertencem a esta
família [Enterobacteriaceae (oxidase negativa – incolor) e Não Enterobacteriaceae (oxidase
positiva – cor púrpura)], com base na atividade da enzima citocromo oxidase. Este teste
determina a presença ou ausência de atividade da oxidase no citocromo C das bactérias. Esta
atividade depende da presença de um sistema de citocromo oxidase intracelular que catalisa a
oxidação do citocromo C através de O2 molecular que, por sua vez, irá funcionar como recetor
de eletrões final no sistema de transporte de eletrões do microorganismo. Os microorganismos
que contêm o citocromo C como parte da sua cadeia respiratória são positivas para a oxidase e
tornam o reagente purpura. Os organismos que não contêm o citocromo C como parte da sua
cadeia respiratória não oxidam o reagente, deixando-o incolor dentro dos limites de tempo do
teste e, por isso não negativos para oxidase(49).
36
Figura 32 Exemplo de resultados negativo e positivo, respetivamente, na prova da oxidase (49).
Prova da filamentação
A prova da filamentação tem por finalidade distinguir facilmente a Candida albicans de

Candidas não albicans. O teste é realizado mediante a observação de colónias de fungos
leveduriformes que possuam uma aparência idêntica às colónias de C. albicans. Para
isso, é utlizado o kit “Bichrolatex Albicans Fumouze®” um teste de aglutinação para a rápida
identificação de C. albicans e C. dubliniensis. O kit contém dois reagentes: um reagente de
látex, revestido por anticorpos monoclonais específicos dos antigénios de C. albicans e C.
dubliniensis e um reagente de dissociação, que contém enzimas que permitem a separação das
células, expondo os antigénios aos anticorpos. Após 5 minutos de agitação, é realizada a leitura,
em que numa reação positiva deverá estar evidenciada aglutinação vermelha sob um fundo
verde, indicando a presença de C. albicans. Numa reação negativa, é observada uma suspensão
homogénea de cor castanha e deve ser realizada a identificação por métodos
automáticos (Figura 33)(50,51).
Figura 33 Esquema de funcionamento do kit “Bichrolatex Albicans Fumouze®”(50)
37
Pastorex Staph Plus
Para uma identificação imediata de Staphylococcus aureus usa-se o kit “Pastorex Staph-
plus®”. Trata-se de teste rápido de aglutinação para a deteção simultânea do fator de
coagulação, da proteína A e dos polissacarídeos capsulares do S. aureus. O reagente é composto
por partículas sensibilizadas com fibrinogénio, anticorpos IgG e anticorpos monoclonais
específicos contra os polissacarídeos capsulares, permitindo o reconhecimento de estirpes de
Staphylococcus aureus. Após a mistura entre colónias suspeitas e o reagente, é observada a
reação que, quando positiva, apresenta formação de aglomerados macroscopicamente visíveis e,
quando negativa, observa-se uma suspensão homogénea(52) (figura 34).
Figura 34 Exemplo de resultados positivo e negativo, respetivamente, do kit “Pastorex Staph-plus®”(52)
Slidex Strepto Plus
Os Streptococcus pertencem à família Streptocococaceae, são cocos Gram+ e

diferenciam-se em β-, α- e γ-hemolíticos pelas suas hemólises provocadas em meio gelose de
sangue(8). Os β-hemolíticos provocam a lise total no meio(2,4,5,8,12,14). Para a classificação dos
Streptococcus é utilizado o kit “Slidex Strepto Plus®” Trata-se de um teste de aglutinação em
látex para a identificação de antígenos A, B, C, D, F e G do grupo de Lancefield. O antigénio
específico é extraído por uma enzima e identificado pelas partículas sensibilizadas com
anticorpos anti-antigénio do grupo. A presença do antigénio provoca uma aglutinação visível
macroscopicamente, enquanto que na ausência do antigénio apresenta uma suspensão
homogénea(53).
Prova de satelitismo
O Haemophillus influenza é uma bactéria fastidiosa que pode causar graves infeções,
especialmente em crianças menores de 5 anos(17). Este agente etiológico requer a presença de
fatores para o seu desenvolvimento: fator X (hemina) e fator V (NAD - nicotinamida adenina
nucleótido). Cresce bem em meio gelose de sangue, visto que lhe fornece as condições
38
necessárias(4,8,10). A suspeita da presença de Haemophillus influenza numa amostra de um

paciente, requer a realização da chamada prova do satelitismo. Resumidamente, este teste
consiste em inocular uma suspensão de bactérias com turvação de 0,5 McFarland no meio
Mueller Hinton (meio sem fatores), em três planos sobrepostos, com adição de discos de papel
de filtro impregnados com os fatores V, X e XV, na forma de um triângulo isósceles (figura 35)
Após crescimento, avalia-se a zona onde a bactéria se desenvolveu, sendo que na presença de
Haemophillus influenza, deverá evidenciar-se crescimento em redor do disco XV e entre os
discos X e V(14,17).
Figura 35 Prova de satelitismo(54).
Após se realizarem as provas presuntivas, a identificação de microrganismos (e

antibiogramas) é feita através dos sistemas automatizados Vitek®2 Compact (bioMérieux),
MicroScan® WalkAway®-96 Plus System (Siemens) e Bruker MicroflexTM Maldi-TOF.
Sistema Automático Vitek2 Compact BioMérieux
O sistema automatizado da Biomérieux Vitek2 (figura 36) está capacitado para

identificar microrganismos e realizar testes de sensibilidade a antimicrobianos. Este sistema
opera com o recurso a “cartas” de reagentes, com 64 poços cada, as quais contêm substratos
para medir as atividades metabólicas (acidificação, alcalinização, hidrólise enzimática) e detetar
o crescimento microbiano, na presença de substâncias inibitórias.
Para preparar a análise através deste equipamento é necessário efetuar uma suspensão
com colónias do microrganismo em estudo, em 3mL de solução salina estéril. A carta é
inoculada na suspensão e colocada a câmara de vácuo do equipamento, para que a suspensão
seja forçada a preencher todos os poços da mesma. Após selagem da carta, esta é incubada a a
39
uma temperatura de aproximadamente 37ºC (mimetiza a temperatura fisiológica), durante 15

minutos, sendo depois transportada para o sistema ótico de leitura da reação (este sistema opera
com tecnologia de colorimetria, isto é, interpretação da reação pelo uso de diferentes
comprimentos de onda, na zona do espectro visível, com medição da turvação e dos produtos
coloridos produzidos). Seguidamente, regressa à incubação, até à próxima leitura, e assim
sucessivamente. Os resultados obtidos são comparados com a base de dados instalada no
software do equipamento, de forma a identificar o microrganismo(55).
Figura 36 Equipamento automatizado VITEK® 2 Compact (bioMérieux)(55).
Neste equipamento são utilizados vários tipos de cartas de identificação (figura 37). As
turvações das suspensões variam consoante o tipo de carta (Quadro 8).
Quadro 8 Cartas de identificação do Vitek2 e respetivas turvações das suspensões.
Carta Turvação da suspensão (McFarland)

GP - Microrganismos Gram-positivos
0,55 - 0,65
GN - Microrganismos Gram-negativos
YST - Fungos Leveduriformes 1,80 - 2,20
ANC - Microrganismos Anaeróbios
2,70 - 3,30
NH - Neisseria spp/Haemophilus spp
40
Figura 37 Exemplo de cartas de identificação do sistema Vitek2(56)
Sistema Automático MicroScan® WalkAway®-96 Plus System (Siemens/Beckman

Coulter Diagnostics)
O sistema automatizado MicroScan® WalkAway®-96 Plus System da companhia

Siemens/Beckman Coulter Diagnostics (figura 38) está capacitado para identificar
microrganismos e realizar em simultâneo testes de sensibilidade a antimicrobianos, através de
painéis/microplacas, com 96 poços cada, os quais contêm substratos capazes de mediras
atividades metabólicas dos microorganismos (acidificação, alcalinização, hidrólise enzimática)
e detetar o seu crescimento, na presença de substâncias inibitórias (aproximadamente 20
antimicrobianos). Estes painéis apresentam ainda um controlo interno (um poço reservado para
controlo positivo, um poço reservado para controlo negativo e um poço de localização que
indica o tipo de painel)(57).
Figura 38 Sistema automatizado MicroScan® WalkAway®-96 Plus System(57)
41
Tal como no caso do sistema Vitek para preparar a análise através do equipamento
“WalkAway” é necessário efetuar uma suspensão com colónias do microrganismo em
estudo, em recipiente próprio de inoculação rápida com 3mL de solução salina, a qual é vertida
para um tabuleiro descartável. O painel é inoculado, utilizando o sistema RENOK®, e colocado
no equipamento, onde será incubado a 37ºC, aproximadamente, durante 24 horas. Após o
período de incubação, o painel pode ser interpretado fazendo uso de tecnologias de colorimetria
(leitura através de um espectrofotómetro com vários comprimentos de onda e fibras óticas) e
fluorimetria (leitura através de fluorescência)(57).
Figura 39 Sistema RENOK®(58)
Sistema Automático MALDI TOF MS microflex (Bruker)
O termo MALDI é derivado do inglês “Mass Assisted Laser Desorption/Ionization”, ou

seja, dessorção/ionização por laser assistido por matriz. Os equipamentos de espetrometria de
massa (figura 40) possuem diversos analisadores que separam os iões de diferentes massas.
Entre tais analisadores/separadores de iões, há aqueles que diferenciam as massas pelo tempo de
voo destas moléculas em tubo de vácuo (TOF: time of flight). Em microbiologia clínica, a
identificação de microorganismos por espetrometria de massa MALDI-TOF (MALDI-TOF)
opera nas seguintes etapas: a primeira consiste em misturar a amostra (ex. colônias
de bactérias, fungos) com a matriz. A matriz comumente utilizada para dessorção de
proteínas é constituída por ácido -ciano-4-hidroxicinâmico (CHCA). Posteriormente
ocorre a evaporação dos solventes e cristalização. O depósito formado pela amostra e pela
matriz é realizado sobre uma placa metálica com diversas divisões que
acomoda entre 96 testes (figura 41).
42
Figura 40 Equipamento microflex biotyper MALDI-TOF MS da Bruker(61).
Figura 41 Placa metálica para colocação das amostras no microflex MALDI-TOF MS(59)
A placa metálica por sua vez, é introduzida no espectrômetro de massa e feixes

de laser UV de determinado comprimento de onda são emitidos sobre cada depósito. A
matriz absorve a energia do laser e ocorre evaporação da amostra com a formação de
iões com massas diferentes. Os iões formados com carga +1 são acelerados sob a
influência do campo elétrico de carga positiva para dentro de um tubo de voo (vácuo). Na
extremidade deste tubo encontra-se um detetor. Os iões de tamanho mais pequeno chegam mais
rapidamente ao detetor. O tempo de voo de cada partícula até chegar ao detetor é utilizado para
calcular a sua massa. A soma de todos os iões analisados forma o chamado espectro de massa
da amostra analisada. O eixo das abscissas corresponde à relação massa/carga e no eixo das
ordenadas encontram-se a intensidade do sinal, que é proporcional à quantidade de iões
43
da mesma massa. Os princípios da tecnologia citada encontram-se ilustrados na figura 42 e

foram explicitados no trabalho de Croxatto A. et al. em 2011(60).
Figura 42 Princípios da tecnologia de espectrometria de massa por ionização/dessorção

de matriz assistida por laser por tempo de voo (MALDI-TOF)(60)
A principal vantagem da tecnologia de SM MALDI-TOF sobre outras técnicas
laboratoriais para identificação de microrganismos é a agilidade para obtenção dos
resultados. Entre a preparação da amostra e a leitura final, um resultado isolado pode ser
obtido em menos de trinta minutos(61). A tecnologia de MALDI-TOF SM é considerada um
grande avanço para a Microbiologia, e atualmente é bastante explorada pela comunidade
científica para a identificação de espécies que antes só eram identificadas por biologia
molecular(59–61).
As identificações de microrganismos são sempre efetuadas a partir de culturas puras. Se

existirem dois ou mais tipos de colónias num determinado meio, é necessário fazer repicagens
de cada tipo de colónia, antes de prosseguir para a sua identificação.
Existem determinados testes, também eles presuntivos, que podem auxiliar na

identificação do microrganismo em estudo e que são executados manualmente, tais como:
44
 teste à novobiocina
 teste à optoquina e à solubilidade da bílis
 teste à bacitracina
 teste à hidrólise da bílis-esculina e à tolerância ao sal
 teste à fermentação da lactose
 teste à produção de urease
Teste de sensibilidade à novobiocina (figura 43)
Este teste é utilizado em caso de resultado negativo na prova da coagulase:

 Resultado sensível – Staphylococcus epidermidis
 Resultado resistente – Staphylococcus saprophyticus
Figura 43 Teste de sensibilidade à novobiocina(62)
Teste de sensibilidade à optoquina e à solubilidade da bílis (figura 44)
Este teste é utilizado em caso de resultado negativo na prova da catalase com padrão α-
hemolítico:
 Resultado sensível – Streptococcus pneumoniae
 Resultado resistente – Enterococcus faecalis
Figura 44 Teste de sensibilidade à optoquina(62)
45
Teste de sensibilidade à bacitracina (figura 45)
Este teste é utilizado em caso de resultado negativo na prova da catalase com padrão β-
hemolítico:
 Resultado sensível – Streptococcus pyogenes
 Resultado resistente – Streptococcus agalactiae
Figura 45 Teste de sensibilidade à bacitracina(62)
Teste da hidrólise da bílis-esculina e da tolerância ao sal (figura 46)
Este teste é utilizado em caso de resultado negativo na prova da catalase com padrão γ-
hemolítico
 Resultado positivo: Enterococcus faecalis
Figura 46 Teste da hidrólise da bile-esculina(63)
Teste da fermentação da lactose
Este teste é utilizado para diferenciar Enterobacteriaceae e Não Enterobacteriaceae

 Resultado positivo: Escherichia coli, Klebsiella spp, Enterobacter spp
46
 Resultado negativo: Salmonella spp, Shigella spp, Proteus spp, Pseudomonas

aeruginosa
Teste da produção de urease
Este teste é utilizado para diferenciar Enterobacteriaceae e Não Enterobacteriaceae

 Resultado positivo: Klebsiella spp, Proteus spp;
 Resultado negativo: E. coli, Enterobacter spp, Salmonella spp, Shigella spp;
Antibiograma e Fungigrama
A identificação de microrganismos é a etapa mais importante do estudo microbiológico.

No entanto, o papel do laboratório de microbiologia em contexto de diagnóstico não fica por aí.
É igualmente essencial determinar qual a melhor terapêutica a ser aplicada ao doente. Neste
sentido, é necessário efetuar o antibiograma/fungigrama (técnica destinada à determinação da
sensibilidade a antimicrobianos), para que se possa identificar o antibiótico/antifúngico mais
adequado e eficaz para cada caso.
Deste modo, tal como a identificação de microrganismos, também o
antibiograma/fungigrama é feito através dos sistemas automatizados VITEK® 2 Compact
(bioMérieux) e MicroScan® WalkAway®-96 Plus System (Siemens), segundo as regras
EUCAST, do inglês European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing, utilizando as
seguintes cartas e painéis:
Cartas:
AST N192/ (agora 355) (Enterobacteriaceae)
AST N222/ (agora 354) (Não Enterobacteriaceae)
AST P619 (Staphylococcus spp)
AST P586 (Enterococcus spp)
AST ST01 (Streptococcus spp)
AST YS07 (Fungos).
Painéis:
 NC70 (Enterobacteriaceae)
 NC71 (Não Enterobacteriaceae)
 NUC69 (Bacilos Gram-negativo Urinários)
47
 PC42 (Enterococcus spp/Staphylococcus spp)

 RY-ID (Fungos)
 PM33 (Antibiograma de Staphylococcus aureus).
O antibiograma é um teste efetuado para todo o tipo de produtos biológicos, o
fungigrama só é realizado para hemoculturas. Nestas últimas, efetua-se o fungigrama também
por método Etest em meio RPMI (Roswell Park Memorial Institute), de forma a abranger todos
os antifúngicos, uma vez que os sistemas automatizados não os incluem na sua
totalidade. Por outro lado, o antibiograma/fungigrama também pode ser realizado manualmente,
pelo método qualitativo de difusão de disco, o qual classifica o microrganismo em suscetível ou
resistente (neste caso, os antibióticos/antifúngicos são adequados à realidade da
instituição hospitalar, como é caso do IPO Porto). Este método baseia-se na inoculação de uma
suspensão com turvação de 0,5 McFarland no meio Mueller Hinton (ou Gelose de Chocolate,
por exemplo, para Haemophilus spp), em três planos sobrepostos, com adição de discos de
papel de filtro impregnados com antimicrobianos(4,13,14,17,59–61).
O método Etest é baseado numa técnica quantitativa para determinar a suscetibilidade a
antimicrobianos, em termos de valores de Concentração Mínima Inibitória (CMI), a qual se
baseia numa combinação de conceitos (diluição e difusão), utilizando uma tira de plástico
inerte, com gradiente de concentração pré-definido e imobilizado sobre a mesma(3,5,7) (figura
47).
Figura 47 Antibiograma/Fungigrama por método de difusão de disco e por método Etest, respetivamente(64)
No caso de Enterobacteriaceae, além do antibiograma, é efetuado um teste extra,

Extended Spectrum β-Lactamase (ESBL), para determinar se o microrganismo em questão é ou
não produtor de β-lactamases.
No caso do equipamento VITEK® 2 Compact (bioMérieux), relativamente às urinas, é
necessário indicar o tipo de produto, para que o antibiograma também seja efetuado com o
antibiótico furadantina. Em relação aos resultados, podem existir situações em que seja
48
necessário confirmar os mesmos manualmente, como, por exemplo no caso dos antibióticos
amicacina, em Proteus spp resistente, e azitromicina, em Pseudomonas aeruginosa.
Serologia
A serologia consiste na deteção da presença de antigénio e/ou de anticorpos contra

antigénios de um microrganismo, visto que estes estimulam o organismo a produzir
anticorpos.(5,17)
Os testes serológicos são executados com amostras de soro, obtidas a partir da colheita
de sangue para um tubo de análise bioquímica (tubo de tampa amarela com gel separador e
ativador de coágulo), e posterior centrifugação. Este tipo de testes consiste em colocar a amostra
de soro em contacto com antigénios específicos, observando se existe ou não produção de uma
reação antigénio-anticorpo. No entanto, existem diferentes tipos de reação antigénio-anticorpo e
a observação da mesma pode ser facilitada através da utilização de corantes ou substâncias
marcadoras, como enzimas ou componentes fluorescentes.
No laboratório de serologia do serviço de microbiologia laboratorial do IPO Porto são
executados os seguintes testes serológicos:
 Deteção de Antigénios Febris por Aglutinação
 Widal Test
 Weil-Felix Test
 Wright Test
 Deteção de Anticorpos anti-Treponema pallidum por Hemaglutinação Indireta
(TPHA)
 Serodiagnóstico de Sífilis por Venereal Disease Research Laboratory (VDRL)
 Serodiagnóstico de Sífilis por Imunofluorescência Indireta (FTA-Abs)
 Deteção de Anticorpos (IgG e IgM) anti-Toxoplasma gondii por ELFA (VIDAS
TOXO)
 Deteção de Anticorpos (IgG e IgM) anti-Borrelia burgdorferi por ELFA (VIDAS
Lyme).
49
Deteção de antigénio febris por aglutinação

Os antigénios febris são utilizados em testes de aglutinação como auxiliares no
diagnóstico de algumas doenças febris, como por exemplo, a salmonelose e doenças provocadas
por riquétsias. O soro do doente é testado diretamente para se pesquisar a presença de
anticorpos homólogos, através de um teste de aglutinação.
Widal Test
O teste de Widal é um teste serológico normalmente requerido quando o clínico suspeita

de febre tifoide num doente com sintomatologia característica. A febre tifóide é uma doença
infetocontagiosa provocada pela ingestão de Salmonella typhi em água ou alimentos
contaminados. O teste consiste em colocar a amostra de soro em contacto com dois antigénios
somáticos (O) e dois flagelares (H) de Salmonella spp e verificar se, após agitação, ocorre uma
reação de aglutinação, em lâmina. Neste caso, o resultado será positivo quando se observar a
formação de agregados, o que indica a presença de anticorpos específicos no soro testado. Com
o intuito de se determinar o título de anticorpos a partir do qual a reação é negativa devem-se
efetuar diluições da amostra. Há uma reação negativa quando não se observa nenhuma
aglutinação, indicando ausência de anticorpos ou a presença de anticorpos com título inferior ao
limite de sensibilidade(65).
Weil-Felix Test
O teste de Weil-Felix é um teste serológico que permite diagnosticar infeções

provocadas por Rickettsia spp (bactérias que vivem como parasitas intracelulares obrigatórios
de carraças, pulgas e piolhos), em doentes com sintomas característicos. O teste consiste em
colocar a amostra de soro em contacto com antigénios de Proteus spp (OX19, OX2 e OXK) e
verificar se, após agitação, ocorre uma reação de aglutinação, em lâmina. A utilização destes
antigénios deve-se à reatividade cruzada entre antigénios de Rickettsia spp e Proteus spp. Neste
caso, o resultado será positivo quando se observar a formação de agregados. Com o intuito de se
determinar o título de anticorpos a partir do qual a reação é negativa devem-se efetuar diluições
da amostra. Há uma reação negativa quando não se observa nenhuma aglutinação, indicando
ausência de anticorpos ou a presença de anticorpos com título inferior ao limite de
sensibilidade(66).
50
Wright Test
O teste de Wright é um teste serológico qualitativo que permite diagnosticar brucelose

humana, uma doença muito frequente no mundo provocada pela ingestão de Brucella spp
(Brucella melitensis, abortus, bovis e suis) em alimentos lácteos não pasteurizados ou pelo
contacto com animais ou carne contaminada, em indivíduos com sintomas característicos da
doença. O teste consiste em colocar a amostra de soro em contacto com um antigénio, corado de
Rosa Bengala, de Brucella abortus e verificar se, após agitação, ocorre uma reação de
aglutinação, em carta de látex descartável. Há uma reação positiva quando se observa uma
aglutinação, o que indica a presença de anticorpos específicos no soro testado. Há uma reação
negativa quando não se observa nenhuma aglutinação, indicando ausência de anticorpos ou a
presença de anticorpos com título inferior ao limite de sensibilidade(67).
Deteção de Anticorpos anti-Treponema pallidum por Hemaglutinação

Indireta (TPHA)
O TPHA é um teste serológico treponémico que permite diagnosticar sífilis, uma doença
infeciosa provocada pela transmissão sexual de Treponema pallidum (bactéria Gram-negativo
do grupo das espiroquetas), em indivíduos com sintomas caraterísticos. O teste consiste em
colocar a amostra de soro (ou plasma, ou LCR) em contacto com eritrócitos de aves
estabilizados e sensibilizados com componentes antigénicos de Treponema pallidum altamente
purificados e verificar se, após incubação, ocorre uma reação de aglutinação, numa microplaca
descartável (figura 48). Uma reação é positiva quando os eritrócitos se depositam no fundo da
cavidade como um tapete, às vezes com bordas irregulares. A presença de aglutinação na
suspensão de eritrócitos indica a presença de anticorpos específicos anti-Treponema pallidum.
Uma reação é negativa quando os eritrócitos se depositam no fundo da cavidade formando um
botão. A ausência de aglutinação indica a ausência de anticorpos específicos anti-Treponema
pallidum, ou que estes existem abaixo do limite de deteção do teste.
Anticorpos inespecíficos provenientes de treponemas saprófitas que poderiam causar
resultados falso-negativos são absorbidos por componentes presentes no diluente estabilizador
dos eritrócitos estabilizados.
51
Figura 48 Exemplo de resultados positivos e negativos no teste TPHA(68)
Serodiagnóstico de Sífilis por Venereal Disease Research Laboratory (VDRL)

O VDRL é um teste serológico não treponémico que permite diagnosticar a sífilis em
indivíduos com sintomas característicos. Na sífilis, é possível detetar no soro do doente, uma
substância semelhante a anticorpos, denominada reagina. Quando esta infeção afeta o sistema
nervoso central, a reagina pode ser detetada no LCR. O teste consiste em colocar uma amostra
de soro em contacto com um antigénio não treponémico, constituído por cardiolipina, colesterol
e lecitina, e verificar se, após agitação, ocorre uma reação de floculação, em lâmina. Este teste
pretende assim detetar e quantificar anticorpos anti-lípidos que se formam em resposta aos
lípidos libertados pelas células danificadas, na fase inicial da infeção, e a materiais semelhantes
a lípidos da superfície celular de Treponema pallidum (Phylum Spirochaetes. Neste caso, o
resultado será positivo quando se observar a formação flocos (floculação), o que indica a
presença de anticorpos específicos no soro testado. Com o intuito de se determinar o título de
anticorpos a partir do qual a reação é negativa devem-se efetuar diluições da amostra. O título
corresponde ao inverso da última diluição que apresenta ainda um resultado positivo. Há uma
reação negativa quando não se observa nenhuma floculação, isto é, as partículas encontram-se
dispersas, indicando ausência de anticorpos ou a presença de anticorpos com título inferior ao
limite de sensibilidade(65)(69). Os testes não treponémico reativos confirmam o diagnóstico na
presença de lesões de sífilis iniciais ou tardias.
52
Serodiagnóstico de Sífilis por Imunofluorescência Indireta (FTA-Abs)
O FTA-Abs é um teste serológico treponémico utilizado no diagnóstico da sífilis, em

indivíduos com sintomatologia característica. O teste consiste em colocar a amostra de soro em
contacto com antigénios de Treponema pallidum fixados em lâmina e verificar se, após adição
de antigamaglobulina humana (IgG) marcada com isotiocianato de fluoresceína (revelador da
reação), ocorre uma reação de fluorescência, decorrente da reação antigénio-anticorpo prévia.
O resultado é considerado positivo quando se observa, ao microscópio de fluorescência, a
presença de fluorescência amarelo-esverdeada (cor de maçã) característica (figura 49)
Figura 49 Exemplo de um resultado positivo no teste FTA-Abs(70)
Deteção de Anticorpos (IgG e IgM) anti-Toxoplasma gondii por ELFA

(VIDAS TOXO)
O toxoplasma gondii (figura 50), protozoário parasita intracelular obrigatório, é um

microorganismo patogénico muito frequente no homem(17). O VIDAS TOXO é um teste
serológico que permite diagnosticar a toxoplasmose, uma doença infeciosa provocada pela
ingestão de Toxoplasma gondii (protozoário que parasita mamíferos e aves) em água ou
alimentos contaminados ou por transmissão fecal-oral, após contacto com fezes de gatos, em
indivíduos com sintomas da mesma ou grávidas(71). O teste é realizado no equipamento
automatizado mini VIDAS® (bioMérieux), cuja deteção é qualitativa e se baseia num método
imunoenzimático sandwich com fluorescência (ELFA). Este método ocorre em duas etapas: a
primeira reação consiste na ligação entre os anticorpos IgG/IgM, anti-Toxoplasma gondii e os
respetivos antigénios fixados no cone de reação e na formação de imunocomplexos com
53
anticorpos marcados com biotina; as etapas de lavagem eliminam os componentes não fixados;
a segunda reação consiste na interação entre a biotina e a estreptavidina conjugada com
fosfatase alcalina, a qual conduz à revelação da reação, através da hidrólise do substrato (4-
metil-umbeliferil fosfato) num produto (4-metl-umberilferona) cuja fluorescência emitida é
medida a 450nm. O valor do sinal de fluorescência é proporcional à quantidade de presentes na
amostra. Terminado o teste, os resultados são analisados automaticamente pelo sistema
informático.
Figura 50 Toxoplasma gondii em líquido ascítico de rato(71).

O equipamento efetua duas medidas de fluorescência na cuvete de leitura para cada
teste. A primeira leitura corresponde ao branco da cuvete, antes do substrato entrar em contacto
com o cone. A segunda leitura é efetuada após incubação do substrato com a enzima presente
no cone. O cálculo do RFV (Relative Fluorescence Value) é o resultado das duas medidas e
aparece na folha de resultados, que são interpretados segundo o índice obtido (Quadros 9 e 10):
IgM
Quadro 9 Limiar e interpretação dos resultados do VIDAS TOXO.IgM.

Índice Interpretação
<0,55 negativo
0,55 ≤ Índice <0,65 equívoco
≥0,65 positivo
IgG
Quadro 10 Limiar e interpretação dos resultados do VIDAS TOXO.IgG

<4 negativo
4 ≤ Índice <8 equívoco
≥8 positivo
54
Caso o índice dê um resultado equivoco, o teste deve ser repetido. Se a verificação der
novamente uma interpretação equívoca, deve-se proceder a uma nova colheita de amostra e
consequentemente a uma nova análise.
Deteção de Anticorpos (IgG e IgM) anti-Borrelia burgdorferi por ELFA

(VIDAS Lyme)
O VIDAS Lyme é um teste serológico que permite diagnosticar borreliose ou doença de

Lyme, uma doença infeciosa provocada pela picada de uma carraça infetada com Borrelia
burgdorferi (bactéria Gram-negativo do grupo das espiroquetas)(72)(figura 51). O teste é
realizado da mesma forma que o teste VIDAS TOXO.
Figura 51 Imagens da bactéria Borrelia

burgdorferi e da carraça Ixodes scapularis(72)
Interpretação dos resultados (Quadro 11 e 12):
IgM
Quadro 11 Limiar e interpretação dos resultados do VIDAS Lyme. IgM

<0,20 negativo
0,20 ≤ Índice <0,32 equívoco
≥0,32 positivo
55
IgG
Quadro 12 Limiar e interpretação dos resultados do VIDAS Lyme. IgG

< 0,20 negativo
≥ 0,20 positivo
Caso o índice dê um resultado equivoco, o teste deve ser repetido. Se a verificação der
novamente uma interpretação equívoca, deve-se proceder a uma nova colheita de amostra e
consequentemente a uma nova análise.
Micobactérias
O Bacilo de Koch (BK) Mycobacterium tuberculosis é o agente etiológico da
tuberculose, que ataca normalmente os pulmões. Pertencente à família Mycobactereaceae, o BK
não cora pela coloração tradicional de Gram, devido à estrutura da sua parede celular ser mais
espessa e constituída por uma maior quantidade de lípidos(4,8,10,19,20,72). Deve ser realizada a
coloração de Ziehl-Nelseen para observação do BK (álcool-ácido resistente ou BAAR). A sua
pesquisa é efetuada quando existe suspeita de tuberculose a partir de produtos biológicos como
secreções brônquicas, expetoração, lavados, fragmentos de tecido, líquidos, exsudados, urina. O
produto deve ser pré-tratado, descontaminado e posteriormente semeado e analisado.
Pré-tratamento da amostra
O pré-tratamento da amostra é necessário para se conseguir uma produção máxima de
micobactérias, uma vez que os produtos biológicos enviados para análise, com suspeita de
infeção por micobactérias, estão contaminados com uma flora normal de crescimento rápido.
Este pré-tratamento engloba processos de digestão e descontaminação e é realizado com o kit
BD®BBL MycoPrep. Este processo, consiste, resumidamente em tratar os as amostras, em
câmara de fluxo laminar, com uma solução de descontaminação, constituída por hidróxido de
sódio e N-acetil-L-cisteína (agentes mucolíticos), em quantidades iguais de amostra e solução,
seguido de agitação no vortex e repouso durante 15 minutos; posteriormente, é adicionada uma
solução de tampão fosfato com pH=6,8 até à marca de 50mL e a amostra é centrifugada;
finalmente, o sobrenadante é decantado e, após ressuspenção do sedimento com um pouco de
56
solução tampão, é adicionada uma gota de ácido clorídrico para ajustar o pH das amostras
(confirma-se a neutralidade com tiras de pH).
Sementeiras
As sementeiras das amostras são efetuadas em câmara de fluxo laminar.

São utilizados dois meios de cultura diferentes, MGIT e Lowenstein Jensen, nos quais se
inoculam 0,5mL de amostra. Também é colocada uma gota de amostra numa lâmina de
microscópio para coloração fluorescente (com o kit TB Fluorescent Stain M - coloração ácida
rápida com auramina O), para visualização em microscópio de fluorescência. Em relação aos
meios de cultura, o meio MGIT é incubado a 37ºC no equipamento automatizado BACTEC™
MGIT™ 960 (Becton Dickinson) (figura 52), enquanto o meio Lowenstein Jensen é incubado
numa estufa a 37ºC, em posição horizontal até o inóculo secar (após secagem, o meio é
colocado em posição vertical).
Figura 52 Equipamento automatizado BACTEC™ MGIT™ 960 (Becton Dickinson)(73)
Mycobacteria Growth Indicator Tube (MGIT)
Meio de cultura destinado à deteção e isolamento de micobactérias (figura 53). Contém

um composto fluorescente envolvido em silicone, no fundo do tubo, que é sensível à presença
de oxigénio existente no meio e capaz de emitir fluorescência aquando do consumo do mesmo
por microrganismos em crescimento(6,24,74). Este meio é também constituído por um
suplemento essencial ao crescimento rápido de micobactérias e por uma mistura de
antimicrobianos com capacidade de diminuir a contaminação bacteriana.
57
Figura 53 Meio de cultura Mycobacteria Growth Indicator Tube (MGIT)(75)
Lowenstein Jensen
Meio de cultura destinado à deteção e ao isolamento de micobactérias (figura 54). É

constituído por ovos integrais, uma boa fonte energética para o crescimento das micobactérias, e
solução de verde de malaquita, para conferir cor ao meio e atuar como indicador(4,6,10,73).
Figura 54 Meio de cultura Lowenstein Jensen(76).
Após um período de incubação de 45 dias, se nenhum dos meios de cultura se tornar

positivo, o resultado é fornecido como negativo para a pesquisa de Mycobacterium tuberculosis.
Se algum dos meios positivar (figura 55), efetuam-se dois esfregaços para coloração de Gram e
Ziehl-Neelsen, para avaliação microscópica e confirmação de presença de micobactérias (figura
58
56), nomeadamente BARR. Contudo, para o resultado ser fornecido como positivo, é necessário
efetuar também um antibiograma, o qual é realizado em meio MGIT, utilizando um suplemento
de crescimento e antibióticos líquidos (estreptomicina, isoniazida, rifampicina, etambutol e
pirazinamida). Para a realização do antibiograma utiliza-se um controlo positivo, para que se
possam interpretar os resultados, isto é, se ocorrer crescimento no meio com controlo positivo e
não ocorrer nos meios com antibióticos, o microrganismo é considerado suscetível; se ocorrer
crescimento no meio com controlo positivo e nos meios com antibióticos, o microrganismo é
considerado resistente; se não ocorrer crescimento no meio com controlo positivo e ocorrer nos
meios com antibióticos, os resultados são considerados inválidos e será necessário repetir o
antibiograma.
Figura 55 Colónias características de Mycobacterium tuberculosis no meio Lowenstein Jensen(77).
Figura 56 Mycobacterium tuberculosis visualizado por microscopia de fluorescência(78).
59
Controlo da Qualidade
O laboratório de análises clínicas deve assegurar que os resultados produzidos reflitam,
de forma fidedigna e consistente, a situação clínica apresentada pelos pacientes, assegurando
que não representem o resultado de alguma interferência no processo.
O Controlo de Qualidade é o conjunto de técnicas que são adotadas, para garantir a
fiabilidade dos resultados produzidos no laboratório. A validação dos resultados analíticos
implica o cumprimento de determinados princípios de boas práticas laboratoriais.
O laboratório de microbiologia do IPO Porto possui um sistema de qualidade que
engloba um conjunto de procedimentos de controlo de qualidade interno e está também inserido
em programas de controlo de qualidade externo.
Controlo da Qualidade Interno (CQI)

O CQI baseia-se na análise diária de amostras controlo, com resultados conhecidos,
permitindo avaliar a precisão e identificando erros analíticos. O laboratório utiliza estirpes
ATCC – American Type Culture Collection que possuem características próprias que servem de
referência às metodologias realizadas. O CQI também está presente nos kits, que têm os seus
controlos e são tratados como amostras normais, cujos resultados devem estar de acordo com os
esperados e descritos nas respetivas bulas.
Controlo da Qualidade Externo

O CQE é útil para a deteção de erros sistemáticos, não são detetados no CQI,
e está relacionado com a exatidão. O laboratório participa em programas de qualidade
supervisionados por entidades externas, onde se comparam os resultados obtidos a partir de
amostras desconhecidas com os de outros laboratórios que utilizam os mesmos métodos e
equipamentos, verificando-se a concordância ou não entre eles.
O Laboratório de Microbiologia do IPO Porto efetua mensalmente avaliações
interlaboratoriais como parte do seu programa de CQE a entidade NEQAS (United Kingdom
National External Quality Assessment Service), a qual envia amostras desconhecidas para serem
analisadas, no laboratório, relativamente aos parâmetros sementeiras, identificações de
microrganismos, antibiogramas/fungigramas e pesquisa de micobactérias.
Figura 57 Programas de CQE em que o Laboratório de Microbiologia do IPO Porto participa (79).
60
Conclusão
O estágio curricular da valência de microbiologia efetuado no serviço de microbiologia

laboratorial do IPO Porto foi uma experiência muito gratificante uma vez que me permitiu estar
em contacto com profissionais competentes e sempre disponíveis, que muito contribuíram para
a minha integração no ambiente de trabalho do laboratório, apoiando-me na execução das
tarefas que me foram confiadas, e esclarecendo sempre pedagógica e atenciosamente todas as
dúvidas colocadas. A estes profissionais quero, portanto, agradecer por todos os motivos já
referidos e ainda pelo facto de sempre me terem incutido uma boa conduta profissional assim
como sentido de responsabilidade e consciencialização que muito se exige num laboratório de
análises clínicas ao nível hospitalar.
Os objetivos inicialmente propostos foram atingidos. Os conhecimentos adquiridos nas
aulas puderam ser aplicados e aprofundados, outros conhecimentos novos foram adquiridos e
inúmeros casos práticos puderam ser presenciados e seguidos.
De um modo geral, considero o estágio que realizei muito positivo, uma vez que tive a
oportunidade de continuar a aprender, adquirir competências e aplicar os conhecimentos
adquiridos ao longo do percurso académico.
61
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Microbiologia Laboratorial

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Escola Superior de Saúde

Sérgio José Pinto Teixeira

ÍNDICE GERAL ....................................................................................................................................................... II

ÍNDICE DE FIGURAS ............................................................................................................................................. IV

ENQUADRAMENTO TEÓRICO – MICROBIOLOGIA CLÍNICA LABORATORIAL .......................................................... 3

MICROBIOLOGIA CLÍNICA LABORATORIAL NO IPO PORTO ................................................................................... 3

BACTERIOLOGIA – LEITURA DE PLACAS, CONTINUAÇÕES, IDENTIFICAÇÕES, ANTIBIOGRAMAS E VALIDAÇÃO ... 25

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .......................................................................................................................... 62

Figura 1. Técnica de sementeira por quadrantes ----------------------------------------------------------------11

Figura 2. Técnica de sementeira por picada em profundidade ------------------------------------------------12

Figura 3. Técnica de sementeira em rampa ----------------------------------------------------------------------12

Figura 4. Coloração de Gram --------------------------------------------------------------------------------------13

Figura 5. Parede celular de bactérias Gram+ e Gram- ----------------------------------------------------------14

Figura 6. Cocos Gram+ num esfregaço com coloração de Gram ---------------------------------------------14

Figura 7. Bacilos Gram- num esfregaço com coloração de Gram --------------------------------------------15

Figura 8. Coloração de Ziehl Neelsen ----------------------------------------------------------------------------16

Figura 9. Kit Alere BinaxNOW® Legionella --------------------------------------------------------------------17

Figura 10. Kit Alere BinaxNOW® S. pneumoniae -------------------------------------------------------------17

Figura 12. Equipamento Bactec™ 9000MB (Becton Dickinson) ---------------------------------------------21

Figura 13. Colónias características de Escherichia coli no meio CLED ------------------------------------27

Figura 14. Colónias características de Klebsiella spp no meio CLED ---------------------------------------27

Figura 15. Colónias de cocos Gram-positivo no meio CLED -------------------------------------------------28

Figura 16. Colónias características de Pseudomonas aeruginosa no meio CLED --------------------------28

Figura 17. Colónias de cocos no meio Gelose de Chocolate --------------------------------------------------29

Figura 19. Colónias de cocos no meio Gelose de Sangue ------------------------------------------------------30

Figura 22. Colónias características de Escherichia coli no meio MacConkey ------------------------------31

Figura 23. Colónias características de Klebsiella spp no meio MacConkey ---------------------------------31

Figura 24. Colónias características de Pseudomonas aeruginosa no meio MacConkey -------------------32

Figura 26. Colónias características de Candida albicans no meio SGC -------------------------------------33

Figura 28. Colónias características de Salmonella spp no meio SS -------------------------------------------34

Figura 30. Prova da catalase ---------------------------------------------------------------------------------------35

Figura 31. Prova da coagulase em tubo e em lâmina -----------------------------------------------------------36

Figura 32. Prova da oxidase ----------------------------------------------------------------------------------------37

Figura 33. Kit Bichrolatex Albicans Fumouze ------------------------------------------------------------------37

Figura 34. Kit Pastorex Staph-plus -------------------------------------------------------------------------------38

Figura 35. Prova de satelitismo ------------------------------------------------------------------------------------39

Figura 36. VITEK®2 Compact -------------------------------------------------------------------------------------40

Figura 37. Cartas de identificação do sistema VITEK®2 -------------------------------------------------------41

Figura 38. Microscan® WalkAway®-96 Plus System -----------------------------------------------------------41

Figura 39. Sistema RENOK® --------------------------------------------------------------------------------------42

Figura 40. Microflex Biotyper MALDI-TOF MS ---------------------------------------------------------------43

Figura 42. Princípios da tecnologia MALDI-TOF --------------------------------------------------------------44

Figura 43. Teste de sensibilidade à novobiocina ----------------------------------------------------------------45

Figura 44. Teste de sensibilidade à optoquina -------------------------------------------------------------------45

Figura 45. Teste de sensibilidade à bacitracina ------------------------------------------------------------------46

Figura 46. Teste da hidrólise da bile-esculina -------------------------------------------------------------------46

Figura 48. Teste TPHA ---------------------------------------------------------------------------------------------52

Figura 49. Teste FTA-Abs ------------------------------------------------------------------------------------------53

Figura 50. Toxoplasma gondii -------------------------------------------------------------------------------------54

Figura 51. Borrelia burgdorferi e Ixodes scapularis -----------------------------------------------------------55

Figura 52. BactecTM MGITTM 960 ---------------------------------------------------------------------------------57

Figura 53. Meio de cultura MGIT ---------------------------------------------------------------------------------58

Figura 54. Meio de cultura Lowenstein Jensen ------------------------------------------------------------------58

Figura 56. Mycobacterium tuberculosis visualizado por microscopia de fluorescência -------------------59

Figura 57. UK NEQAS ---------------------------------------------------------------------------------------------60

Quadro 1. Microorganismos álcool ácido resistentes ------------------------------------------------------------4

Quadro 3. Características morfológicas das colónias observadas na leitura de placas ---------------------12

Quadro 4. Características das colonias nas placas de meio CLED -------------------------------------------19

Quadro 7. Características das colonias nas placas de MacConkey (MCK) ----------------------------------24

Quadro 8. Cartas de identificação do Vitek2 e respetivas turvações das suspensões ----------------------25

Quadro 9. Limiar e interpretação dos resultados do VIDAS TOXO. IgM -----------------------------------26

Quadro 11. Limiar e interpretação dos resultados do VIDAS Lyme. IgM-----------------------------------28

BAAR – bacilo álcool ácido resistente

Serve o presente relatório para descrever, sinteticamente, o trabalho realizado ao longo