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A RCH IVES OF BIOCHEMIST R" E DA BIOH I S T I C A

Vol. 304, n.º 2, 1 de agosto, pp. 429-433, 1993

Propriedades espectrais e físicas da superóxido dismutase

extracelular humana: uma comparação
com CuZn Superóxido Dismutase
Lena Tibell,*'† Roland Aasa, e Stefan L. Marklund§''
'S ymbicom AB, P.O. Box 1451, 5-901 24 Umeâ, Slmeden; †Department of Biochemistry, Umeâ Uniuensit y, 5-901 87 Umeâ,
Suécia; $Department of Biochemistry ond Biophysics, Chalmers Llniversit y of Technology, 5-412 96 Gothen6urg, !Swederi, e
§Department o/ Clinical Chemistry, Umeâ Universit y Hospital, 5-901 85 Umeâ, Suécia

Recebido em 26 de janeiro de 1993 e revisto em 20 de abril de 1993 0003-986t/93 $5.00

Direitos de autor *. 1993 por Academic Presfi, I nc.
Reservados todos os direitos de reprodução sob qualquer forma.
A comparação das sequências de aminoácidos sugeriu
semelhanças entre as porções do sítio ativo da glicoproteína
tetramérica, contendo Cu e Zn, a superóxido dismutase
extracelular (EC-SOD) e a CuZn-SOD dimérica. No
presente estudo, foram analisadas as propriedades espectrais
e físicas da EC-SOD p a r a aprofundar o conhecimento
sobre a enzima e alargar a comparação com a CuZn-SOD. A
EC-SOD apresenta um pico de absorvência a 652 m m ,
deslocado para azul cerca de 30 mm em comparação com a
CuZn-SOD. O coeficiente de extinção molar, 1G7 x ' cm '
por átomo de cobre, é semelhante ao das CuZn-SODs. Em
contraste com a CuZn-SOD bovina e humana, a EC-SOD
tem uma forte absorção ult r a v i o l e t a devido ao elevado
teor de aminoácidos aromáticos. O coeficiente de extinção a
280 gamas é de 1,73 ml mg ' cm '. O espetro de ressonância
paramagnética eletrónica é também semelhante ao da
CuZn-SOD bovina e humana, mas apresenta um A
ligeiramente mais elevado e uma diferença menor entreg e
gg. Estes resultados espectrais apoiam a noção de que os
locais activos das isoenzimas SOD são semelhantes, mas
com uma maior simetria tetragonal dos ligandos de cobre na
EC-SOD. O espetro de d i - croísmo circular da EC-SOD no
ultravioleta indica um elevado teor de n-hélices nas partes
amino-terminais e car- boxy-terminais que flanqueiam a
porção central homóloga do sítio ativo. À semelhança da
CuZn-SOD bovina, a EC-SOD apresenta uma resistência
física acentuada a t e m p e r a t u r a s elevadas, extremos de
pH e concentrações elevadas de ureia e cloreto de
guanidínio. Esta semelhança na r e s i s t ê n c i a física
sugere um papel central da porção homóloga do sítio ativo
para a integridade estrutural das isoenzimas SOD. - 'ee3A'^a
"mi'Pres-,Inc.

A A superóxido dismutase contendo Cu e Zn

(CuZn-SOD)2 foi a primeira isoenzima SOD a ser descrita

A quem deve ser dirigida a correspondência. Fax: 46 90-11 72 96. '

Abreviaturas utilizadas: CD, dicroísmo circular; EPR, ressonância para-
magnética eletrónica; SOD, superóxido dismutase; EC-SOD, SOD
extracelular; rhEC-SOD, EC-SOD humana recombinante; uv-vis, ultravioleta-
visível; CuZn-SOD, SOD contendo Cu e Zn.
(1). É composta por duas subunidades de 16 kDa, cada
uma contendo um átomo de Cu e um átomo de Zn. A
CuZn-SOD está localizada no citosol (2) ou nos
peroxissomas (3) das células eucarióticas, no entanto,
foram detectadas proteínas semelhantes/homólogas em
cloroplastos (4) e em algumas estirpes bacterianas (5).
Também foram descritas isoenzimas da SOD contendo
Mn (6) ou Fe (7).
Em 1982, foi descrita outra isoenzima da SOD (8).
Trata-se de uma glicoproteína secretora, composta
por quatro subunidades iguais de 30 kDa, contendo
cada uma delas um átomo de Cu e um átomo de Zn
(8, 9), e, uma vez que foi demonstrada pela primeira vez
no plasma (10), foi designada SOD extracelular (EC-
SOD). Não foi encontrada qualquer reatividade
imunológica cruzada entre a EC-SOD humana e a
CuZn-SOD humana (11). Apesar destas diferenças
físicas, a EC-SOD apresenta muitas semelhanças com
a CuZn-SOD. Ambas as isoenzimas catalisam
desproporções de primeira ordem de aniões superóxido
(8), as actividades específicas são semelhantes (8) e
ambas são inibidas por cianeto, azida,
dietilditiocarbamato e peróxido de hidrogénio
(11). Uma explicação potencial para estas semelhanças foi
encontrada quando um clone de cDNA que codifica a EC-
SOD humana foi sequenciado (12). As extremidades
amino e carboxi-terminal do polipéptido de 222
aminoácidos de comprimento não apresentam semelhanças
com a CuZn-SOD e com outras proteínas sequenciadas,
mas de His-96 a Gly-193 existe uma forte ho- mologia, de
cerca de 50Wo, com uma sequência correspondente na
CuZn-SOD. Utilizando os dados da estrutura de
cristalografia de raios X disponíveis para a CuZn-SOD
bovina (13), concluiu-se que todos os aminoácidos que
ligam os átomos de Cu e Zn, as cisteínas que formam a
ponte dissulfureto intra-subunidade e algumas outras
características essenciais também ocorrem na EC-SOD
(12). Assim, p a r e c e que os sítios activos da CuZn -
SOD e da EC- SOD são semelhantes. No entanto,
concluiu-se, através da análise de homologias, que a ligação
evolutiva com a CuZn-SOD eu-cariótica é distante (12) e
que as diferenças de aminoácidos em relação à CuZn-SOD
podem ter atingido o máximo possível (14).
Os dados sobre as propriedades espectrais e físicas da
EC-SOD são escassos devido à disponibilidade limitada
da proteína nativa,
429
430 TIBELL, A ASA, E MARKLUND

valor g QUADRO I
240 2.20 2OO Parâmetros EPR das isoenzimas da SOD

Enzima A, (10 ' cm ')

rhEC-SOD 2.265 160

CuZn -SOD humana 2.263 251
CuZn-SOD bovina 2.263 147

Nota. Os dados foram obtidos a partir dos registos apresentados na Fig. 1.

A titulação da rhEC-SOD por cianeto em tampão fosfato

de potássio 50 mM foi seguida de EPR (Fig. 2). O cianeto
0.28 0.30 0.32 0.34 parece ligar-se estequiometricamente e a l i g a ç ã o resulta
Densidade do fluxo magnético (T) em espectros semelhantes aos do cianeto de- rivativo da
CuZn-SOD bovina (17-21). A assimetria na "N-splitting"
FIG. 1. Espectros EPR das isoenzimas da SOD. A, EC-SOD nativa; B, (Fig. 2E) é causada pela mistura de6 "Cu e6 "Cu em
rhEC- SOD; C, CuZn-SOD humana; D, CuZn-SOD bovina. As enzimas
foram dissolvidas a 5, 1, 5 e 16 mg/ml, respetivamente, em fosfato de sódio 50 abundância natural.
mM, pH 6,5. Frequência de micro-ondas, 9456 MHz; potência de micro- Espectros de Opticol. A rhEC-SOD tem uma forte
ondas, 2 m W; amplitude de modulação, 2 mT; temperatura, 30 K. absorção uv centrada a 280 nm com um ombro a 288 nm
(espetro não mostrado). O coeficiente de extinção a 280 nm
foi determinado como sendo 1,73 m-l mg*' - cm'. O espetro
uma situação agora alterada pela disponibilidade de EC-
ótico visível da rhEC-SOD apresenta um pico largo
SOD humana recombinante (rhEC-SOD) (9). Para
centrado em 652 nm, com ombros a cerca de 610 e 710 nm
alargar os conhecimentos sobre a EC-SOD e aprofundar
(Fig. 3). O coeficiente de extinção a 652 nm é de 167 M
a comparação com a CuZn- SOD, apresentamos aqui os
'cm' por átomo de cobre. A ligação do cianeto aos átomos
espectros de ultravioleta-visível (uv-vis), de ressonância
de cobre no sítio ativo resultou, no caso da rhEC-SOD, num
paramagnética eletrónica (EPR) e de dicroísmo circular
desvio para azul do pico de 652 nm para 580 nm. O espetro
(tCD), bem como as propriedades de estabilidade da EC-
uv da rhEC-SOD quase não foi afetado pelo cianeto (dados
SOD.
não apresentados), enquanto o espetro uv da
MATERIAIS E MÉTODOS
Superóxido dismutases. A EC-SOD foi isolada de cordões umbilicais
humanos ou de meios de cultura de células de ovário de hamster chinês valor g
transfectadas que segregam EC-SOD humana recombinante (9). As CuZn- 2.40 2.20
SOD bovina e humana foram obtidas da Boehringer Mannheim GmbH
(Mannheim, Alemanha) e da Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO),
respetivamente.
Análise da SOD. A atividade enzimática da SOD foi determinada pelo
método espetrofotométrico direto com superóxido de potássio (15)
modificado (16). As concentrações nas soluções utilizadas para as
experiências foram obtidas principalmente a partir das determinações da
atividade (1 U - 8,8 rig EC-SOD) e das determinações da absorvância a
280 rim IEg
1,73 ml mg ' cm '). Estes parâmetros foram inicialmente calibrados por
análise de aminoácidos em conjunto com medições de atividade e
absorvância
(9). Além disso, os teores de Cu e Zn n a s soluções utilizadas foram
analisados por espetroscopia de absorção atómica num aparelho Perkin-
Elmer Zeeman 303 + HGA, tendo-se verificado que eram de 1,06 e 1,06,
respetivamente, por subunidade da rhEC-SOD, e de 0,94 e 0,98,
respetivamente, por subunidade da CuZn- SOD bovina.
Espectroscopia. Os espectros de EPR foram registados a cerca de 30
K num espetrómetro Bruker ER 200 D-SRC equipado com um crióstato de 0.28 0.30 0.32 0.34
hélio Oxford Instruments ESR-9. Os espectros de CD foram registados Densidade do fluxo magnético ( T J
numa célula de 2 mm a 25° C com um espectropolarímetro Jasco 600 e
FIG. 2. Titulação de cianeto da rhEC-SOD seguida de EPR. Concentração
os espectros de absorção uv-vis num espetrofotómetro Cary 4/5.
de proteína, 10,8 mg/ml. O rácio cianeto/Cu'" é 0, 0,4, 0,9 e 1,9 em A, B,
C e D, respetivamente. A inserção E é uma linha hiperfina expandida e
RESULTADOS amplificada do espetro D. Frequência de micro-ondas, 9395 MHz;
potência de micro-ondas, 0,63 m W; amplitude de modulação, 0,4 mT;
Espectros EPR. Os espectros EPR do cobre da EC- temperatura 35 K.
SOD humana nativa e da EC-SOD humana
recombinante são idênticos e também muito semelhantes
aos espectros EPR do cobre da CuZn-SOD humana e
bovina (Fig. 1). Os p a r â m e t r o s EPR são apresentados
no quadro I.
 ESTUDOS ESPECTRAIS DA SUPERÓXIDO DISMUT'ASE EXTRACELULAR HUMANA
Comprimento de onda (nm}
FIG. 3. Espectros ópticos da rhEC-SOD na ausência (-) e na presença (- - - -
) de cianeto (20 mM). A enzima foi dissolvida em fosfato de sódio 50 mM,
pH 7,6, a 29,4 mg/ml (1,23 mM Cu).
A CuZn-SOD é fortemente afetada na região Phe (250-265
nm) (22).
Espectros de CD. Os espectros de CD da rhEC-SOD e
da CuZn-SOD bovina foram registados na região uv (Fig.
4), bem como na região visível (Fig. 5). Os espectros de
CD na região uv das enzimas eram semelhantes. No
entanto, a rhEC-SOD tem um ombro na região de 220-
235 nm que não está presente na CuZn-SOD e o mínimo
foi ligeiramente deslocado para azul na rhEC-SOD em
comparação com a CuZn-SOD bovina (Fig. 4). Os
espectros de CD na região do visível (Fig. 5) apresentam
uma forte semelhança na forma, mas o espetro da rhEC-
SOD está deslocado para azul (máximo a cerca de 575
nm) em comparação com o espetro da CuZn-SOD bovina
(máximo a cerca de 610 nm).
Estabilidade. As estabilidades térmicas da rhEC-SOD
e da CuZn-SOD bovina são apresentadas na Fig. 6. As
estabilidades das isoenzimas são elevadas e semelhantes
e ambas são abruptamente inactivadas a temperaturas
superiores a 80°C.
rEC-SOD
1O tdegrees- cm - dmol )
-5
MRC
- 10
Comprimento de onda (nm)
FIG. 4. Espectros de CD na região uv de rhEC-SOD (-) e CuZn -SOD
bovina {-) em fosfato de sódio 50 mM, pH 7,6. As concentrações
proteicas foram de 0,20 mg/ml (8,3 pM Cu) e 2,0 mg/ml (125 pM Cu),
respetivamente.
431
500 7O0
FIG. iS. Espectros de CD na região visível de rhEC-SOD (-) e CuZn-SOD
bovina (-) em fosfato de sódio 50 mM, p H 7,6. As concentrações proteicas
foram de 75 mg/ml (3,1 mM Cu) e 100 mg/ml (6,25 mv Cu),
respetivamente.
O efeito do pH nas actividades enzimáticas é
apresentado na Fig. 7. Ambas as enzimas apresentaram
uma elevada resistência no lado alcalino até ao pH 12. A
resistência ácida foi menos acentuada e ambas as
enzimas começaram a perder atividade abaixo do pH 5,0,
sendo a rhEC-SOD ligeiramente mais suscetível.
Em geral, a rhEC-SOD foi muito resistente a
concentrações elevadas de ureia e cloreto de guanidínio
(Quadro II).
DISCUSSÃO
A CuZn-SOD bovina e humana foi investigada
utilizando várias técnicas espectroscópicas. As estruturas
em torno do ião Cu cataliticamente ativo e do ião Zn
estrutural estão especialmente bem caracterizadas (21,
23). A simetria dos ligandos em torno dos metais nestas
enzimas parece ser quase idêntica, com os ligandos do
ião Cu a formarem um plano quadrado tetraédrico
distorcido, enquanto a geometria do ligando de Zn é
tetraédrica com uma forte distorção em direção a uma
conformação piramidal trigonal (14, 23, 24).
O espetro visível da rhEC-SOD (Fig. 3) apresenta um
pico de absorção largo a 662 rim, com um coeficiente de
extinção de
bCuZn SOD
Atividade da SODI
-5
&I
-10
Temperatura I °C )
FIG. 6. Estabilidade térmica da rhEC-SOD (f\} e da CuZn-SOD bovina
(O). As enzimas (10 mg/ml) foram incubadas em fosfato de sódio 50
mM, pH 7,6, às temperaturas indicadas durante 30 minutos antes do
ensaio direto da atividade da SOD.
432 TIBELL, AASA, E MARK LUND

' O O cianeto é um inibidor potente da EC-SOD, bem

como da CuZn-SOD. O máximo de absorção visível da
O rhEC-SOD (Fig. 3) e da CuZn-SOD bovina (17) é
deslocado para um comprimento de onda inferior pelo
cianeto. O desvio para azul da EC-SOD é menor do que o
Atividade da

da CuZn-SOD, 70 e 140 nm (17), respetivamente. Os

- efeitos do cianeto nos espectros EPR das duas isoenzimas
SOD (%)

são quase idênticos (Fig. 2) (17- 21). Tal como indicado

pelo EPR, o cianeto produz um ambiente mais axial em
torno do Cu com uma maior distorção tetragonal tanto
na EC-SOD como na CuZn-SOD (20).
7 11 Um estudo das sequências homólogas alinhadas da EC-
SOD e da CuZn-SOD bovina, em conjugação com a
estrutura tridimensional desta última enzima (13), permite
concluir que a SOD é uma enzima de alta qualidade.
FIG. 7. O efeito do pH na estabilidade da rhEC-SOD (A) e da CuZn-SOD
indica que os loops 6,5 e 7,8 (terminologia da Ref. 13)
bovina (O). As enzimas (10 mg/ml) foram incubadas a 26°C durante 1 h que formam a maior parte do sítio ativo são semelhantes.
em tampões de 50 mM (citrato de sódio, citrato-fosfato de sódio, fosfato No entanto, no "loop de ligação ao Zn" 6,5 há uma
de sódio, 2-amino-2-metil-1-propanol HCI ou ácido 3-{ciclohex-iaminoJ deleção de seis aminoácidos na EC-SOD em comparação
-1-propano sulfónico de sódio) antes do ensaio direto da atividade da com todas as CuZn-SODs sequenciadas, incluindo as
SOD.
bacteriocupreínas
(14). Esta "deleção" deve resultar numa curva apertada
que influencia os ligandos de Zn e os ligandos do átomo
O pico da CuZn-SOD de mamíferos (1, 4, 5, 17, 25- 27). O de Cu estreitamente espaçado, o que pode explicar as
pico é, no entanto, deslocado para o azul cerca de 30 aro em diferenças espectrais observadas. A principal conclusão
comparação com as CuZn-SOD de mamíferos (1, 17, 20, 25- dos estudos espectrais, no entanto, é que os locais activos
27) plantas (4), e as bacteriocupreínas (5). O espetro da são muito semelhantes, de acordo com estudos anteriores
rhEC-SOD é também mais complexo, com aparentes sobre cinética (8) e inibidores (11) e análise de
sombras a flanquear o pico. Os espectros de CD na região semelhanças de sequência (12).
visível da EC-SOD e da CuZn-SOD bovina (Fig. 5) Concentrando-nos nas regiões fora da porção central
contêm dois picos principais quase idênticos em força do sítio ativo, verificamos que a EC-SOD tem
rotacional e de sinal oposto. No entanto, o máximo do propriedades estruturais que são diferentes das da CuZn-
pico positivo está centrado em 575 nm para a rhEC-SOD e SOD. A EC-SOD é tetramérica, glicosilada e contém 222
em 610 nm para a CuZn-SOD bovina, enquanto os aminoácidos por subunidade, enquanto a CuZn-SOD é
mínimos dos picos negativos são provisoriamente dimérica, não glicosilada e contém cerca de 150
atribuídos a 750 e 770 nm, respetivamente. O espetro de
aminoácidos por subunidade (12, 14). Algumas destas
CD da CuZn-SOD bovina é muito semelhante a um
diferenças reflectem-se nas características espectrais. Em
espetro publicado anteriormente (28). Considera-se que o
contraste com a CuZn-SOD bovina e a CuZn-SOD
máximo de absorção a 680 nm da CuZn-SOD se deve
humana (1, 20, 22, 25, 26), a EC-SOD tem uma forte
predominantemente aos quatro ligandos de histidina do
absorção uv centrada em 280 nm, com um ombro
ião Cu (13, 17, 29). As semelhanças nos espectros na
região do visível entre a EC-SOD e a CuZn-SOD, e a
observação de que todas as quatro histidinas que são QUADRO II
ligandos na CuZn-SOD se encontram na sequência da
EC-SOD, indicam que os ligandos de cobre são Estabilidade da rhEC-SOD (2,5 mg/ml, 83,3 pM
Cu) em soluções desnaturantes
"idênticos"
na CuZn-SOD e na EC-SOD. Cloreto de Atividade residual
Os espectros EPR da EC-SOD e da CuZn-SOD en- pH Ureia (M) guanidínio
zimas apresentaram apenas pequenas diferenças (Fig. 1) (ver (M}
também
8° - 100
Refs. 17-21, 27). Assim, a estrutura em torno do cobre deve 8° 8' 61
ser muito semelhante nestas isoenzimas da SOD. No 8° - 4' 42
entanto, o desvio da simetria tetragonal parece ser um 8° - 6' 40
pouco menor na EC-SOD, a julgar pelo valor ligeiramente 10 8' - 0.6
superior de A, e pelo aspeto mais estreito da estrutura 10 - 4 25
10' - 6' 0
perpendicular, incaouma diferença menor entre g, e gq (Fig.
d
1, Quadro I). Isto é certamente verdade em comparação Nota. A atividade da SOD foi medida após 150 min de incubação a 25°
com a CuZn-SOD bovina, que apresenta uma divisão C.
rômbica bastante grande já observada no espetro D (Fig. 1), ° Em Tris-HCI 50 mM, pH 8,0.
Em carbonato de sódio 50 mM, pH 10,0.
mas mais facilmente observada a uma frequência de micro- Para além do agente desnaturante, foram adicionados à solução 1 mM de
ondas mais elevada (18). O desvio para azul no espetro EDTA e 50 mM de NaC1.
visível (Fig. 3) pode também ser uma indicação de uma Para além do agente desnaturante, foi adicionado à solução 1 mM
maior simetria na EC-SOD (30). de ditiotreitol.
 ESTUDOS ESPECTRAIS DE DESM NITASE DE PERÓXIDO EXTRA-CELULAR HUMANA
a 288 nm (provavelmente dado por Trp). A diferença é
facilmente explicada pelo elevado teor de aminoácidos
aromáticos na EC-SOD, sete Phe, três Tyr e cinco Trp
por subunidade, enquanto a CuZn-SOD bovina e humana
contém quatro Phe, um Tyr e zero Trp e quatro Phe,
zero Tyr e um Trp, respetivamente. O espetro de CD na
região uv da CuZn-SOD bovina assemelha-se aos
encontrados na literatura (26, 28). A CuZn -SOD bovina
contém 46Po de estrutura Q, 48% de loops e 5% de a-
hélice (13). O espetro de CD da rhEC- SOD tem uma
forma semelhante na região 180-220. No entanto, a banda
negativa da EC-SOD é ligeiramente deslocada para um
comprimento de onda inferior (194-195 nm) em
comparação com a CuZn- SOD bovina (cerca de 198 nm).
Além disso, há um ombro na região 220-235 nm do
espetro da rhEC-SOD que está ausente na CuZn-SOD
bovina (28) e na CuZn- SOD humana (26). Este facto
pode indicar que a EC-SOD contém mais estrutura a-
helical (31) do que a CuZn-SOD. Se se considerar que a
parte central da EC-SOD é estruturalmente semelhante à
da CuZn-SOD, isso implica que as partes amino-terminal
(resíduos 1-95) e carboxi-terminal (resíduos 194-222)
contêm quantidades significativas de elementos
estruturais a-helicais.
Tal como a CuZn-SOD, verificou-se que a rhEC-SOD
resiste a temperaturas elevadas (Fig. 6) e a extremos de
pH (Fig. 7), especialmente no lado alcalino. A resistência
à ureia e ao cloreto de guanidínio parece ser mais ou
menos semelhante a resultados anteriores obtidos com a
CuZn-SOD bovina (23, 32, 33). Parece que, apesar das
diferenças estruturais e da separação evolutiva, existem
semelhanças acentuadas no que respeita à resistência
física entre a EC-SOD e a CuZn- SOD. A resistência
pode dever-se às propriedades das porções conservadas
do sítio ativo do núcleo central da isoen-
zimas.
AGRADECIMENTOS
Agradece-se a competente assistência técnica das senhoras Agneta
Öberg e Helen Gruffman. Agradece-se à SYMBI COM AB, Umeå,
Suécia, o fornecimento da rhEC-SOD. O estudo foi apoiado pelo Swedish
Natural Science Research Council, Grant 9204.
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