Biologia Celular e Molecular

Biologia Celular e Histologia

Sinalização Celular

9 de Dezembro de 2019
cvaz@ubi.pt
Recetores associados à proteína G

R associados à
proteína G

Mediadores
intracelulares

cAMP Ca2+
 Algumas proteínas G regulam a síntese de cAMP
cAMP modulando a actividade da adenilciclase

[cAMP]intracelular ~ 10-8 - 10-7 M (repouso)

[cAMP]in ~ 10-8 M [cAMP]in ~ 10-6 M

Adenilciclase:
 Proteína transmembranar
 Domínio catalítico no lado citosólico
da membrana plasmática
 Conversão ATP  cAMP

cAMP é instável  destruição rápida e

contínua (fosfodiesterase)
Proteínas Gs (estimulatórias) e Gi (inibitórias)

Ativa Aumenta níveis

Proteína Gs
adenilciclase de cAMP

Diminui níveis de cAMP

Inibe mas atua também na
Proteína Gi
adenilciclase regulação direta de
canais iónicos
Proteínas G: subclasses e efeitos celulares
cAMP Regulação da síntese de cAMP pela proteína G s

Adrenalina que se liga a recetores

β adrenérgicos
 Efeito da toxina da cólera no ciclo de activação e inactivação da Gsa

Principal sintoma da cólera: diarreia aquosa e abundante causada por fluxo de água do sangue
para o lúmen intestinal através das células epiteliais do intestino,
podendo levar à morte por desidratação.

Toxina da cólera:
- peptídeo produzido pela bactéria Vibrio cholerae;
- Heterodímero com actividade enzimática que
catalisa a transferência de ADP-ribose do NAD+
citosólico para a subunidade G sa .

Gsa permanece no estado activo

Activação contínua da adenilciclase

 cAMP (100 × ou mais)

 Fluxo de água do sangue para o lúmen do intestino

cAMP Regulação da síntese de cAMP pela proteína G i

Recetores α2
Adrenalina adrenérgicos
Proteína Gi

Subunidade αi/ Subunidade βγ

GTP

Inibe - Inibe ciclase de forma

adenilciclase de direta
forma direta -Liga subunidades αs
livres prevenindo a
ativação das ciclses
Respostas celulares mediadas por aumentos nos níveis de cAMP
cAMP cAMP exerce efeito através da ativação da enzima PKA

PKA (proteína cinase dependente de cAMP):

catalisa a transferência do grupo fosfato terminal do ATP para resíduos de serina e
treonina específicos em determinadas proteínas alvo, regulando a sua actividade.

PKA (estado inactivo):

2 subunidades catalíticas e 2 subunidades
reguladoras

PKA tipo I: citosol

PKA tipo II: membranas plasmática e
nuclear, membrana externa da
Actividade de cinase mitocôndria e microtúbulos

Uma vez activadas, as subunidades catalíticas migram para o núcleo (onde

podem fosforilar proteínas reguladoras de genes), enquanto que as
subunidades reguladoras permanecem no citoplasma
 Respostas mediadas pelo cAMP
Resposta Rápida Resposta Lenta :

somatostatina
Glândula
Stress Supra-Renal Adrenalina

Recetores β Aumento Aumento

adrenérgicos cAMP PKA ativa

GPK – cinase da fosforilase do glicogénio GS- Glicogénio Sintase

GP – fosforilase do glicogénio

Glicose disponível no músculo para

fornecimento de ATP CRE – cAMP response element
CREB – CRE-binding protein
Inibição da síntese de glicogénio CBP – CREB-binding protein
(Resposta em Segundos)

As fosfatases (I, IIA, IIB, IIC) tornam transitórios os

Alteração ao nível da transcrição de genes
efeitos da PKA e de outras proteínas cinases
(horas)
 Ca2+ Ca2+ como segundo mensageiro
Muitos sinais extracelulares (não só os que operam via proteínas G) induzem aumentos nos
níveis citosólicos de Ca 2+.

Início do desenvolvimento
embrionário

Ca2+
Células musculares contracção
Ca2+
Células nervosas secreção

A concentração de Ca 2+ no citosol é, normalmente, mantida muito baixa (~10-7 M), enquanto que a sua
concentração no fluido extracelular (~10-3 M) e no lúmen do retículo endoplasmático é elevada

Elevado gradiente electroquímico que tende a transportar Ca2+ para o citosol através da membrana plasmática
e da membrana do retículo endoplasmático.

Quando um sinal transitoriamente abre os canais de Ca2+, a concentração de Ca2+ no citosol aumenta
abruptamente para valores 10 - 20 vezes superiores, activando processos dependentes de Ca2+ na célula.
 Na célula em repouso, a concentração de Ca 2+ no citosol é mantida baixa (da ordem dos nM )
através de vários mecanismos:

 Bombas de Ca2+ na membrana plasmática: utilizam a energia da hidrólise do ATP para bombear Ca2+ do citosol para o
meio extracelular;

 Trocador Na+/Ca2+ na membrana plasmática: acopla o efluxo de Ca2+ com o influxo de Na+ (atuam quando existem
níveis de Ca2+ extremamente elevados pois possui baixa afinidade para o Ca2+);

 Bombas de Ca2+ na membrana do retículo endoplasmático: permitem a acumulação de grandes quantidades de

Ca2+ a partir do citosol, contra o gradiente de concentração, mesmo quando os níveis de Ca2+ no citosol são baixos;

 Bombas de Ca2+ (baixa afinidade, elevada capacidade) na membrana interna da mitocôndria: utilizam o gradiente
electroquímico gerado através da membrana, durante a transferência de electrões na fosforilação oxidativa, para captar Ca2+ a
partir do citosol;

 Moléculas que ligam Ca2+ com elevada afinidade no citoplasma

Existem 3 tipos de canais de Ca 2+ que medeiam esta sinalização:

 Canais de Ca2+ sensíveis à voltagem na membrana plasmática: abrem em resposta à despolarização da

membrana e permitem, por exemplo, que o Ca2+ entre nos terminais nervosos activados e desencadeie a secreção de
neurotransmissores

 Canais de Ca2+ sensíveis a IP3: permitem o fluxo de Ca2+ do retículo endoplasmático para o citosol quando a via

dos fosfoinositóis é activada

C ytosol

Endoplasmic r eticulum

 Receptores de rianodina: reagem a uma alteração do potencial da membrana plasmática, libertando Ca2+ do retículo
sarcoplasmático e estimulando a contracção das células
musculares; encontram-se também no retículo
endoplasmático de muitas células não-musculares,
incluindo neurónios, contribuindo para a sinalização por
Ca2+.
 Algumas proteínas G activam a via dos fosfoinositóis por
activação da PLC-b

 Dependendo da isoforma, a PLC pode ser

activada pela Gaq, pelo complexo bg de
outra proteína G, ou por ambos.

 PLC-b (isoforma b da fosfolipase C):

Enzima que catalisa a conversão do PIP2 em dois mediadores intracelulares : DAG (permanece na
membrana) e IP3 (molécula pequena e hidrofílica, difunde no citosol).
(PIP2: fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato; DAG: 1,2-diacilglicerol; IP3 : inositol 1,4,5-trifosfato)
 IP3: inositol 1,4,5-trifosfato

Difunde-se no citosol

liga-se a canais de Ca2+ sensíveis a IP3 na membrana do retículo endoplasmático (ER) e abre-os

Ca2+ armazenado no ER é libertado para o citosol (elevado gradiente electroquímico)

 [Ca2+] (rápido) no citosol Para finalizar a resposta do Ca2+:

- O Ca2+ começa a ser bombeado para fora da

Célula
Respostas celulares
- O IP3 é rapidamente desfosforilado por fosfatases
específicas (algum é fosforilado para formar IP4 de
modo a promover respostas mais lentas ou repor os
níveis de Ca2+)
 DAG: 1,2-diacilglicerol

Pode ser clivado originando

ácido araquidónico  pode actuar como Activa a proteína cinase C
mensageiro ou ser usado na síntese dos (PKC) (juntamente com a
mensageiros lipídicos eicosanóides (respostas fosfatidilserina e Ca2+)
inflamatórias)

A maior parte das drogas anti-inflamatórios PKC fosforila proteínas alvo

(aspirina, ibuprofeno e cortisona) actuam, pelo (variam dependendo do tipo celular)
menos em parte, pela inibição da sua síntese

Efeitos do IP3 e do DAG podem ser mimetizados pela adição de agentes famacológicos a células intactas:

 IP3: A23187 ou ionomicina (ionóforos de Ca2+) permitem o fluxo de Ca2+ do meio extracelular para o citosol

 DAG: ésteres de forbol que activam a PKC

Respostas celulares activadas pela via dos fosfoinositóis
 Cinases dependentes de Ca2+/calmodulina (CaM-cinases) medeiam
muitas acções do Ca2+ em células animais
As proteínas que ligam Ca 2+ funcionam como transdutoras do sinal citosólico de Ca 2+
(ex.: Troponina C nas células do músculo esquelético – papel importante na contracção;
Calmodulina – funciona como um receptor intracelular de Ca2+, mediando processos regulados por Ca2+).

Calmodulina: cadeia polipeptídica contendo 4 locais

de ligação, de alta afinidade, a Ca2+.

Quando activada por ligação a Ca2+ (2 ou mais iões),

sofre alteração conformacional e liga-se à proteína alvo
alterando a sua actividade.

Efeitos:
 Entre as proteínas alvo da calmodulina encontram-se muitas enzimas e proteínas
envolvidas no transporte membranar
(ex.: a Ca2+/calmodulina liga-se e activa a bomba de Ca2+ da membrana plasmática que bombeia Ca2+ do citosol para o meio
extracelular; quando a concentração de Ca2+ no citosol aumenta, a bomba é activada, baixando os níveis citosólicos de Ca2+
para valores normais).

 Muitos efeitos do Ca 2+ são indirectos e mediados pela fosforilação de proteínas catalisada por
uma família de cinases dependentes de Ca 2+/calmodulina (CaM-cinases). Tal como a PKA e
a PKC, as CaM-cinases fosforilam resíduos de serina ou treonina em proteínas ( ex.: CREB).
Ex: CaM-cinase II (multifuncional)
 Algumas proteínas G regulam canais iónicos, directamente

Algumas proteínas G podem activar ou inactivar canais iónicos na membrana plasmática,

alterando a permeabilidade a iões e, consequentemente, a excitabilidade da membrana.

Exemplo:
Este efeito é mediado por uma classe especial de receptores de
acetilcolina (muscarínicos) que activam proteínas Gi

Uma vez activada, a subunidade a da Gi inibe a adenilciclase,

enquanto que o complexo bg liga e abre canais de K+ na membrana
plasmática da célula

A abertura destes canais de K+ torna mais difícil a despolarização da

célula, o que contribui para o efeito inibitório da acetilcolina no coração

Algumas proteínas G triméricas regulam a actividade de canais iónicos de uma forma menos
directa, por fosforilação desses canais (pela PKA, PKC ou CaM-cinase, por ex.) ou pela produção ou
degradação de nucleótidos cíclicos que directamente activam ou inactivam canais iónicos.
O olfacto e a visão são exemplos de processos que dependem da activação
de receptores acoplados a proteínas G que regulam canais iónicos
sensíveis a nucleótidos cíclicos

Olfacto
Os humanos podem distinguir mais de 10 000 cheiros diferentes, que são detectados por
neurónios receptores olfactivos que existem na superfície interna do nariz.

Epitélio olfactivo do nariz:

Receptores
O axónio transmite os sinais eléctricos
olfactivos para o cérebro quando a célula é activada
por uma substância odorante, originando
um potencial de acção

Odorante Activação da proteína G olfactiva (Golf) Activação da adenilciclase

 cAMP
Despolarização e transmissão do Abertura de canais de Na +
impulso nervoso ao cérebro sensíveis a cAMP
Visão

Na retina, existem dois tipos de células especializadas na captação da radiação luminosa e na

sua conversão num estímulo nervoso que, posteriormente, é conduzido ao cérebro através das
fibras nervosas. Essas células são os cones e os bastonetes.

• Visão colorida, com elevada definição • Formato alongado rodopsina

• Funcionam apenas em condições de • Baixo limiar de excitação

elevada luminosidade

Muito sensíveis à luz
(visão sob baixa luminosidade)

• Formação de imagens em
tons de cinzento e pouco
nítidas

Neurónios da retina
No processo da visão, em vertebrados, estão envolvidos canais iónicos sensíveis a
nucleótidos cíclicos, neste caso, o cGMP

cGMP

Guanilciclase

GTP cGMP controlo dos níveis de

cGMP nas células
Fosfodiesterase

5’-GMP
 Rodopsina: Receptor acoplado a proteínas G (7 segmentos transmembranares)

Sinal extracelular: fotão de luz (e não uma molécula sinalizadora)

Luz

Activação do rodopsina
Escuro (receptor)

cGMP liga-se aos

Activação da transducina
canais de Na+,
(proteína Gt)
mantendo-os abertos

Activação da cGMP
fosfodiesterase

Hiperpolarização Fecho dos canais de Na+

sensíveis a cGMP  cGMP

 Libertação de NT (inibitórios) Activação da célula pós-sináptica

na região sináptica
As cascatas de sinalização intracelular activadas por receptores acoplados a
proteínas G permitem a amplificação dos sinais extracelulares

Quanto maior o número de etapas numa cascata de sinalização, maior é

amplificação do sinal extracelular
 Receptores membranares acoplados a enzimas
Quando activados, funcionam directamente como enzimas (possuem actividade enzimática
intrínseca) ou activam enzimas directamente associadas a eles.

Papel importante na resposta a proteínas sinalizadoras que promovem o crescimento, proliferação, diferenciação ou
sobrevivência das células (factores de crescimento); medeiam também efeitos directos e rápidos no citosqueleto.

 Formados por apenas um segmento transmembranar

 Local de ligação ao ligando no lado extracelular da membrana
 Local catalítico ou de ligação à enzima no lado citoplasmático

A maior parte são cinases de proteínas ou estão associados a cinases de proteínas

A ligação do ligando causa a fosforilação de proteínas na célula alvo

Receptores associados a cinases de tirosina:

Ligando Formação de um homodímero ou heterodímero

Ligação e activação de cinase de tirosina citosólica

Fosforilação de resíduos de tirosina no receptor pela cinase activada

Outras proteínas ligam-se aos resíduos de fosfotirosina

no receptor e são fosforiladas
Receptores com actividade enzimática intrínseca:
Factores de crescimento

Alterações na fisiologia celular

e/ou expressão génica

 Alguns receptores são monómeros com actividade de guanilciclase  geram o segundo

mensageiro cGMP

Nos receptores com actividade intrínseca de cinases de tirosina, a ligação do ligando leva
à formação de um homodímero activado  fosforila vários resíduos de tirosina no seu
próprio domínio citosólico (auto-fosforilação), assim como determinadas proteínas
 Receptores com actividade intrínseca de cinase de tirosina

Auto-fosforilação

- PI 3-cinase
- Proteína ativadora de
GTPase (GAP)
- Fosfolipase C-γ

Os resíduos de fosfotirosina funcionam como locais de ligação a outras proteínas envolvidas na

transdução de sinal mediada por receptores de cinase de tirosina

Activação do receptor de cinase de tirosina

Receptores com actividade intrínseca de cinase de tirosina

Auto-fosforilação

- PI 3-cinase
- Proteína ativadora de
GTPase (GAP)
- Fosfolipase C-γ

RAS INATIVA
GDP

GAP GNRP

RAS
GTP ATIVA Diferenciação e Proliferação
 Vias de sinalização comuns activadas por receptores acoplados a
proteínas G e receptores de cinase de tirosina

Estes 2 tipos de receptores activam múltiplas vias de sinalização, onde diferentes segundos
mensageiros e proteínas sinalizadoras intracelulares podem mediar a mesma resposta celular
 Bibliografia
(Sinalização Celular)

 Molecular Cell Biology, Lodish et al. 2004 (5th edition)

Capítulo 13

Biologia Molecular da Célula, Alberts et al. 1994 (3ª edição)

Capítulo 15