Prof.

Vinicius Vescovi

Universidade Federal do Sul e Sudeste do Pará

Engenharia de Processos Biotecnológicos

Enzimas – Atividade Enzimática

Prof. Vinicius Vescovi

FATORES QUE AFETAM A ATIVIDADE ENZIMÁTICA Prof. Vinicius Vescovi

1. Condições do meio que afetam estabilidade proteica;

o pH
o Temperatura
2. Tempo de reação;

3. Velocidade de agitação no biorreator;

4. Concentração dos reagentes;

✓ Quantidade de enzima fornecida Fonte – https://www.didaticasp.com.br/agitador-mecanico-20l-digital-2200rpm-bivolt

✓ Quantidade de substrato disponível para a enzima

✓ A presença de co-Fatores.
Importante: Para estudar o efeito isolado de um dos fatores acima, é
necessário que todos os outros fatores sejam mantidos fixos. 2
 Introdução
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EFEITO DO pH NA ATIVIDADE ENZIMÁTICA

❖ As enzimas têm um pH ótimo (ou um intervalo de pH) no qual a sua atividade é máxima.

Fonte - https://pt.wikipedia.org/wiki/Enzima.
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 Introdução
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EFEITO DO pH NA ATIVIDADE ENZIMÁTICA

✓ O controle do pH está diretamente ligado na manutenção da estrutura

tridimensional da enzima.
✓ Essa estrutura depende fortemente das cargas elétricas de cada aminoácido
presente em sua estrutura principal.
✓ Assim qualquer alteração do pH do meio vai afetar diretamente a estabilidade
estrutural da enzima e consequentemente sua atividade, podendo ocorrer até a
sua desnaturação (quebra de sua estrutura, MORTE DA ENZIMA).

Fonte - Adaptado de: https://www.tes.com/teaching-resource/the-effect-of-

ph-on-enzyme-activity-flash-animation-6071755

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Desnaturação das enzimas

✓ A desnaturação ocorre quando a proteína perde sua estrutura original, ou seja, o arranjo tridimensional da cadeia
polipeptídica é desestruturado, fazendo com que, quase sempre, perca sua atividade.

✓ A estrutura tridimensional das enzimas sofrerem desagregação e inativação das seguintes formas:
o Pelo aumento de temperatura (agitação das moléculas);
o Pela variação do pH – extremos de pH alteram a carga líquida da proteína, causando repulsão eletrostática e o rompimento
de algumas ligações de hidrogênio).
o Agitação vigorosa;
o Solventes orgânicos
o Outros.

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Fonte – https://www.toppr.com/content/story/amp/denaturation-of-proteins-70991/
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Desnaturação das enzimas

✓ Exemplo: Inativação da ribonuclease

pela adição de uréia e mercaptoetanol
sua posterior reativação pela remoção
dos reagentes.

Fonte - Princípios de bioquímica de Lehinger. 6°Ed. 2014.

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 Introdução
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EFEITO DO pH NA ATIVIDADE ENZIMÁTICA

Desnaturação (Morte da enzima)

Fonte - https://www.philpoteducation.com/mod/book/tool/print/index.php?id=782 7
 Introdução
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EFEITO DA TEMPERATURA NA ATIVIDADE ENZIMÁTICA

Fonte – https://www.expii.com/t/temperature-enzyme-reaction-rates-effects-examples-10057

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Desnaturação das enzimas Aquecendo a solução contendo a enzimática..............

Devemos lembrar que a enzima depende do seu

sítio ativo para reação a reação!

Fonte – https://aminoapps.com/c/astronomo/page/blog/temperatura/ezKv_zzh3udnR2mBnr6Ywak6PDQ1MK

Fonte –
https://edisciplinas.usp.br/pluginfile.php/3274618/mod_resource/conte
nt/1/Aula12BioqI_MecCatEnz_Exemplos.pdf

Fonte – https://gifsdefisica.com/2019/09/30/agitacao-molecular-calor-e-temperatura/
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Dependendo de sua origem sua temperatura ótima pode variar bastante. Por exemplo, a
maioria das enzimas humanas, têm sua temperatura ótima entre 35 e 40ºC, a faixa de
temperatura normal do nosso corpo.

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 Introdução
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EFEITO DA CONCETRAÇÃO DOS REAGENTES NA ATIVIDADE ENZIMÁTICA

✓ O aumento da quantidade de substrato (para uma quantidade fixa

de enzima) também aumenta a freqüência com que a enzima e o
substrato colidem.

✓ No entanto, há um limite, pois eventualmente haverá mais

moléculas de substrato que enzima.

✓ Neste caso, qualquer aumento adicional na concentração de

substrato não tem mais efeito na taxa de reação.
Fonte – https://www.pathwayz.org/Tree/Plain/ENZYMES+%26+SUBSTRATE+CONCENTRATION

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Determinação da atividade da enzima - Método das velocidades iniciais

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ESCOLHA DO SUBSTRATO

✓ Escolha do Substrato:
❖ Pode-se constituir um grande problema a escolha do melhor e mais adequado substrato para o ensaio.

❖ Escolha substrato deve garantir a reprodutibilidade do método de determinação da atividade.

❖ Deve-se saber qual é o melhor substrato da enzima.

o Substrato natural da enzima;

Em alguns casos a utilização de um substrato não natural possibilita obter
o Substrato sintético. um método de determinação de atividade mais reprodutível e confiável,
frente ao substrato natural.

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Problemas Clássicos na determinação da atividade de
preparações enzimáticas

1) Pode haver enzimas inativas que aumentam o conteúdo proteico na preparação ou um extrato enzimático com
baixa pureza, ou seja, baixa quantidade de enzima ativa (enzima que irá participar efetivamente da reação).

2) A enzima pode apresentar baixa atividade, ou ainda alta atividade.

3) A preparação enzimática pode conter enzimas proteolíticas que se encontram inativas sob as condições de
estocagem, mas são ativadas nas condições de medida da atividade.

4) A enzima pode ser instável sob as condições de análise (pH, temperatura, força iônica, etc.).

5) O método de análise pode ser impreciso.

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O método de determinação da atividade enzimática é

específico para cada tipo de enzima

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O quê significa o termo ATIVIDADE

ENZIMÁTICA??

❖ Por convenção internacional, a unidade 1,0 (U) de atividade enzimática para a maior parte das enzimas é
definida como a quantidade de enzima que leva à transformação de 1,0 µmol de substrato em
produto, por minuto.

❖ Para algumas enzimas, essa definição não é conveniente, e uma unidade pode ser definida
diferentemente.

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Quais são os diferentes tipos de ATIVIDADE

ENZIMÁTICA??

1) O termo atividade se refere às unidades totais de enzima em uma solução.

2) A atividade específica é o número de unidades de enzimas por miligrama de proteína total.

➢ A atividade específica é uma medida de pureza enzimática: ela aumenta durante a purificação de
uma enzima e se torna máxima e constante quando a enzima é pura.

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Qual a diferença entre a atividade enzimática e atividade

enzimática específica??

❖ A diferença entre esses termos pode ser ilustrada considerando dois béqueres
contendo esferas.
❖ Os béqueres contêm o mesmo número de esferas vermelhas (enzima de interesse),
mas números diferentes de esferas de outras cores.
❖ Se as esferas representam proteínas, ambos os béqueres contêm a mesma
atividade da proteína representada pelas esferas vermelhas.
❖ O segundo béquer, no entanto, apresenta a atividade específica maior porque as
esferas vermelhas representam uma fração mais alta do total.
Fonte - Adaptado de Princípios de bioquímica de Lehinger. 6°Ed. 2014.

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Formas específicas de expressar a atividade de uma enzima

Metida de atividade da lipase usando substrato natural (triglicerídeos)

❖ Os ácidos graxos liberados pela hidrólise dos triglicerídeos são titulados com solução de KOH 0,025M, utilizando fenolftaleína
como indicador.

𝝁𝒎𝒐𝒍 𝑽𝑨𝒎𝒐𝒔𝒕𝒓𝒂 − 𝑽𝑩𝒓𝒂𝒏𝒄𝒐 . 𝑴. 𝟏𝟎𝟎𝟎

𝑨𝒕𝒊𝒗𝒊𝒅𝒂𝒅𝒆 =
𝐦𝐢𝐧 𝒙 (𝒎𝒈 𝒐𝒖 𝒎𝒍) 𝒕. 𝑬

o Em que: E é a quantidade de enzima utilizada (em ml para a enzima solúvel e em mg para a enzima sólida ou imobilizada), M é a molaridade da
solução de KOH, t é o tempo de reação (minuto), VA é o volume de KOH gasto na titulação da amostra (mL) e VB é o volume do KOH gasto na
titulação do branco (mL).

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Determinação da quantidade de proteínas Prof. Vinicius Vescovi

✓ Keldhjal – Relaciona a concentração de proteína com a concentração de nitrogênio orgânico. Método preciso, no
entanto extremamente trabalhoso e demorado (horas).
✓ Lowry e Bradford – Métodos que relacionam a concentração de proteína com a quantidade de ligações peptídicas. Métodos
simples e de resposta rápida (cerca de 5 minutos).
❑ Método de Bradford é uma técnica para a determinação de proteínas totais que utiliza o corante de “Coomassie brilliant blue” BG-
250.
❑ No pH de reação, a interação entre a proteína e o corante BG-250 provoca o deslocamento do equilíbrio do corante para a forma
aniônica, que absorve fortemente em 595 nm.

Fonte – https://biologiavegetal.com/aula-44-dosagem-de-proteinas-pelo-metodo-de-bradford/ 21
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✓ Método de Bradford (passo a passo)

1. Fazer a curva de calibração usando uma fonte conhecida de proteína (Albumina bovina -
BSA);

2. Colocar 100 µL de amostra mais o reagente de Bradford;

3. Agitar e deixar reagir por 5 minutos;

4. Quantificar o teor de proteína no espectrofotômetro.

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Determinação da quantidade de proteínas Prof. Vinicius Vescovi

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✓ Exercício 1: A partir dos dados apresentados a seguir determine para cada amostra da enzima lipase
(Método no Slide 22):
a) Atividade enzimática (U/ml); 𝝁𝒎𝒐𝒍 𝑽𝑨𝒎𝒐𝒔𝒕𝒓𝒂 − 𝑽𝑩𝒓𝒂𝒏𝒄𝒐 . 𝑴. 𝟏𝟎𝟎𝟎
𝑨𝒕𝒊𝒗𝒊𝒅𝒂𝒅𝒆 =
𝐦𝐢𝐧 𝒙 (𝒎𝒈 𝒐𝒖 𝒎𝒍) 𝒕. 𝑬
b) Teor de proteína de cada amostra;
c) Atividade específica (U/kg de proteína);

Tempo Quantidade de Volume Volume Concentração de

(min) Enzima (ml) Branco (ml) titulado (ml) NaOH (mol/l)
Amostra 1 5 2,5 7,5 25 0,23
Amostra 2 15 1 6,5 45 0,1
Amostra 3 10 0,5 8 35 0,1
Amostra 4 5 0,5 9 30 0,1
Amostra 5 15 1 7 27 0,2
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✓ Exercício 1: A partir dos dados apresentados a seguir determine para cada amostra:
a) Atividade enzimática (U/ml);
b) Teor de proteína de cada amostra;
c) Atividade específica (U/kg de proteína);

Tempo Quant. Volume Volume Conc. Atividade

(min) Enzima (ml) Branco (ml) titulado (ml) NaOH (mol/l) (U/ml)
Amostra 1 5 2,5 7,5 25 0,23 322,0
Amostra 2 15 1 6,5 45 0,1 256,7
Amostra 3 10 0,5 8 35 0,1 540,0
Amostra 4 5 0,5 9 30 0,1 840,0
Amostra 5 15 1 7 27 0,2 266,7

Resposta da letra A. 25
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✓ Exercício 1: A partir dos dados apresentados a seguir determine para cada amostra:
a) Atividade enzimática (U/ml);
b) Teor de proteína de cada amostra (método de Bradford);
c) Atividade específica (U/kg de proteína);

Absorbância
Absorbância Diluição da Amostra Proteína Total (kg/ml)
Final
Amostra 1 0,15 5 0,75

Amostra 2 0,091 15 1,365

Amostra 3 0,71 2 1,42

Amostra 4 0,025 10 0,25

Amostra 5 0,05 7 0,35

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✓ Observação: Para o cálculo do teor de proteína utilize a curva de calibração da solução de Bradford
apresentada abaixo.

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✓ Exercício 1: A partir dos dados apresentados a seguir determine para cada amostra:
a) Atividade enzimática (U/ml);
b) Teor de proteína de cada amostra (método de Bradford);
c) Atividade específica (U/kg de proteína);

Absorbância
Absorbância Diluição da Amostra Proteína Total (µg/ml)
Final
Amostra 1 0,15 5 0,75 6,94

Amostra 2 0,091 15 1,365 12,64

Amostra 3 0,71 2 1,42 13,15

Amostra 4 0,025 10 0,25 2,31

Amostra 5 0,05 7 0,35 3,24

Resposta da letra B. 28
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✓ Exercício 1: A partir dos dados apresentados a seguir determine para cada amostra:
a) Atividade enzimática (U/ml);
b) Teor de proteína de cada amostra;
c) Atividade específica (U/kg de proteína);

Proteína Total Atividade Atividade Específica

(µg/ml) (U/ml) (U/kg de proteína)
Amostra 1 6,94 322,0 46,37 x 109

Amostra 2 12,64 256,7 20,31 x 109

Amostra 3 13,15 540,0 41,07 x 109

Amostra 4 2,31 840,0 362,88 x 109

Amostra 5 3,24 266,7 82,29 x 109

Resposta da letra C. 29
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Exercício 2: A substância P é o produto de uma reação enzímica catalisada pela enzima E presente no fígado do
porco (S→P). A substância P absorve luz do comprimento de onda que foi usado para fazer a curva de calibração que
representada no gráfico apresentado a seguir.
0,9

0,8

0,7

0,6

Absorbância
0,5

Condições do meio semelhantes às que 0,4

se usaram quando se fez a leitura 0,3

espectrofotométrica dos ensaios 0,2

0,1
enzimáticos.
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
[P] (mM)

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No estudo, a cubeta A foi adicionada a mistura reativa contendo substrato, tampão (pergunta, qual a função do
tampão?) e extrato bruto homogeneizado hepático, correspondente a 2,5 mg de fígado. Na cubeta B o ensaio
decorreu na ausência de homogeneizado hepático e, no minuto 8, adicionou-se o extrato hepático correspondente a
2,5 mg de fígado fazendo logo de seguida a leitura correspondente. A tabela abaixo apresenta as leituras de
absorbância nos ensaio das cubetas A e B. Sabendo que o volume das cubetas era de 1 ml, determine:
Tempo Absorbância Absorbância
a) Qual a velocidade da reação na ausência de homogeneizado hepático? Justifique. (min) (A) (B)
0 0,1 0,05
b) Calcule a atividade da enzima expressando o resultado na base massa de fígado
2 0,2 0,05
para os seguintes intervalos:
4 0,3 0,05
i. Entre 0 e 4 minutos
6 0,38 0,05
ii. Entre 0 e 14 minutos
8 0,45 0,05
iii. Qual dos valores represente a atividade enzimática dessa enzima, justifique
10 0,52 0,15
sua resposta.
12 0,58 0,25
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14 0,64 0,35
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Exercício 3: A enzima E está presente no soro sanguíneo e catalisa a reação X→Y. Um tubo de ensaio A continha 2,8
ml de solução, contendo substrato, tampão a pH adequado e co-factores essenciais para a atividade da enzima E. No
tempo zero adicionou-se 20 μl de soro sanguíneo. Ao longo do tempo de ensaio foi medida a concentração de X no
meio de ensaio, Figura 2. No caso do ensaio B, exceto no que se refere ao volume de soro sanguíneo adicionado, as
condições foram as mesmas.

a) Qual a atividade da enzima E, em U/ml no tubo A e B?

b) Qual foi, no ensaio B, o volume do mesmo soro adicionado ao tubo

de ensaio?

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ATÉ A PRÓXIMA AULA!

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