Técnicas de

Microbiologia
Aula 3
Preparação de
amostras para
microscopia óptica

Tshilombo Edmond
A Objectivo geral
da Aula
 Descrever um microscópio composto a luz.
 mencionar e explicar a função de cada parte.

B Objetivos específicos
da Aula
 Diferenciar poder de ampliação, poder de resolução e
limite de resolução.

 Usar as unidades de medições como o mm, micrometro,

nanometro e Angtron.

Explicar qual a diferença entre a microscopia eletrônica e a

microscopia óptica.
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Preparação de amostras para
microscopia óptica

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 Preparação de amostras para
microscopia óptica
 A maioria dos microrganismos aparece quase incolor
quando observada por meio da microscopia de campo
claro, devemos prepará-los para a observação.

 Uma das formas de preparação da amostra é a

coloração (corar).
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 Preparação de amostras para
microscopia óptica

A perfeita visualização dos microrganismos e/ou das suas

estruturas só é possível se, além da escolha do tipo mais
eficiente de microscopia, a preparação estiver adequada.

A escolha do tipo de preparação depende da informação

desejada e do microrganismo a ser avaliado.

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 Preparação de amostras para
microscopia óptica
Técnica a fresco

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 Preparação de amostras para
microscopia óptica
Técnica a fresco

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LÂMINAS

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Técnica a fresco Preparação de amostras para
microscopia óptica

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Técnicas fixadas e coradas Preparação de amostras para
microscopia óptica
A maioria das observações iniciais dos microrganismos
é feita por meio de preparações coradas.
Um esfregaço é uma preparacao sobre a superfície da
lâmina onde um filme delgado de material contendo os
microrganismos é espalhado quando uma amostra
precisa ser fixada, deixado para secar ao ar.
Antes que os microrganismos possam ser corados, no
entanto, eles precisam ser fixados (aderidos) à lâmina
microscópica.
A fixação simultaneamente
- destrói os microrganismos e os fixa na lâmina.
- preserva várias partes dos micróbios em seu estado
natural com apenas um mínimo de distorção.
A Coloração significa simplesmente corar os
microrganismos com um corante que enfatize certas
estruturas.
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 Preparação de amostras para
Técnicas fixadas e microscopia óptica
coradas
Os corantes são sais compostos por um
íon positivo e um íon negativo, um dos
quais é colorido e conhecido como
cromóforo.

A cor dos chamados corantes básicos

está no cátion; a dos corantes ácidos,
está no ânion.

As bactérias são levemente carregadas

negativamente em pH 7.
Assim, o cátion colorido em um corante
básico é atraído pela célula bacteriana
carregada negativamente.

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 Preparação de amostras para
Técnicas fixadas e microscopia óptica
coradas
Os corantes básicos, que incluem:
-o cristal violeta,
-o azul de metileno,
-o verde de malaquita e
-a safranina,

São mais comumente utilizados que os corantes ácidos.

Os corantes ácidos não são atraídos pela maioria dos tipos de bactérias
porque os íons negativos do corante são repelidos pela superfície
bacteriana carregada negativamente; assim, a
coloração cora o fundo.

A preparação de bactérias incolores contra um fundo colorido é chamada

de coloração negativa.
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 Preparação de amostras para
Técnicas fixadas e microscopia óptica
coradas

Para aplicar corantes ácidos ou básicos, em Microbiologia usa se três tipos de técnicas
de coloração:
Simples
Diferencial
Especial. Tshilombo Edmond
Técnicas fixadas e Preparação de amostras para
coradas microscopia óptica

Uma coloração simples é uma solução aquosa ou alcoólica de um único corante

básico.

O objetivo primário de uma coloração simples é destacar todo o microrganismo, para

que as formas celulares e as estruturas básicas fiquem visíveis.

Essa coloração é aplicada ao esfregaço fixado por um determinado período de tempo

e, então, é lavada. A lâmina é seca e examinada.

O mordente, uma substância química (algumas vezes) é adicionada à solução para

intensificar a coloração. o mordente tem a função de:

aumentar a afinidade de uma coloração por uma amostra biológica;

revestir uma estrutura (como um flagelo) para torná-la mais espessa e
mais fácil de ser vista após ser corada.

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 Preparação de amostras para
Técnicas fixadas e microscopia óptica
coradas
Exemplo de de alguns corantes simples comumente utilizados em
laboratório são:
• o azul de metileno,
• a carbolfucsina,
• o cristal violeta e
• a safranina

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Técnicas fixadas e Preparação de amostras para
microscopia óptica
coradas

As colorações diferenciais reagem de forma diferente com

diferentes tipos de bactérias e, assim, podem ser utilizadas para
realizar a distinção entre elas.

As colorações diferenciais mais frequentemente utilizadas para

bactérias são:
 a coloração de Gram e
 a coloração acidorresistente.

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Técnicas fixadas e Preparação de amostras para
microscopia óptica
coradas
- coloração de Gram
A coloração de Gram foi desenvolvida em 1884 pelo bacteriologista dinamarquês
Hans Christian Gram. Procedimentos de coloração mais úteis, pois classifica as
bactérias em dois grandes grupos: gram-positivas e gram-negativas.

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Técnicas fixadas e Preparação de amostras para
microscopia óptica
coradas
- coloração de Gram

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microscopia óptica
coradas
- coloração de Gram

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Técnicas fixadas e Preparação de amostras para
microscopia óptica
coradas
- coloração acidorresistente

a coloração acidorresistente, que se liga fortemente apenas às bactérias que

apresentam um material ceroso em suas paredes celulares.

Essa coloração é utilizada para a identificação de todas as bactérias do gênero

Mycobacterium, incluindo os dois patógenos importantes
Mycobacterium tuberculosis, o agente causador da tuberculose, e Mycobacterium
leprae, o agente causador da hanseníase.

Essa coloração também é utilizada na identificação de linhagens patogênicas do gênero

Nocardia.

As bactérias dos gêneros Mycobacterium e Nocardia são acidorresistentes.

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Técnicas fixadas e Preparação de amostras para
microscopia óptica
coradas
- coloração acidorresistente

As bactérias acidorresistentes, uma vez coradas com

carbolfucsina e tratadas com álcool-ácido,
permanecem coradas em cor-de-rosa ou vermelho,
uma vez que retêm a coloração da carbolfucsina.

As bactérias que não são acidorresistentes, quando

coradas e tratadas da mesma forma e, em seguida,
coradas com azul de metileno, aparecem azuis, uma
vez que perdem a coloração da carbolfucsina e
tornam-se aptas a aceitar a coloração do azul de
metileno.

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Técnicas fixadas e Preparação de amostras para
microscopia óptica
coradas
especial

As colorações especiais são utilizadas para corar porções dos

microrganismos, como

Os endósporos,
Os flagelos ou
Os cápsulas.

Algumas vezes usada como auxiliar de diagnósticos.

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Técnicas fixadas e Preparação de amostras para
microscopia óptica
coradas
especial

A cápsula é uma uma cobertura gelatinosa que muitos

microrganismos contêm. Na microbiologia médica, a
demonstração da presença de uma cápsula é um modo de
determinar a virulência do organismo, o grau em que um
patógeno pode causar doença.

Utilizada para demonstrar a presença de

cápsulas.

Uma vez que as cápsulas não reagem com a

maioria dos corantes, apresentam-se como
halos incolores em torno das células
bacterianas, destacando-se contra um fundo
escuro.
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Técnicas fixadas e Preparação de amostras para
microscopia óptica
coradas
especial

Um endósporo é uma estrutura especialmente resistente,

dormente, formada dentro de uma célula que protege a
bactéria decondições ambientais adversas.

Utilizada para detectar a presença de

endósporos nas bactérias. Quando o verde
malaquita é aplicado a um esfregaço de células
bacterianas fixado pelo calor, o corante penetra
nos endósporos e os pinta de verde. Quando a
safranina (vermelha) é adicionada, cora o
restante das células de vermelho ou cor-de-rosa

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Técnicas fixadas e Preparação de amostras para
microscopia óptica
coradas
especial

Os flagelos bacterianos são estruturas de locomoção muito

pequenas para serem vistas ao microscópio óptico sem
coloração.

Utilizada para demonstrar a presença de

flagelos.
Um mordente é usado para aumentar os
diâmetros dos flagelos até que se tornem
visíveis microscopicamente quando
corados com carbolfucsina

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 Leitura de esfregaços
(contagem de elementos e diagnóstico
por imagem)
 Três tipos de varredura
(screening)
 1o tipo: horizontal

 2o tipo: vertical (mais

recomendado)
 3o tipo: usado em
revisão de lâminas
previamente negativas
(re-screening), pelo
menos 30 campos por 1
a 2 min Tshilombo Edmond