Instituto Politécnico de Castelo Branco

Escola Superior de Saúde Dr. Lopes Dias

Ciências Biomédicas Laboratoriais
2ºano- 1º Semestre
2023/2024

Comparação dos efeitos dos fixadores

numa solução proteica

Discente: Catarina Sofia Baptista Diogo- 20221016

Docentes: Rute Carmo
Unidade Curricular: Histotecnologia I
Castelo Branco, 28 de Novembro de 2023

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Índice
Introdução ------------------------------------------------------------------------------------------------- 3
Material e Métodos-------------------------------------------------------------------------------------- 4
Resultados ------------------------------------------------------------------------------------------------- 4
Discussão -------------------------------------------------------------------------------------------------- 5
Conclusão-------------------------------------------------------------------------------------------------- 6
Referências Bibliográficas ------------------------------------------------------------------------------ 6

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Introdução
Fixadores consistem em soluções cujo composição é variável, através desta podem ser
classificados como simples, quando apenas correspondem a uma solução que pode ser
ou não diluída, como o formol, ou como compostos, em que ao invés de uma solução
apenas consistem numa junção de duas ou mais com poder fixador. Durante o processo
de preparação de amostras biológicas de tecidos para observação, é necessário efetuar-
se entre outros procedimentos, a fixação. Consiste na fase de preparação da amostra que
utiliza fixadores, cujo principal objetivo é impedir que se inicie o processo de autólise,
realizado por enzimas naturalmente libertadas, e putrefação consequência da
degradação por microrganismos, das células após a paragem da sua oxigenação, com o
objetivo de se manterem as estruturas o mais semelhante possível às originais. Quando
existe uma interrupção da chegada de oxigénio às células estas iniciam uma acumulação
de dióxido de carbono que promove a produção de enzimas que promovem a autólise,
com a utilização de fixadores este processo é interrompido mantendo-se as estruturas
semelhantes às in vivo. Para além de impedir a degradação, estas soluções promovem
ainda o endurecimento do tecido facilitando posteriormente o corte tal como a
estabilização das estruturas extra e intracelulares facilitando assim a entrada e outros
reagentes. Tal como o restante do tecido, com a fixação pretende-se igualmente manter
a conformação das proteínas que sobre determinadas circunstâncias, como a
temperatura, pode sofrer alteração, ocorrendo o processo de desnaturação. Os fixadores
podem ser classificados com base nas suas características e na sua capacidade de fixação
tanto química quanto física. A primeira distinção efetuada entre estes compostos remete
para 1958, ano em que Baker realizou um ensaio laboratorial utilizando clara de ovo,
composta essencialmente pela proteína albumina. A partir deste ensaio, distinguiu estas
soluções como coagulantes e não coagulantes. Esta caracterização baseia-se na sua
capacidade de coagular ou não proteínas, ou seja, de após a sua utilização ocorrer a
formação de um gel, definindo-os como não coagulantes, ou da formação de uma rede
entre as moléculas que as torna insolúveis, definindo-os como apresentando capacidade
coagulante. Este estudo revelou-se útil visto que a coagulação das proteínas implica que
ocorra alteração da sua estrutura terciária, ou seja alteração da morfologia do tecido,
enquanto fixadores não coagulantes, como apenas formam ligações entre as proteínas
promovendo a consistência de gel que posteriormente apresentam, não provocam
quaisquer alterações à morfologia original do tecido. Apesar de as alterações que
ocorrem não serem visíveis macroscopicamente, nem detetáveis sobre um microscópio
ótico, estas são percetíveis em microscopia eletrónica, bem como a alteração da
estrutura terciária dessas mesmas proteínas.
Deste modo, foi realizada uma atividade prática, baseada com a realizada por Baker em
1958 com o intuito de distinguir entre quatro fixadores (formol a 10%, etanol a 96%,
solução de Bouin, ácido acético glacial) quais apresentam capacidade coagulante e quais
não, através da utilização de clara de ovo, que na sua composição apresenta albumina
que se comporta como as proteínas plasmáticas. Esta capacidade implica que os fixadores
tenham uma maior ou menor capacidade de permitir a entrada de outros reagentes
posteriormente no tecido, como por exemplo corantes, porém implica também que
ocorra uma alteração da estrutura original do fragmento histológico, de modo que a
utilização de fixadores com capacidade não coagulante deve ser preferida à de fixadores

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com esta propriedade, principalmente em situações em que exista a observação do
fragmento histológico em microscopia eletrónica.

Material e Métodos
Relativamente ao ensaio laboratorial, utilizaram-se os seguintes materiais: luvas, clara de
ovo, recipientes de vidro (5 frascos), proveta, pompete, pipetas de pasteur, formol a 10%,
etanol a 96%, solução de Bouin, ácido acético glacial, água destilada e a hotte onde foi
realizado todo o procedimento.
Iniciou-se o procedimento com a separação da clara da gema, tendo sido descartada a
gema e apenas utilizada a clara. Adicionou-se 15 ml de uma solução fixadora, ou seja, um
frasco com formol a 10%, outro com etanol a 96% outro com ácido de Bouin, outro com
ácido acético glacial e água destilada. Este último com o objetivo de controlo
relativamente aos restantes frascos. Seguidamente colocou-se 1,5 ml da clara de ovo nos
5 frascos de vidro. Observou-se os resultados após 5 minutos, 20 minutos, e 60 minutos
avaliando-se 3 características, cor, textura/consistência e volume.

Figura 1: Copos de Precipitação identificados

Resultados
Formol 10% Etanol 96% Ácido acético Bouin H2O Destilado

Figura 2: Resultados da comparação dos efeitos de fixadores diferentes numa solução proteica, passado 60 minutos

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 Tabela 1: Resultados da comparação dos efeitos de fixadores diferentes numa solução proteica

Discussão
A análise dos resultados da figura 2, em conjunto com a tabela 1, revela que a água
destilada, conforme esperado, não induziu coagulação na albumina da clara do ovo em
nenhum dos tempos, funcionando como controle negativo para confirmar a ausência de
coagulação. Isso confere validade dos resultados obtidos.

Em relação ao formol 10%, destaca-se que, entre os quatro fixadores utlizados, é o único
que não provocou coagulação na albumina em nenhum dos tempos, indicando sua
natureza como fixador não coagulante, capaz de preservar a estrutura terciária da
albumina.

No caso do etanol a 96%, observou-se a formação de um coagulo branco e firme após 5

minutos, aumentando em tamanho aos 20 minutos e em consistência após 60 minutos.
Esses resultados indicam uma ação desidratante e desnaturante do etanol 96% na
albumina, resultando em coagulação aparente. O etanol 96% está mais associado á perda
da estrutura tridimensional do que á formação de uma rede coagulante típica de
fixadores coagulantes, evidenciando um aumento constante da desnaturação da
albumina ao longo do tempo em etanol 96%.

A solução de Bouin, composta por ácido pícrino, formaldeído e ácido acético, revelou-se
um fixador coagulante devido á presença de compostos com atividade coagulante em
sua constituição. Essa solução coagulou a albumina da clara do ovo, com um aumento no
tamanho e na consistência do coagulo após 60 minutos. O ácido acético permitiu a
coagulação branca e gelatinosa da albumina em 5 minutos, mostrando-se como um
fixador com capacidade coagulante estável ao longo do tempo (20 e 60 minutos).

Assim, o aumento do coágulo e da consistência em 60 minutos na solução de Bouin é

atribuído ao ácido pícrino e formaldeído, uma vez que o ácido acético permanece estável
durante 60 minutos. Esses compostos são os principais responsáveis pela capacidade
coagulante da proteína albumina na solução de Bouin. Esses resultados contribuem para
a compreensão das características e efeitos dos diferentes fixadores em estudos de
histologia e preservação de tecidos.

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Conclusão
A atividade laboratorial focou-se no estudo dos efeitos de diferentes fixadores (formol
10%, etanol 96%, ácido acético e solução de Bouin) em uma solução proteica,
especialmente na albumina presente na clara do ovo. A análise revelou a atividade
coagulante de alguns fixadores, que induziram a coagulação de proteínas ao formar uma
rede tridimensional, estabilizando e preservando a estrutura, crucial em estudos onde a
preservação da arquitetura tecidual é essencial.

Paralelamente, foram examinados fixadores com atividade não coagulante, preservando

a morfologia celular ao evitar a coagulação de proteínas. O formol a 10% foi identificado
como um fixador não coagulante, enquanto o ácido acético e a solução de Bouin foram
reconhecidos como fixadores coagulantes, embora a consistência e tamanho do coágulo
variassem com o tempo.

A solução de Bouin, composta por ácido pícrico, formaldeído e ácido acético, agiu como
fixador coagulante, coagulando a albumina e resultando em um aumento do coágulo e
consistência após 60 minutos. O ácido acético na solução contribuiu para uma coagulação
branca e gelatinosa em 5 minutos, mantendo-se como um fixador coagulante estável ao
longo do tempo (20 e 60 minutos). O aumento do coágulo em 60 minutos na solução de
Bouin foi atribuído principalmente ao ácido pícrico e formaldeído, já que o ácido acético
formou um coágulo estável com o tempo.

Em relação ao etanol 96%, observou-se uma coagulação aparente devido à desnaturação

da albumina, sem a formação de uma rede tridimensional.

Concluindo, a capacidade coagulante ou não dos fixadores representa uma característica

crucial que pode influenciar a conformação das células originais, especialmente em
relação aos seus componentes proteicos. Portanto, compreender as propriedades
específicas do fixador em relação aos objetivos laboratoriais e à natureza da amostra é
fundamental, desempenhando um papel significativo na qualidade e validade dos
resultados obtidos.

Referências Bibliográficas
• Apontamentos retirados pela discente no âmbito de aula teórica e prática da
unidade curricular de Histotecnologia I;
• Procedimento da experiência fornecido pela docente;
• Carson, F. L., & Hladik, C. (2009). Histotechnology, a self-instructional text (3rd ed).
American Society for Clinical Pathology;
• SUVARNA, S Kim, LAYTON, Christopher, BANCROFT John D, - Bancroft’s theory and
practice of histological techniques.