FOSFORILAÇÃO PARTE 1

1-Descreva as principais estruturas da anatomia bioquímica da mitocôndria.

A mitocôndria é composta por membrana externa, interna e matriz mitocondrial.

Membrana externa é permeável e contém pequenas moléculas e íons. A interna é
impermeável e contém as enzimas participantes da etapa da fosforilação oxidativa
(complexo I-IV e ATP-Sintase) e demais carreadores de elétrons. E a matriz tem as
enzimas do ciclo de Krebs e de outros processos oxidativos, além de muito metabólitos
solúveis. Possui também um espaço intermembrana.

2-Quais são os carreadores de elétrons? Quais as diferenças entre eles?

São o NAD+ e o NADP+, que são os aceptores móveis de elétrons (sofrem redução ao
receber um hidreto) na forma de NADH e NADPH. O FAD+ e o FMN são aceptores
associados a proteínas, que recebem um hidrogênio, formando uma semiquininona, que
é um radical livre estável. Lembrando que hidreto são dois elétrons e um prótons.

3-O que são e que tipo de reação as desidrogenases catalisam?

Desidrogenases são enzimas que catalisam reações de oxirredução nas vias metabólicas
na presença de um substrato reduzido ou oxidado e de aceptores ou carreadores de
elétrons.

4-Quais componentes participam da transferência de elétrons além das enzimas da

cadeia transportadora de elétrons?

Além do NADH, NADPH, FADH e FAPH existem as quinonas, os citocromos e as

proteínas ferro-enxofre.

5-Descreva o fluxo de elétrons e prótons em cada um dos complexos que compõem a

cadeia transportadora de elétrons.

Complexo 1 – ocorre a formação de ubiquinol através do nadh e ao mesmo tempo são

bombeado 4 prótons para o espaço intermembrana.

Complexo 2 – a energia liberada pela forma de elétrons da conversão do succinato a

fumarato possibilita a formação de mais ubiquinona em ubiquinol

Complexo 3 - ocorre a recepção dos 2 ubiquinol, que vão passar seus elétrons para 4
citocromo c, cada um com um elétron e mais 4 prótons são bombeados para o espaço
intermembrana
Complexo 4 – recebe os 4 citocromos c com 4 elétrons ao todo, esses elétrons se juntam
com o oxigênio formando água. Além disso são bombeados mais 2 prótons para o
espaço intermembrana

6-O que são, como e onde são geradas as espécies reativas de oxigênio (ERO)?

As EROs são espécies reativas que são formadas a partir da recepção do elétrons vindos
de radicais quinona pelo O. No complexo 4 ocorre a maior parte de sua formação. O
O2- (superóxido) é o mais expressivo. Dependendo da concentração, ele pode ser bom
ou ruim, em baixos níveis ele atua em eventos de sinalização celular. Em altas
concentrações ele pode causar danos a proteína, dna, causando até morte à célula.

7-Qual a importância das ERO?

Em baixas concentrações pode atuar na sinalização celular. Em alta concentração pode

causar danos moleculares, causando até morte celular.

8-Quais enzimas auxiliam na inativação dessas espécies?

Superóxido dismutase (forma H2O2) e Glutationa peroxidase (torna H2O2 inofensivo).

FOSFORILAÇÃO PARTE 2

1-Explique o modelo quimiosmótico.

De acordo com o modelo, a energia eletroquímica inerente à diferença de concentração

de prótons e à separação de cargas através da membrana mitocondrial interna (a força
próton-motriz) impulsiona a síntese de ATP, à medida que os prótons fluem
passivamente de volta à matriz, por meio de um poro para prótons na ATP-sintase.

2-Quais são os dois processos que são acoplados no chamado “acoplamento

quimiosmótico”?

O acoplamento refere-se à conexão obrigatória entre a síntese mitocondrial de ATP e o

fluxo de elétrons pela cadeia respiratória; nenhum dos dois processos pode prosseguir
sem o outro.

3-O que são moléculas desacopladoras? Cite um exemplo.

Certas condições e reagentes podem, no entanto, desacoplar a oxidação da fosforilação.
Alguns compostos químicos causam o desacoplamento sem romper a estrutura
mitocondrial. Desacopladores químicos incluem 2,4- dinitrofenol (DNP) e
carbonilcianeto-ptrifluormetoxifenilidrazona (FCCP), ácidos fracos com propriedades
hidrofóbicas que lhes permitem difundir prontamente através das membranas
mitocondriais. Moléculas podem desestabilizar o fluxo de prótons ou inativar a ATP-
Sintase

4-Como é a estrutura da ATP-sintase?

A ATP-sintase, também chamada de complexo V, tem dois componentes distintos: F1 ,

proteína periférica de membrana, e Fo (o indicando sensível à oligomicina), integral à
membrana. A F1 contém em sua estrutura subunidade beta, que participam efetivamente
(através de seu movimento rotacional) da síntese de ATP.

5-Se o ATP é estabilizado na superfície da ATP-Sintase, qual fator promove a liberação

do ATP da enzima?

Embora a ATP-sintase equilibre o ATP com ADP + Pi na ausência de um gradiente de

prótons, o ATP recém-sintetizado não sai da superfície da enzima. É o gradiente de
prótons que faz a enzima liberar o ATP formado em sua superfície. Para a síntese
continuada de ATP, a enzima precisa oscilar entre uma forma que liga ATP muito
fortemente e uma forma que libera ATP. A reação é endergônica e a energia livre
necessária para a liberação do ATP é fornecida pela força próton-motriz.

6-Quais são os 3 tipos de conformação da subunidade β da ATP-sintase? Explique cada

um.

1. Uma dada subunidade β começa na conformação β-ADP, que liga ADP e Pi do meio
circundante.

2. A subunidade agora muda de conformação, assumindo a forma β -ATP, que se liga

firmemente e estabiliza o ATP, gerando o pronto equilíbrio de ADP + Pi com ATP na
superfície da enzima.

3. Finalmente, a subunidade muda para a conformação βvazio, que tem baixa afinidade
por ATP, e o ATP recém-sintetizado deixa a superfície da enzima. Outra rodada de
catálise começa quando essa subunidade novamente assume a forma β -ADP e liga ADP
e Pi .

7-Explique como ocorre a catálise rotacional.

A catálise rotacional ocorre pela ação rotatória do eixo central gama, que roda de 120
em 120 graus. Cada parte da rotação corresponde a uma das formas da enzima. Uma
rodada do eixo central corresponde a formação do ATP pela enzima. Na próxima rodada
ela reinicia a formação de ATP

8-Como ocorre o movimento rotacional na porção Fo da ATP-sintase?

O próton presente no lado P da membrana interna da mitocôndria entra pelo meio do

canal presente na porção F0;

O próton desloca a arginina para a subunidade c adjacente;

A arginina gira, deslocando o H+ das asparaginas;

O H+ sai para o lado N (matriz mitocondrial);

As subunidades da porção F0 retonam a conformação original e o processo se repete,

9-Como ADP e Pi são enviados para a matriz mitocondrial?

São duas as formas principais de envio de ADP e Pi para a matriz mitocondrial. A

primeira é através da enzima adenina-nucleotídeo-translocase, que realiza antiporte, de
forma a bombear ATP (carga -4) para o espaço intermembrana e ADP (carga -3) para a
matriz mitocondrial. (esse transporte é favorecido pela carga membranar gerada pelo
gradiente de prótons).

Um segundo sistema de transporte de membrana essencial à fosforilação oxidativa é a

fosfato-translocase, que promove o simporte de um H2PO4 - e um H+ para a matriz. O
H2PO4- pode ser convertido em Pi, através de reações de oxirredução.

O ciclo de Krebs também produz ADP + Pi como produtos da via metabólica.´

10-Qual a importância dos sistemas de lançadeiras?

O sistema de lançadeiras é importante pois é o meio de haver NADH na matriz

mitocondrial, necessária para a ação do complexo 2 da cadeia transportadora de
elétrons. A lançadeira de NADH mais conhecida, que funciona em mitocôndrias de
fígado, rim e coração, é a lançadeira do malato-aspartato. O músculo esquelético e o
encéfalo usam uma lançadeira de NADH diferente, a lançadeira do glicerol-3-fosfato.

11-Qual a diferença entre os dois principais sistemas de lançadeiras visto nessa aula?
Os dois sistemas divergem da seguinte forma: o sistema de lançadeira do malato-
aspartato é fundamentado por diversas reações de oxirredução e de conversão
enzimática entre moléculas mediadoras de vias metabólicas, como o malato, oxalacetato
e o aspartato. O sistema funciona da seguinte forma: o malato na matriz mitocondrial se
oxida e reduz NAD+ em NADH + H+, sendo convertido em oxalacetato. O oxalacetato,
ainda na matriz, é convertido em aspartato, que consegue (através de um canal)
atravessar a membrana interna e ir até o espaço intermembrana. No espaço
intermembrana o aspartato é convertido em oxalacetato, que se reduz pela oxidação de
uma molécula de NADH, formando malato, que entra (por um canal) para a matriz e
reduz uma molécula de NAD+ em NADH + H+.

Já o sistema de lançadeira do glicerol-3-fosfato não atua de forma a realizar

oxirredução de mediadores de outras vias metabólicas, como a lançadeira malato-
aspartato. Esse sistema funciona a partir da Oxidação de NADH presente no espaço
intermembrana para a redução de uma molécula de di-hidroxiacetona fosfato em
glicerol-3-fosfato, que se oxida e reduz FAD+ em FADH2, que se reduz e oxida a
ubiquinona em ubiquinol, que segue para o complexo 3, mantendo o fluxo de energia
para a cadeira transportadora de elétrons.

GLICONEOGÊNESE

1-Qual a importância da gliconeogênese? Essa via é o inverso da glicólise?

A gliconeogênese é importante, pois atua na manutenção da homeostase da glicose

(nível de glicose no sangue). Sua atuação é regulada pela liberação de hormônios como
o glucagon e é expressiva em contexto de baixa ingestão de glicose, como em
momentos de jejum. Essa via não é o inverso da glicólise, pois, embora compartilhem 7
etapas, 3 etapas da via glicolítica (extremamente exergônicas na via glicolítica) são
irreversíveis – não participando da vida da gliconeogênese.

2-Explique o Ciclo de Cori.

Após exercícios vigorosos, o lactato produzido pela glicólise anaeróbia no músculo

esquelético retorna para o fígado e é convertido a glicose, que volta para os músculos
(que irá utilizá-lo para suas atividades) e é convertida a glicogênio (armazenamento de
glicose em cadeias longas) – circuito chamado de ciclo de Cori.

Quais são os 3 desvios que ocorrem na gliconeogênese?

Os desvios correspondem a 3 etapas irreversíveis na glicólise que não podem ocorrer na

gliconeogênese (etapas 1, 3 e 10 da glicólise). Para suprir essas lacunas, na
gliconeogênese essas etapas são contornadas da seguinte forma:
1- A primeira reação de contorno da gliconeogênese é a conversão de piruvato em
fosfoenolpiruvato (PEP). Ela pode ocorrer em 2 vias diferentes: Uma via é
predominante quando piruvato e alanina são os precursores glicogênicos. Nessa via o
piruvato é convertido em oxalacetato, depois em malato e finalmente vai para o citosol,
onde é novamente convertido em oxalacetato e depois em fosfoenolpiruvato, sendo uma
reação dependente de Mg2+ e GTP. Essa reação é irreversível, por o fosfoenolpiruvato
(por ser utilizado em várias vias metabólicas) é encontrado sempre em baixas
concentrações na célula

Uma segunda via predomina quando o lactato é o precursor glicogênico. Nessa via, o
lactato é convertido em oxalacetato e então diretamente em fosfoenolpiruvato, dando
continuidade a via gliconeogênica.

A segunda reação glicolítica que não pode participar da gliconeogênese é a fosforilação

da frutose-6-fosfato pela PFK-1. Como essa reação é altamente exergônica e por isso
irreversível, a geração de frutose-6-fosfato a partir de frutose-1,6-bifosfato é catalisada
por outra enzima dependente de Mg2+: a frutose-1,6-bifosfatase (FBPase-1), que
hidrolisa o fostato do C-1.

O terceiro contorno é a reação final da gliconeogênese, a desfosforilação da glicose-6-

fosfato para formar glicose. O inverso da reação da hexocinase exigiria a transferência
de um grupo fosforil da glicose-6-fosfato para ADP, formando ATP (reação
energeticamente desfavorável). A reação catalisada pela glicose-6-fosfatase não requer a
síntese de ATP, sendo a hidrólise simples de uma ligação éster fosfato. Essa enzima
ativada por Mg2+ é encontrada no lúmen do retículo endoplasmático de hepatócitos, de
células renais e das células epiteliais do intestino delgado apenas. Se outros tecidos
tivessem a glicose-6- fosfatase, essa atividade enzimática hidrolisaria a glicose-6-
fosfato necessária para a glicólise nesses tecidos.

Como ocorre a formação de PEP a partir de piruvato? E a partir de lactato?

Pode ocorrer de duas formas. O fosfoenolpiruvato pode ser sintetizado a partir de duas
vias, uma a partir de piruvato e outra a partir de lactato. Como são diferentes
precursores, as duas moléculas passam por vias diferentes, com enzimas diferentes, até
sua conversão em fosfoenolpiruvato.

A partir do piruvato, ocorrem mais conversões, onde o piruvato é convertido em

oxalacetato, depois em malato e finalmente vai para o citosol, onde é novamente
convertido em oxalacetato e depois em fosfoenolpiruvato, sendo uma reação dependente
de Mg2+ e GTP.

A partir do lactato, ele será convertido em oxalacetato e então diretamente para

fosfoenolpiruvato.
Explique a conversão de frutose-1,6-bifostato a frutose-6-fosfato.

Essa conversão não poderia ocorrer a partir da PFK-1 (já que é fortemente exotérmica
no sentido da formação da F16BP), mas ocorre a partir da ação de FBP-ase 1 (enzima
dependente de Mg2+). Essa enzima consegue realizar a conversão de Frutose 1-6
bifosfato em frutose 6 fosfato a partir da hidrólise do grupamento fosforil presente no
carbono 1 do substrato.

Explique a conversão de glicose-6-fosfato em glicose.

Essa conversão não poderia ocorrer no sentido contrário da glicólise, pois exigiria que a
hexocinase hidrolisase um grupo fosforil e o adicionasse em uma molécula de ADP,
formando ATP, o que é extremamente desfavorável energeticamente. Com isso, na
gliconeogênese, ocorre um desvio final, onde a enzima Glicose-6- fosfatase não requer a
síntese de ATP, conseguindo apenas realizar a simples hidrólise do grupo fosforil do
Carbono 6. Isso permite que a glicose saia da célula e seja utilizada em outros tecidos.

Por que a glicólise e a gliconeogênese são reguladas coordenadamente?

São regulados pois ocorrem em contextos fisiológicos distintos, atendendo a

necessidade diferenciadas. Se ambas as vias metabólicas ocorressem simultaneamente
ocorreria um gasto ineficaz de energia, obtendo nenhum benefício à nível celular e
tecidual.

Em um contexto de baixa concentração de glicose no sangue (pouca disponibilidade

nutricional e energética), alguns tecidos (através da ação do glucagon) consegue ativar a
via da gliconeogênse, fornencendo glicose para a corrente sanguínea (manutenção da
homeostase glicêmica).

Já em contexto de alta concentração de glicose no sangue (alta disponibilidade

energética) ocorre a ativação da via da glicólise (sujeita a regulação pela insulina), de
forma que a glicose é captada pelas células e internalizada, sendo utilizada
posteriormente para a formação de moléculas de ATP.

As etapas opostas nas vias glicolítica e gliconeogênica – catalisadas por PFK-1 e

FBPase-1 – são reguladas de uma forma coordenada e recíproca. Em geral, quando há
concentração suficiente de acetilCoA ou de citrato ou quando há uma alta de ATP, a
gliconeogênese é favorecida. Quando o nível de AMP aumenta, isso promove a glicólise
pela estimulação da PFK-1.

O que é um ciclo fútil?

O ciclo fútil se refere a uma situação em que reações opostas ocorrem em sequência,
sem produzir um resultado líquido benéfico em termos de energia ou substâncias
produzidas, e esse processo é ineficiente do ponto de vista energético. Um exemplo
disso são as etapas da gliconeogênese, quando ocorrerem ao mesmo tempo que a
glicólise.

Como a glicose-6-fosfatase é regulada?

A glicose 6 fosfatase pode ser regulada por hormônios como o glucagon (que a
estimula), que a estimula a hidrolisar fosforil do C6 da glicose 6 fosfato. Além disso, a
enzima possui um sítio alostérico que permite ligação com moléculas de glicose (alta
concentração de glicose inibe a atuação da enzima).

Qual a importância do AMP na regulação da PFK-1 e da FBPase-1?

A enzima PFK-1 é ativada pela alta concentração de AMP (indicativo de baixa

disponibilidade de energia). Já baixas concentrações de AMP (e alta concentração de
moléculas como ADP e TP) ativam a FBPase 1 (a enzima é fortemente inibida pelo
AMP, pois se há baixa disponibilidade de energia não há motivo para fazer glicose, pois
é um processo que requer injeção de energia).

Como a frutose-2,6-bifosfato atua na regulação da PFK-1 e da FBPase-1?

A regulação hormonal rápida da glicólise e da gliconeogênese é mediada pela frutose-

2,6-bifosfato, efetor alostérico das enzimas PFK-1 e FBPase-1

Quando a frutose-2,6-bifosfato se liga ao seu sítio alostérico na PFK-1, ela aumenta a

afinidade dessa enzima pelo seu substrato, frutose-6-fosfato, e reduz a afinidade pelos
inibidores alostéricos ATP e citrato. Em concentrações fisiológicas de seus substratos,
ATP e frutose-6-fosfato, e de seus efetores positivos ou negativos (ATP, AMP, citrato),
a PFK-1 está praticamente inativa na ausência da frutose-2,6-bifosfato, que tem efeito
oposto sobre a FBPase-1: ela reduz a afinidade pelo seu substrato, reduzindo a
gliconeogênese.

Como a formação/degradação da frutose-2,6-bifosfato é regulada?

A concentração celular do regulador alostérico frutose-2,6- bifosfato é ajustada pelas

taxas relativas de sua formação e degradação. Ela se forma pela fosforilação da frutose-
6-fosfato, catalisada pela fosfofrutocinase-2 (PFK-2) e é degradada pela frutose-2,6-
bifosfatase (FBPase-2). O equilíbrio dessas duas atividades no fígado, que determina o
nível celular da frutose-2,6-bifosfato, é regulado pelo glucagon e pela insulina.
Se há liberação de insulina, há ativação da PFK-2, que fosforila a Frutose-6-fasfato em
F26BP, que ativa a PFK1. Quando há liberação de glucagon, há a ativação da FBPase2,
que hidrolisa a F26BP em F6P, que ativa a FBPase 1 e inativa a PFK1.

A PFK-2 não participa da gliconeogenese diretamente, embora atua em conjunto com a

FBPase 2, na regulação da via a partir da síntese ou degradação da frutose 2-6 bifosfato,
que é inibidor da PFK-1 da via glicolítica e da gliconeogênese.

DESIDROGENASES oxidam e reduzem moléculas carreadoras e aceptoras de elétrons.

UBIQUINONA (totalmente oxidada) -> SEMIQUINONA (tem um H) -> UBIQUINOL

(totalmente reduzida).

Em contexto de baixo ATP, a célula prefere a glicólise. Em contexto de alto ATP, a

célula vai para gliconeogênese

O citrato é também um regulador alostérico da PFK-1, concentração alta de citrato

aumenta o efeito inibidor do ATP, reduzindo ainda mais o fluxo de glicose pela
glicólise.