Licenciatura em Bioquímica

AULA 12
BIOQUÍMICA I

Rosário Almeida: ralmeida@ibmc.up.pt

Cascata de coagulação
ativação de vários intervenientes por clivagem proteolítica dos zimogénios à
forma ativa
 Proteases aspárticas
• Pepsina, quimosina, catepsina D, renina e protease do HIV-1

• Todas têm dois resíduos de aspartato no local activo

• Os dois Asp funcionam em conjunto numa catálise ácido-base geral

• HIV-1 protease é um homodímero

 Proteases aspárticas
Um dos Asp funciona como base e o outro como ácido geral.
Há formação de um intermediário tetraédrico

• No local activo dois resíduos de Asp - um tem pKa alto e o outro tem baixo pKa
• Uma molécula de H2O atua como nucleófilo que atua em conjunto com um resíduo de ácido
aspártico para hidrolizar a ligação peptidica
 Protease do HIV-1

• Protease do HIV-1 cliva a poliproteina do genoma do HIV

• A protease do HIV-1 é um homodímero. O local activo localiza-se entre as duas

subunidades e tem uma sequência caracteristica de Asp-Thr-Gly (Asp25, Thr26 and
Gly27) sequência que é comum às proteases aspárticas. Os resíduos catalíticos são
os Asp 25 (um de cada cadeia).
 Terapia para o HIV?
• Os inibidores da protease podem ser usados como fármacos na SIDA .

• Se a protease do HIV-1 for selectivamente inibida, não se formam novas partículas víricas.

• Os inibidores da protease do HIV não podem bloquear proteases humanas.

Catálise por iões metálicos

• Metaloenzimas – que possuem iões metálicos fortemente ligados geralmente

possuem: Fe2+, Cu2+, Zn2+, Mn2+, Co3+, Ni3+, Mo6+.

• Reações de oxidação-redução.

• Estabilizam ou protegem cargas negativas.

Catálise eletrostática
• A distribuição de carga no local activo estabiliza o estado de transição
(semelhante aos efeitos dos iões metálicos.)
 Actividade da Enolase

Catálise com iões metálicos

Mecanismos de regulação da actividade enzimática

Activação por Proteólise (Modificação covalente irreversível)

Modificação covalente (reversível):

- Fosforilação e desfosforilação cíclicas
- Adenilação
- Redução de pontes dissulfureto
Regulação alostérica:
- libertação alostérica das subunidades catalíticas;
- transição entre formas activa e inactiva.
- ligação cooperativa de ligandos
Outros mecanismos de regulação:
- Compartimentação
- Síntese e degradação
- Regulação mediada pela calmodulina
- Proteínas inibidoras
 Fosfofrutocinase
EC 2.7.1 Fosfotransferases em que o grupo aceitador é um alcool
 Estrutura da Fosfofructocinase

É a enzima mais importante no controle da via

glicolítica em mamíferos.
Níveis altos de ATP inibem a enzima alostericamente.
O AMP inverte a acção do ATP.
Quando a razão ATP/AMP é baixa aumenta a
actividade da enzima.

F6P
ATP

O ATP liga-se ao local alostérico, que é um

local diferente do local catalítico.
Activação da fosfofructocinase pelo fructose 2,6-difosfato

ATP ATP
Substrato Inibidor
Fosfofructocinase
Fosfofructocinase é altamente regulada

• O ATP inibe alostericamente a PFK -1 baixando a afinidade da PFK para a fructose 6-P.
• ADP e AMP actuam libertando a inibição pelo ATP.
• O citrato aumenta a inibição pelo ATP. O citrato é um sensor intracelular da actividade
metabólica da célula Piruvato→Citrato
• A fructose-2,6-bisfosfato é um activador alostérico – reduz a afinidade da enzima para o ATP e
para o citrato. A fructose -2,6-bifosfato é um sensor de glucagon.
• PFK aumenta a sua actividade quando o estado energético da célula é baixo
• PFK diminui a sua actividade quando o estado energético da célula é alto.
Regulação da actividade da Fosfofructocinase

Inibição Activação
Regulação da Fosfotrucinase:

Por metabolitos: inibição pelo ATP, citrato e lactato (músculo)

ativação por ADP, AMP, cAMP e F2,6-BP

Por Fosforilação: - a fosforilação estabiliza a forma tetramérica e anula a alosteria,

aumenta a atividade da PFK
- Insulina, epinefrina e a serotonina promovem a fosforilação
Por interação com elementos do citosqueleto:
- f-actina – interação com a f-actina estabiliza o tetramero ativando a enzima;
- Interação com microtubulos e com a banda 3 inibem a enzima pois estabilizam os
dímeros.
- Pelo cálcio e pela calmodulina (CaM)
 Glicogénio Fosforilase (EC. 2.4.1.1)
2. Transferases
2.4. Glicosiltransferases
2.4.1. Hexosiltransferases
2.4.1.1. Fosforilase
Degradação do glicogénio

enzima processiva
 Glicogénio Fosforilase (GP)
Regulação alostérica e modificação covalente

GP cliva unidades de glucose a partir dos

terminais não-redutores do glicogénio

Uma reacção de fosforólise (PPi)

A GP pode apresentar-se sob a forma

fosforilada (fosforilase a) ou desfosforilada
(fosforilase b) - 2 isozimas.

A GP tem piridoxal fosfato (PLP) como

coenzima. O PLP encontra-se ligado
covalentemente à enzima no seu local activo.

A GP pode ser regulada covalentemente por fosforilação e alostericamente por efectores

alostéricos (AMP, ATP, Glucose-6P).
Vias metabólicas associadas à degradação do glicogénio
 Glicogénio Fosforilase (GP)
Regulação por modificação covalente - fosforilação
Glicogénio Fosforilase
 Glicogénio Fosforilase

Homodímero

Monómero: - domínio amino-terminal com local de ligação do glicogénio

- domínio carboxi-terminal
- local catalítico localizado entre os dois domínios
ISOZIMAS ESPECÍFICAS DE TECIDO

Fígado – manutenção dos níveis de

glucose no sangue – principalmente
sob controlo hormonal

Músculo – degradação do glicogénio

para produção de energia na célula –
controlo alostérico
 Regulação alostérica da Glicogénio fosforilase pela glucose

• A insulina baixa a actividade da glicogénio fosforilase por activação da fosfatase.

 Glicogénio Fosforilase

Fosforilação do resíduo
de serina 14

Liver Músculo
Activa independentemente dos niveis de Inibida por ATP e por glucose-6-P.
ATP e glucose- 6-P
Activada por AMP.
Glucose induz passagem de R a T

Regulação alostérica dependente do estado energético da célula. (Músculo) – Produção de energia.

Regulação por fosforilação através de sinais hormonais: epinefrina, insulina, glucagon (Fígado)
(Homeostase da glucose) – regulação a nível do organismo.
Aspartato transcarbamoilase – ATCase (2.1.3.2)
2. Transferases
2.1. Transferem grupos de 1 carbono
2.1.3. Carboxil e carbamoiltransferases
2.1.3.2. Aspartato carbamoiltransferase

12 subunidades: 6 subunidades reguladoras

6 subunidades catalíticas
 Regulação alostérica
da
Aspartato Transcarbamoilase (ATCase)

A ligação do CTP às subunidades reguladoras induz

alterações conformacionais que levam à transição do
estado R para o estado T.
A inibição da actividade pelo CTP é uma regulação
alostérica de feedback negativo.
Alterações conformacionais da aspartato transcarbamoilase durante a activação

Estado T

Estado R
 Enzimas digestivas
Calmodulina Enzimas do lisossoma

Moduladores: activadores ou Reversível – Fosforilação (glicogénio

inibidores fosforilase)
(Aspartato carbamoilase, Irreversível – Proteólise (Quimiotripsina)
Fosfofructocinase)