SINALIZAÇÃO POR MEIO DE RECEPTORES ASSOCIADOS À PROTEÍNA G

1. Receptores Associados à Proteína G: GPCRs

A maioria dos receptores acopladados às proteínas G possuem uma mesma conformação.
Tais receptores consistem em um único polipeptídeo com sete
α-hélices atravessando a membrana, sendo que duas das alças
extracelulares do polipeptídeo formam os sítios de ligação do
neurotransmissor. Assim, as variações estruturais nessas regiões
determinam quais neurotransmissores ligam-se ao receptor.
Além disso, existem duas das alças intracelulares que podem se
ligar a proteínas G e ativá-las. Dessa forma, variações estruturais
nesse local determinam quais proteínas G e, por consequência,
quais sistemas efetores são ativados em resposta à ligação do
neurotransmissor.

2. Proteínas G
A proteína G possui três subunidades, denominadas α, β e γ.
No estado de repouso, uma molécula de guanina difosfato, o GDP, está ligada a subunidade Gα, e
o complexo inteiro flutua ligado à superfície interna da membrana.
Se a proteína G ligada à GDP associa-se com um tipo apropriado de
receptor e se esse receptor possuir uma molécula de neurotransmissor
ligada a ele, a proteína G libera o seu GDP, permitindo que um GTP
presente no citosol se ligue em tal sítio de ligação. Tal troca de GDP
pelo GTP causa uma grande mudança conformacional na proteína,
ativando-a.
Essa ativação provoca a dissociação do trímero em dois componentes
ativados: a subunidade α-GTP e o complexo βγ.
Esses componentes podem se associar à diversas enzimas e canais
iônicos, desencadeando diferentes respostas celulares.
A subunidade α é uma enzima que degrada GTP em GDP. Com isso,
Gα em algum momento irá encerrar sua própria atividade, convertendo o
GTP ligado em GDP.
A subunidade α e o complexo βγ reuném-se novamente, permitindo que
o ciclo recomece.

2.1. Tipos de Proteína G

Dependendo do subtipo de proteína G envolvido, pode-se ter uma resposta excitatória ou inibitória
na célula-alvo.
Os principais subtipos de proteína G e suas funções são:
1. Proteína Gαs
Estimula a atividade enzimática da adenilil-ciclase, aumentando a formação de AMPc,
causando, assim, uma maior ativação da proteína quinase depende de AMPc, a PKA, e
aumento dos íons cálcio intracelular.
2. Proteína Gαi
Inibe a atividade enzimática da adenilil-ciclase, diminuindo a formação de AMPc e, por
consequência, reduzindo a ativação da PKA e também a concentração intracelular dos
íons cálcio.
3. Proteína Gαq
Ativa a fosfolipase C, aumentando, portanto, a produção dos segundos mensageiros
inositol trifosfato e diacilglicerol. O diacilglicerol, juntamente com os íons cálcio, ativa a a
proteína quinase dependente de íons cálcio, também conhecida por PKC.
3. Via do AMPc
3.1. Estrutura do AMPc: adenilil-ciclase e fosfodiasterases
O AMP cíclico corresponde há um importante segundo mensageiro de várias vias intracelulares.
A concentração intracelular normal é de 10-7M, porém um sinal
extracelular pode causar, em alguns segundos, um aumento de
mais de 20 vezes.
Esse AMPc é sintetizado a partir do ATP pela enzima adenil-ciclase. Tal
substância é, continuanente degrada pela fosfodiasterase de AMPc, que
hidrolisam o AMP em 5’-monofosfato de adenosina, o 5’-AMP.
As moléculas-sinal extracelulares causam o aumento intracelular do AMPc
uma vez que induzem o aumento da atividade da adenil-ciclase, que é
proteína transmembranal de múltiplas passagens com o seu domínio
catalítico no lado citosólico.
Os GPCRs que agem aumentando a concentração de AMPc estão
acoplados a uma proteína G estimuladora, a Gs, que ativa a adenil ciclase.
Quando tais receptores estão acoplados a uma proteína G inibidora, a Gi,
há uma diminuição da concentração dos níveis de AMPc uma vez que tal
proteína inibe a adenil-ciclase.
Tanto a Gs quanto a Gi são alvos de toxinas bacterianas.
A toxina da cólera inibe a atividade da GTPase presente na subunidade α da proteína Gs,
impedindo, portanto, a hidrólise do GTP em GDP e Pi. Com isso, a proteína Gs mantém-se
continuamente ativa, estimulando indefinidademente a adenilil-ciclase. Assim, há uma
elevação dos níveis de AMPc nas células epiteliais intestinais, o que provoca um grande
influxo de Cl– e de água para o lúmen, causando diarreia.
Já toxina pertussis causadora do coqueluche impede a interação da subunidade α da
proteína Gi com seus receptores, mantendo-a com GDP. Assim, não há inibição da
atividade da adenil-ciclase, havendo, portanto, um aumento dos níveis de AMPc. Isso
provoca a excreção de mais muco e um grande influxo de Cl– e de água para o aparelho
respiratório.

3.2. Estrutura do PKA

A PKA é uma proteína-cinase dependente de AMP cíclico que fosforila serinas ou treoninas de
certas proteínas-alvo, inclusive proteínas de sinalização intracelular e proteínas efetoras,
regulando, assim, suas atividades. Em tipos celulares diferentes, grupos diferentes de proteínas
estão disponíveis para serem fosforilados, o que explica por que os efeitos do AMPc variam com o
tipo de célula-alvo. Os mecanismos consequentes desse processo podem ser a alteração da
expressão gênica, alterações metabólicas ou alterações morfológicas.
No seu estado inativo, a PKA consiste em um complexo
de duas subunidades catalíticas e de duas subunidades
reguladoras. A ligação do AMPc às subunidades
reguladoras altera a conformação dessas subunidades,
provocando sua dissociação do complexo.
Essas subunidades catalíticas liberadas são ativadas e
fosforilam substratos proteicos específicos.
A cinase A pode agir de duas formas:
1. Fosforilação Direta
A PKA fosforila proteínas presentes na célula, tais como os canais iônicos e as enzimas
do metabolismo. Assim, a cinase A altera a conformação proteica e, portanto, a atividade
dessa proteína.
Isso pode tanto diminuir a atividade de uma proteína como aumentar.
2. Síntese Protéica
A PKA ativa a CREB diretamente, a qual se liga ao elemento de resposta a AMPc,
alterando a transcrição e, dessa forma, a síntese da proteína.
Esse mecanismo, geralmente, é mais lento.
Tais subunidades catalíticas podem regular a atividade da própria proteína cinase A. Isso ocorre
por meio da pela fosforilação, pela PKA, da fosfodiesterase, a qual converte rapidamente a AMPc
em 5’–AMP. Com isso, reduz-se a quantidade de AMPc que pode ativar a proteína cinase A.
As subunidades reguladoras de PKA localizam a enzima dentro da célula. As proteínas
especiais de ancoragem à cinase A, conhecidas por AKAPs, se ligam simultanemanete às
subunidades reguladoras e a componentes do citoesqueleto ou à membrana de uma
organela, confinando o complexo enzimático a um determinado compartimento.

3.3. Atuação do AMP cíclico

1. A molécula-sinal se ligar ao GPCR, mudando a sua conformação e ativando esse receptor.
Essa ligação, por sua vez, altera a forma da proteína Gs, que poderia já estar associada ao
receptor ou associar-se quando há interação do ligante com o receptor.
2. Tal mudança da forma da proteína G provoca a saída de uma molécula de GDP da subunidade
α e a entrada de uma molécula de GTP, tornando-a ativa.
3. A subunidade α-GTP ativa a enzima adenilil-ciclase, presente na membrana plasmática, o que
provoca a conversão de ATP em AMPc.
4. O AMPc liga-se a proteína cinase dependente de AMPc, conhecida por PKA. Assim, a ligação
de quatro moléculas de AMPc as subunidades reguladoras do tetrâmero da PKA induz uma
mudança conformacional. Com isso, há dissociação das subunidades catalíticas, agora ativadas,
que irão fosforilar outras proteínas.
5. As subunidades catalíticas fosforilam a proteína reguladora CREB, conhecida como proteína de
regulação de transcrição.
6. A CREB forforilada recruta o coativador transcricional chamado de proteína de ligação a CREB,
o CBP, que estimula a transcrição de genes alvos.
4. Via do Fosfolipídeo de Inositol
4.1. Fosfolipídeos de Inositol: componente da membrana plasmática
Os fosfolipídios de inositol estão presentes na monocamada lipídica citosólica. Há muitos tipos de
fosfolipídios de inositol, que diferem quanto o grau de fosforilação.
Esse radical inositol dos fosfatidinositois pode ser fosforilados por uma enzima cinase.
Dessa maneira, o fosfolipídeo fosfatidilinositol, conhecido como PI, possui o radical inositol ligado
ao grupamento fosfato.
Tal radical pode sofrer uma fosforilação, formando um fosfolipídeo conhecido por PIP, que possui
um fosfato adicionado.
Esse inositol do PIP, por sua vez, pode sofrer uma nova fosforilação, formando, portanto, um
fosfolipídeo de membrana com dois fosfatos adicionados, o PIP2.

4.2. Atuação das Fosfolipase C-β

A molécula-sinal se liga ao receptor GPCR na membrana plasmática associado a proteína Gq.
Com isso, a conformação da proteína G é alterada, resultando na substituição do GDP associado
por um GTP.
Assim, ativa-se a subniudade α.
A subunidade α–GTP ativa a enzima fosfolipase C-β, conhecida também por PLCβ.
Essa enzima atua sobre o PIP2, quebrando a ligação entre o grupamento fosfato e o glicerol do
fosfolipídeos. Dessa maneira, formam-se dois mediadores intracelulares que irão atuar como
segundos mensageiros, o inositol trifosfato, o IP3, que fica no citoplasma, e diacilglicerol,
conhecido por DAG, que fica ancorado na membrana plasmática.
O DAG pode sofrer clivagem e originar ácido aracdônico.
Atuação do IP3
O IP33, molécula pequena e hidrossolúvel, desliga-se da membrana plasmática, difundindo-se
pelo citosol.
Esse composto se liga a receptores de IP3 presentes na membrana do retículo endoplasmático.
Tal ligação promove a abertura de canais de Ca2+, regulados por IP3.
O aumento da concentração citosólica de íons de cálcio influencia a atividades de várias vias.

Ativação da PKC
O aumento inicial de íons de cálcio no citosol auxilia na ativação da enzima chamada de proteína
cinase dependente de cálcio, conhecida como PKC.
O Ca2+ se liga a essa proteína alterando a conformação da mesma.
Essa nova forma do PKC o permite se ligar ao DAG e a fosfatidilserina presentes na membrana.
Tal ligação provoca uma completa ativação do PKC, que pode atuar uma quinase.

5. Via do GMPc: fototransdução nos bastonetes

O GMPc é responsável pelo controle de canais iônicos.
Assim como o AMPc, a concentração citosólica de GMPc é controlada pela guanilil ciclase, que
realiza sua síntese rapidamente, e pela fosfodiasterase de GMP cíclico, que realiza sua rápida
degradação.
Na membrana das células bastonetes da retina, existem
receptores GPCR chamados de rodopsina. Tal receptor
não é ativado por uma molécula-sinal, mas sim por um
fóton de luz.
Cada molécula de rodopsina possui um cromóforo, o cis-
retinal, ligado covalentemente e que isomeriza quase de
maneira instântanea para trans-retinal quando absorve um
único fóton. Essa isomerização altera a forma do retinal,
forçando uma mudança conformacional na proteína
opsina. A rodopsina ativada altera a conformação da
proteína G transducina, fazendo com que a sua
subunidade α ative a fosfodiasterase de GMP cíclico. A
enzima hidrolisa o GMPc, reduzindo os seus níveis no
citosol. Com isso, os canais de sódio controlados por
GMPc são fechados. Isso causa uma hiperpolarização da
membrana.
6. Vias de Atalho: as proteínas G ativam diretamente canais iônicos
Em alguns casos, as proteínas G ativam ou inativam, diretamente, os canais de iônicos na
membrana plasmática da célula-alvo, alterando, assim, a permeabilidade aos íons e, por
consequência, a excitabilidade da membrana.
A acetilcolina liberada pelo nervo vago, por exemplo, reduz a velocidade e a força de
contração do músculo cardíaco. Tal efeito é mediado por receptores de acetilcolina que
ativam a proteína Gi. A subunidade α da proteína Gi, uma vez ativada, inibe a adenil
ciclase, enquanto o complexo βγ se liga aos canais de K+ da membrana plasmática das
células musculares cardíacas, abrindo-os. Assim, a abertura desses canais dificulta a
despolarização da célula, o que contribui para o efeito inibitório da acetilcolina.

7. Regulação de Ca2+: calmodulina e CaM-Kinase II

As concentrações intracelulares de cálcio controlam vários processos celulares, incluindo a
contração muscular, o acoplamento estímulo-secreção nos nervos, a exocitose dos hormônios e a
atividade de inúmeras enzimas.
Devido a essa grande importância fisiológica do Ca2+, a concentração citosólica desse íon deve
ser regulada.
O cálcio está mais concentrado na região extracelular e no interior das organelas citoplasmáticas
do que em relação ao citosol.
A concentração citosólica de cálcio aumenta por meio:
1. Abertura dos canais iônicos de cálcio voltagem dependente presente na membrana
plasmática da célula.
2. Abertura de receptores iônotrópicos de Ca2+ presentes na membrana plasmática da
célula a partir da ligação de uma molécula sinal.
3. Abertura de canais de cálcio presente na membrana das organelas, como as
mitocôndrias e o retículo endoplasmático. Isso acontece, por exemplo, quando o IP3 se liga
a receptores presentes em proteínas canais no retículo.
Já a concentração citosólica de íons cálcio diminui por meio:
1. As bombas de Ca2+ presentes na membrana plasmática que utilizam a energia da
hidrólise do ATP para bombear o íon cálcio para o meio extracelular.
2. O permutador de Ca2+ dirigido por Na+, que consiste em uma proteína integral, a qual
realiza o antiporte dos íons, utilizando o gradiente eletroquímico de sódio como força
motriz para o transporte de Ca2+ contra o gradiente de concentração.
3. As bombas de Ca2+ presentes na membrana do retículo endoplasmático que utilizam a
energia da hidrólise do ATP para bombear o íon cálcio para o interior da organela.
4. As bombas de Ca2+ presentes na membrana da mitocôndria possuem baixa afinidade
com esses íons. Essas utilizam o gradiente eletroquímico gerado através da membrana
durante as etapas da trasnferência de elétrons na fosforilação oxidativa para remover Ca2+
do citosol. O aumento da concentração de cálcio na mitocôndria pode ativar algumas
enzimas do ciclo do ácido cítrico, aumentando, dessa forma, a síntese de ATP. Um
aumento excessivo de Ca2+ mitocondrial, no entanto, leva à morte celular.
5. O Ca2+ está ligado à proteínas citoplasmáticas.
7.1. Calmodulina
É uma proteína que funciona como um receptor intracelular polivalente de Ca2+, mediando,
assim, muitos processos regulados por esse íon.
O cálcio liga-se a calmodulina, alterando a forma dessa e, assim, ativando tal proteína. Desse
modo, o complexo Ca2+/Calmodulina se liga a outras proteínas na célula-alvo, alterando suas
atividades.
Tal complexo Ca2+/Calmodulina sofre uma grande mudança conformacional quando se liga a
sua proteína-alvo. Entre os alvos regulado pela a calmodulina, estão enzimas e proteínas de
membrana, tal como a bomba de Ca2+. Contudo, muitos efeitos do Ca2+ são indiretos e mediados
por fosforilações catalisadas pelas proteínas-cinases dependentes de Ca2+/Calmodulina, também
chamadas de CaM-cinases.
A CaM-cinase II, encontrada no sistema nervoso, é muito importante nos mecanismos de memória
e de aprendizado.
A enzima CaM-cinase II é inativa na ausência de Ca2+/Calmodulina por causa de uma interação
entre um domínio inibidor e o catalítico. A ligação da Ca2+/Calmodulina altera a conformação da
proteína, ativando-a parcialmente. Os domínios catalíticos no complexo fosforilam os domínios
inibidores de subunidades vizinhas, bem como outras proteínas.
A autofosfilação do complexo enzimático leva a ativação completa da enzima. Nesse estado, a
enzima permanece ativa mesmo na ausência de cálcio, prolongando, assim, a duração da
atividade cinásica. Essa atividade é mantida até que uma proteína fosfatase desforile a enzima,
desativando-a.

8. Dessensibilização dos GPCR

Embora uma queda na concentração do ligante possa ser um fator na interrupção de algumas
respostas, vários GPCRs podem ser inativados mesmo quando ainda estiverem interagindo com o
ligante.
Tal processo de inativação, chamado de dessensibilização, envolve dois mecanismos principais:
1. Fosforilação do GPCR
2. Internalização do GPCR por endocitose
A sequência dos receptores acoplados à proteína G inclui certos resíduos de aminoácidos do tipo
serina e e treonina, principalmente na cauda citoplasmática C-terminal. Esses podem ser
fosforilados por quinases, como a PKA, a PKC e proteínas cinases do GPCR, conhecidas por
quinases GRKs, ligadas à membrana.
A fosforilação realizada pela PKA e PKC, que é ativada por muitos receptores acoplados à
proteína G, geralmente resulta em redução do acoplamento entre o receptor ativado e a proteína
G, com consequente redução do efeito do agonista.
Já o receptor fosforilado pelas GRK atua como sítio de ligação de arrestinas, que são proteínas
intracelulares as quais bloqueiam a interação do GPCR e a proteína G. A arretina serve como uma
proteína adaptadora que acopla o receptor à maquinaria endocítica dependente de clatrina,
induzindo, assim, uma endocitose do receptor.