2ºSEMESTRE

Fundamentos de Bioprocessos
Licenciatura em Biotecnologia

Docente Maria João Barroca

DETERMINAÇÃO
PROTEÍNA
Método Biureto
Duarte Antunes a2021107407; Helena Vivo
a2023141894; Maria Almeida a2023135328; LBIO
ÍNDICE

Índice de Figuras iii Anexo 1 14

iv
Resumo

Introdução 01
Coagulação do leite
Fundamento método do Biureto
Espectrofotometria
Curvas de Calibração

Material 06
Matéria-prima/ materiais
necessários

Procedimento experimental 06

Resultados e Discussão 08

Conclusões e sugestões 12

Referências Bibliográficas 13
ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1 02 Figura 9 07
Proteína BSA Resultados Teste Biureto
Solução Padrão

Fígura 2 04 Tabela 1 14
Teste do Biureto esquema
Tabela 2 08

Tabela 3 09
Figura 3 05 Tabela 4 09
Esquema Processo da
espectrofotometria Tabela 5 09

Tabela 6 10
Figura 4 06
Solução Padrão BSA Tabela 7 11

Gráfico 1 08

Gráfico 2 10
Figura 5 06
Preparação Solução Padrão

Figura 6 07
Teste do Biureto Solução
Padrão

Figura 7 07
Teste do Biureto Leite
Gordo

Figura 8 07
Teste do Biureto Leite
Magro

iii
RESUMO
A finalidade desta atividade laboratorial era determinar a presença de proteínas em
amostras de alimentos através do método qualitativo do Biureto.
Antes do proceder à realização de cada diluição foi necessário a criação de uma

solução padrão de albumina sérica bovina (BSA) com a concentração

de 10 g/L para um volume de 25 mL.

Para o sucesso da realização deste do método do Biureto é necessário criar uma reta

de calibração onde a concentração de BSA é relacionada com a absorvância, para isso

são preparados 12 tubos com concentrações de BSA variadas sendo elas: 0,5; 1,0; 2,0;
3,0; 4,0; 5,0; (g/L) e a partir dos 12 tubos iniciais foram identificados 2 tubos de ensaio

para cada uma das diluições. É necessário também a realização de um "branco"

também chamado de solução de controlo, preparada com água destilada para se

poder confirmar o resultado positivo ou negativo do teste do Biureto.

Posteriormente foram preparados 6 tubos com amostras alimentares diluídas de

acordo com a gama presente na reta de calibração (3 leite gordo (1:5; 1:10; 1:20) 3 leite
magro (1:5; 1:10; 1:20)) que foram também sujeitos ao teste de Biureto.

Para o teste do Biureto de BSA e dos leites foram utilizados 1mL de solução padrão e

1mL de leite, respetivamente, ambos para 4mL de reagente Biureto (sulfato de cobre,
água, tartarato duplo de sódio, potássio tetra e hidróxido de sódio), sendo o branco

contém 4mL de água destilada e 1mL do reagente de Biureto.

Todas os tubos foram agitados e deixados a repousar durante 30 minutos.
Foram lidos os valores de absorvância a 550 nm, e a partir destes valores foi

construída a curva de calibração.

É possível verificar que este método é bastante fácil e rápido de executar e é notório a

aproximação dos resultados obtidos dos valores reais.

Palavras-chave: Biureto, método Biureto, proteínas, ligação peptídica, colorimetria e

espectrofotometria

iv
INTRODUÇÃO
As proteínas pertencem ao grupo das macromoléculas biológicas constituídas por cadeias
de aminoácidos ligadas através de ligações peptídicas. Este grupo molecular carrega uma
extrema importância para os seres vivos dado que são essenciais a todas as células vivas e
é responsável funções da célula, entre elas, têm o papel de enzimas, operam na contração
muscular, nas hormonas, anticorpos, coagulação, no transporte de oxigénio, entre outras.
As proteínas em si, podem ser divididas em três grupos sendo eles, os das proteínas
simples, das conjugadas e das derivadas. As proteínas simples são formadas apenas por
aminoácidos. As conjugadas quando sofrem hidrolise libertam aminoácidos. As derivadas
não podem ser encontradas na natureza e por isso são obtidas pela degradação de
proteínas simples ou conjugadas através de reações ácido base. (Proteína)
O leite (termo utilizado somente para a refrência ao leite de vaca), no geral, apresenta um
alto nível de proteínas na sua composição, sendo estas divididas em beta-caseína e
proteíbnas do soro. No leite de vaca a proteína mais abundante é a beta-caseína que ocupa
82% da composição do leite e é composta por uma cadeia de 209 aminoácidos. No soro do
leite também estão presentes outras proteínas, como a imunoglobulina, a albumina, a
lactoferrina e a lactoperoxidase porém só ocupam 18% da composição do leite.(Leite;
Wikipédia)
O leite pode ser dividido em três grupos, leite gordo, leite meio-gordo e leite magro, que
diferem apenas no teor de gordura que apresentam sendo que o leite gordo e o leite meio-
gordo apresentam um teor mínimo de 3,5% e um teor mínimo de 1,6%, respetivamente.
(Nestle).
A albumina sérica bovina (BSA) (Figura 1) é uma proteína monomérica composta por uma
única cadeia de aminoácidos, encontrada no sangue de vacas, produzida pelo fígado e
ocupa um papel importante no plasma sanguíneo.
Esta proteína é vulgarmente utilizada em laboratórios como suplemento em meios
bioquímicos e cultura de tecidos, dado que estabiliza o volume do líquido extracelular e
atua como transportador de pequenas moléculas, como esteróides, ácidos gordo e
hormonas da tireoide.

01
 Figura 1- Proteína BSA

A BSA também é usada em uma variedade de aplicações industriais e de pesquisa,

incluindo desenvolvimento de medicamentos, purificação de proteínas e

processamento de alimentos. (Bovine Serum Albumin).

Com esta atividade laboratorial pretendeu-se compreender os fatores que lesam a

coagulação do leite. Fatores como:

temperatura;

ausência/presença de ácido lático;

ausência/presença de cloreto cálcio.

Coagulação do leite
As proteínas do leite são de fácil digestão. Além disso, estas são de elevado valor
biológico pois contêm os aminoácidos essenciais em quantidade e proporção

adequadas. Daí sua importância na alimentação, principalmente na fase de

crescimento, pois é possível obter do leite boa parte das necessidades diárias de
proteínas.

O termo coagulação é, em primeira instância, associado ao sangue, porém, este pode

ser utilizados em variados outros termos pois o processo de coagulação consiste na
transformação de uma substância líquida numa mais espessa, matéria sólida.

Também se usa o termo coalhar, usado quando nos referimos ao leite ou queijo. A
coagulação é a etapa mais decisiva na produção de queijos, a qual visa concentrar a
proteína do leite, retendo também a gordura.

02
A coagulação enzimática é realizada através da utilização de enzimas proteolíticas
comercializadas na forma de soluções enzimáticas, vulgarmente designadas por

coalho. São várias e de distintas origens as enzimas proteolíticas capazes de

promover a coagulação do leite.

As enzimas constituintes do coalho têm como função hidrolisar caseínas,

especificamente a fração proteica kappa-caseína, que estabiliza a formação de

micelas e previne a coagulação do leite. Portanto, a coagulação do leite corresponde à

formação de um coágulo firme (insolúvel), a coalhada, transformando leite em estado

líquido para gel. Essas enzimas (coalho) agem sobre a fração “kapa” da caseína

destruindo a sua capacidade protetora, de modo que as partículas coloidais se

tornam instáveis na presença de iões de cálcio, levando à coagulação do leite. (Joana

Fernandes)

Por fim, o coalho ou coalhada não é nada mais nada menos que uma mistura de

diversas enzimas, como a quimosina e a pepsina, que quando adicionado ao leite

produz a primeira etapa de formação do queijo, a coagulação.

Fundamento do método Biureto

A determinação destas proteínas pode ser feita a partir do método qualitativo do
Biureto. Este método tem a capacidade de avaliar se uma amostra contém apenas

proteínas, apenas aminoácidos, ambos ou nenhum, é realizado com o reagente

Biureto que ao interagir com o nitrogénio presente nas ligações peptídicas forma um
complexo estável dando origem a uma coloração violeta (Figura 2). Este fenómeno

acontece dado que o cobre em meio alcalino reage com as proteínas, formando um
complexo quadrado planar com a ligação peptídica. A intensidade da coloração está
relacionada com a quantidade de proteína presente na amostra. O produto de reação

apresenta duas bandas de absorção, uma de 270 nm e outra de 540 nm, sendo esta
última a mais utilizada para fins analíticos. Esta metodologia por ser um processo
rápido se comparado com outros métodos, por utilizar reagentes de baixo custo e por

não apresentar grande variação da absorção especifica para diferentes proteínas.

Este método não é muito sensível todavia, ainda é recomendado para a análise do
leite. (Explicatorium)

03
 Figura 2- Teste do Biureto esquema

Espectrofotometria

A espectrofotometria é uma técnica que consiste na utilização da análise ótica com a

finalidade de proceder à determinação de concentrações das soluções, através de

uma interação entre luz e matéria. Esta técnica envolve alguns princípios sendo um

deles a absorção de luz, visto que, quando a luz passa por uma amostra esta interage

com os componentes nela presentes e alguns desses componentes têm a capacidade

de absorção seletiva a luz, transmitindo a luz que não sofreu absorção.
Também usa como príncipio a lei de Beer-Lambert onde é verificado que a absorção

da luz é diretamente proporcional à concentração da substância.

Outro princípio conhecido é o espetro de absorção que traduz a medida da absorção
de certos comprimentos de onda na quantidade de luz.

O último princípio presente na espectrofotometria é o uso do espectrofotómetro

dado que é o instrumento utilizado na realização das medições espectrofotométricas.
O princípio básico por trás do funcionamento de um espectrofotômetro é a

polarização da luz que passa através de uma amostra (Figura 3). Quando a luz passa
através de uma amostra, ela é absorvida ou transmitida em diferentes proporções,
dependendo do comprimento de onda da luz e do material em análise. A absorvência

da luz é diretamente proporcional à concentração de solução da amostra. (Santos)

04
Figura 3 - Esquema processo da espectrofotometria

Curvas de calibração

Os métodos colorimétricos requerem uma etapa de calibração no

espectrofotómetro utilizando uma curva de calibração. A curva de calibração pode

ser usada para calcular o limite de deteção e limite de quantização.

A construção de uma curva de calibração envolve a preparação de uma série de

soluções padrão com concentrações conhecidas da substância de interesse, que

são analisadas através do espectrofotómetro, lidas e colocadas no gráfico para

construção da curva(Laboratório da Dra.B. Jill Venton - Universidade da Virgínia).

Ao fazer soluções para uma curva de calibração, cada solução pode ser feita
separadamente. No entanto, isso pode exigir bastante material inicial e tempo.

Outro método para fazer soluções de muitas concentrações diferentes a partir de

uma solução é usar diluições em série. Com diluições em série, uma amostra
concentrada é diluída de forma stepwise para fazer concentrações mais baixas. A

próxima amostra é feita a partir da diluição anterior, e o fator de diluição é muitas

vezes mantido constante. (Fernandes, 2013)

05
Materiais
Matéria-prima/ materiais necessários

Amostras de leite meio-gordo e leite magro;

Balões de diluição de 20 mL;

Micropipetas (1 mL e 5 mL);
Tubos de ensaio;
Reagente biureto;

Cuvetes para 540 nm;

Espectrofotómetro visível;

Procedimento
experimental
Preparação da solução padrão (figura 4)

A diluição da protéina BSA foi realizada consoante a

tabela presente no Anexo 1.

Figura 5- Preparação solução-padrão

pesou-se

um copo

perfazer 0,5g BSA

volume [20]M

adicionar dissolver
ao balão com água
Figura 4- Solução Padrão BSA

06
Teste Biureto Solução Padrão de BSA Teste Biureto Leite Meio Gordo

Figura 6- Teste do Biureto Solução Padrão Figura 7- Teste do Biureto Leite meio-gordo

solução
diluir
padrão
leite

obter preparar
concentrações diluições obter
teste
concentraç
Biureto
ões
ler realizar teste
absorvância biureto

esperar 30
ler esperar 30
minutos
absorvância min

Teste Biureto Leite Magro

Figura 8- Teste do Biureto Leite Magro

Figura 9- Resultados do teste do Biureto Solução Padrão

diluir
leite

obter
teste
concentraç
Biureto
ões

ler esperar 30
absorvância min

07
RESULTADOS E
DISCUSSÃO
Após a incubação dos tubos de ensaio por 30 minutos mediu-se,
através do espetrofotómetro, a absorvência dos mesmos
expostos a um comprimento de onda de 550nm. Este é o valor
máximo para a absorvência na reação do Biureto.

Tabela 2. Registo da absorvência dos tubos de ensaio A e B

BSA (g/L) 10 8 6 4 2 1

Absorvência - 0.66 0.13 0.10

0.606 0.401 0.318
Tubo de Ensaio A 4 9 9

0.66
Tubo de Ensaio B 0.607 0.376 0.308 0.134 0.212
6

Gráfico 1. Valor médio de Absorvência em função da concentração de BSA

08
Com base neste gráfico retiramos as informações necessárias para
determinar a concentração de proteína em cada uma das amostras.

Tabela 3. Concentração de Proteína em diferentes concentrações de BSA

[BSA] 10 8 6 4 2 1

Concentraçã
0.688 0.558 0.427 0.296 0.166 0.100
o de Proteína

Para obtenção destes resultados, através do gráfico 1, utilizámos a fórmula

dada pela reta que obtemos através da medição da absorvência.
Substituindo apenas o x da equação pelo valor da [BSA] .

Tabela 4. Diluição da Amostra de Leite

Leite Leite H2O

(Diluição) (mL) (mL)

1:5 0.20 0.80

1:10 0.1 0.90

1:20 0.05 0.95

Tabela 5. Resultados obtidos no espetrofotómetro em análise à amostra de Leite Magro

Leite Magro (Diluído) 1:5 1:10 1:20

Absorvência- Tubo de Ensaio A 0.415 0.424 0.352

Absorvência- Tubo de Ensaio B 0.455 0.405 0.351

Controlo Leite Magro (por diluir) -

0.939
Absorvência

09
Gráfico 2: Valor médio de Absorvência em função da concentração de
Leite Magro

Tabela 6: Valores da concentração de proteína para cada uma das diluições

Diluição Leite
1:5 1:10 1:20
Magro

Concentração
0.465 0.466 0.466
de Proteína

Este procedimento prático consiste na análise da concentração de proteína em

amostras de alimentos, especificamente leite magro e leite meio gordo, usando o
método do biureto. O biureto é uma reação química usada para determinar a
presença de proteínas, especialmente a albumina.
A absorvência está diretamente relacionada à concentração de proteína presente
na amostra.
A partir dos resultados obtidos foi possível construir uma curva de calibração
(Gráfico 1.) utilizando as amostras de albumina sérica bovina (BSA) com
concentrações conhecidas (Tabela 1.). A partir desta curva, é possível determinar a
concentração de proteína nas amostras de leite.
A absorvência do leite magro diluído foi de 0.415, 0.424 e 0.352 para as diluições de
1:5, 1:10 e 1:20, respetivamente (Tabela 6.). Enquanto para o leite meio gordo diluído,
as absorvências foram de 2.483, 2.093 e 1.856 para as mesmas diluições. Estes
valores de absorvência são comparados com o controlo das amostras não diluídas
(ou seja, o leite magro não diluído tem uma absorvência de 0.939, e o leite meio
gordo não diluído tem uma absorvência de 3.00).
É possível determinar a concentração de proteína nas amostras de leite. Por
exemplo, a absorvência de 0.415 para o leite magro diluído na diluição de 1:5
corresponde a uma concentração de proteína de aproximadamente 0.465 g/L,
conforme indicado pela curva de calibração.

10
Tabela 7: Valores da concentração de proteína para cada uma das diluições

Leite Meio Gordo (Diluído) x5 x10 x20

Absorvência - Tubo de Ensaio

2.483 2.093 1.856
A

Tubo de Ensaio B 2.519 2.049 1.873

Controlo Meio Gordo (por diluir)-

3.00
Absorvência

A análise dos resultados mostra que o leite meio gordo possui uma
concentração de proteína significativamente maior que o leite
magro, como evidenciado pela maior absorvência observada nas
amostras de leite meio gordo diluídas em comparação com as de
leite magro diluídas.

11
CONCLUSÕES E Part Five

SUGESTÕES
Neste trabalho prático realizou-se um estudo para determinar a concentração de
proteínas em amostras de leite magro e leite meio gordo utilizando o método do
Biureto. Através deste método, foi possível quantificar a quantidade de proteína
presente nas amostras, aproveitando a capacidade do Biureto de reagir com as
ligações peptídicas e formar um complexo estável que produz uma coloração violeta.
Inicialmente, foi preparada uma solução padrão de albumina sérica bovina (BSA) com
concentração conhecida, permitindo a construção de uma curva de calibração. Esta
curva foi essencial para determinar as concentrações de proteína nas amostras de
leite, pois relacionou a absorvência medida pelo espectrofotômetro com a
concentração de BSA.
Após a preparação das amostras de leite e sua diluição, foram realizados os testes de
Biureto e as medições da absorvência. Os resultados obtidos foram comparados com
os valores de absorvência do controle das amostras não diluídas, permitindo calcular a
concentração de proteína em cada diluição.
Verificou-se que o leite meio gordo apresentou uma concentração de proteína
significativamente maior do que o leite magro, evidenciado pela maior absorvência
observada nas amostras diluídas de leite meio gordo em comparação com as de leite
magro.
Conclui-se que o método do Biureto é eficaz para determinar a concentração de
proteínas em amostras alimentares, sendo uma técnica rápida, simples e de baixo
custo. Além disso, a espectrofotometria se mostrou uma ferramenta útil na análise
quantitativa de proteínas, permitindo a construção de curvas de calibração para
estimar concentrações desconhecidas a partir de medidas de absorvência.
É deveras importante ter em consideração as limitações do método, como por
exemplo, as interferências de compostos reativos.
Em suma, o método do Biureto é uma técnica eficiente e económica para a
determinação de proteínas em amostras alimentares, no entanto é sempre importante
complementar a análise dos resultados com outros métodos para obter uma avaliação
mais completa da composição proteica dos alimentos ananalisados.

12
BIBLIOGRAFIA Part Five

Dossiê Proteínas. (2014). PROTEÍNAS. Revista FI, 34-43. Obtido de:

https://revistafi.com/upload_arquivos/201606/2016060316052001465318
797.pdf
Joana Fernandes. (2015, 14 de janeiro). Produção de queijo: origem dos
coalhos. Portal Agronegócios.eu. Obtido de:
http://www.agronegocios.eu/noticias/producao-de-queijo-origem-dos-
coalhos/
Poletti, B., Machado, A. T., Andrade, N. T., Rosa, C. S., Poltronieri, C. V., &
Leite, T. E. (2014). Comparação de Diferentes Metodologias para
Determinação de Proteínas em Leite Cru do Município de Dom Pedrito.
Guia Técnico- Bioquímica. Obtido de:
https://cti.ufpel.edu.br/siepe/arquivos/2014/CA_02363.pdf
Fernandes, H. (8 de junho de 2013). Bioquimica. QUANTIFICAÇÃO DE
PROTEÍNAS POR ESPECTROFOTOMETRIA. Obtido de
https://www.fciencias.com/2013/06/08/quantificacao-de-proteinas-
por-espectrofotometria/
Santos, L. R. (s.d.). Espectrofotometria de absorção no UV-Visível.
Espectrofotometria. Obtido de
https://www.infoescola.com/quimica/espectrofotometria/
Explicatorium. (s.d.). Detetar proteínas. Experiência - Detetar proteínas
com o teste do biureto. Obtido de
https://www.explicatorium.com/experiencias/detetar-proteinas.html
Nestle. (s.d.). Bem estar. Leite. Obtido de
https://saboreiaavida.nestle.pt/bem-estar/leite
Proteína – Wikipédia, a enciclopédia livre. (s.d.). Em Wikipédia. Obtido de
https://pt.wikipedia.org/wiki/Proteína
Leite – Wikipédia, a enciclopédia livre. (s.d.). Em Wikipédia. Obtido de:
https://pt.wikipedia.org/wiki/Leite
Bovine serum albumin - Wikipedia. (s.d.). Em Wikipedia.Obtido de:
https://www.sigmaaldrich.com/PT/en/products/cell-culture-and-
analysis/cell-culture-supplements-and-reagents/albumins-and-
transport-proteins/bovine-serum-albumin

13
 ANEXO 1

BSA(g/L) BSA(ml) Água destilada(ml)

10 2,5 2,5

8,0 2,0 3,0

6,0 1,5 3,5

4,0 1,0 4,0

2,0 0,5 4,5

1,0 0,25 4,75

Tabela 1-Preparação das diluições para a curva de calibração a partir

da solução padrão de albumina sérica bovina (10 g/L).

Cálculo da concentração de proteína:

y=mx+b

y=0.0653x + 0.0351

Para x=10 y=0.688

Para x=8 y=0.558
Para x= 6 y=0.427
Para x=4 y=0.296
Para x=2 y=0.166
Para x=1 y=0.100

14