Sex dimorphism in late gestational

sleep fragmentation and metabolic

dysfunction in offspring mice
Matheus Peixoto Dantas
Orientadora: Hanna Karen Moreira Antunes
SLEEP= 6,313
INTRODUÇÃO

• A saúde materna durante a gestação é fundamental para prever os

resultados fetais e doenças adultas mais tarde na vida
• Além disso, alguns distúrbios metabólicos, que se manifestam na vida
adulta, podem ter suas raízes durante o desenvolvimento inicial e
refletem a programação fetal, o processo pelo qual o mesmo genótipo
pode dar origem a fenótipos divergentes de acordo com as condições
ambientais iniciais.
• Além disso, as manifestações clínicas de várias doenças metabólicas
epigeneticamente associadas, como diabetes e obesidade, parecem
exibir diferenças substanciais relacionadas ao gênero.
INTRODUÇÃO

• A apneia obstrutiva do sono (OSA) é a forma mais prevalente de

distúrbios respiratórios do sono (DRS), tanto em adultos quanto em
crianças.
Doenças cardiovasculares
Hipóxia intermitente crônica
Doenças metabólicas

frequência de ronco
sono perturbado
cansaço diurno
diminuição do estado de alerta diurno
má qualidade do sono
INTRODUÇÃO

• Vários estudos avaliaram a associação entre sintomas de SDB na

gravidez e resultados fetais adversos, mas todos esses estudos foram
especificamente circunscritos ao período pós-natal imediato e não
exploraram as consequências a longo prazo do sono perturbado durante
a gestação.
• Em um estudo recente, mostramos que a fragmentação do sono durante
o final da gestação em um modelo murino induziu distúrbios
metabólicos substanciais em camundongos descendentes de machos
quando atingiram a idade adulta.
• No entanto, não examinamos se esse efeito de longo prazo do SF
também era aparente na prole feminina.
• De fato, considera-se que o dimorfismo sexual da composição corporal, especialmente no
que diz respeito à distribuição do tecido adiposo, modula o risco de obesidade, diabetes e
distúrbios metabólicos associados - taxa metabólica e no gasto de energia, bem como na
deposição e mobilização de gordura
• Por exemplo, indivíduos do sexo feminino exibem distúrbios metabólicos relacionados à
obesidade menos graves, como resistência à insulina, do que indivíduos do sexo masculino.
• Por exemplo, filhos de mães obesas têm maior probabilidade do que filhas de se tornarem
obesos e resistentes a insulina à medida que amadurecem, embora nenhuma diferença no
peso ao nascer possa ser aparente
• Em modelos animais, apenas filhotes de ratos machos expostos à desnutrição materna
durante o período de reimplante exibem pressão arterial elevada e ambientes nutricionais
maternos interrompidos provocam seletivamente consequências adversas em machos
filhos.
Objetivos
• Neste estudo, examinamos os potenciais efeitos dimórficos sexuais de
fragmentação do sono durante o final da gestação na programação da
função metabólica na prole adulta com ênfase especial nos genes das
adipocitocinas
Métodos
• Todos os experimentos foram aprovados pelo comitê de cuidados com
animais da Universidade de Chicago (protocolo IACUC nº 72169).
• Camundongos machos e fêmeas C57BL/6J
• 7 dias de aclimatação
• Os animais foram alimentados com ração normal e foram alojados em
um ambiente controlado com ciclos claro-escuro de 12 horas (07:00 às
19:00) em temperatura constante (24 ± 2°C) com acesso ad libitum a
comida e água

Deakin University Human Research Ethics Committe (2016-028)

• Macho adulto e fêmea virgem com 3 meses de idade foram utilizados
para reprodução para gerar apenas uma ninhada.
• Machos foram removidos após inspeção da fêmea
• Após 14 dias, as fêmeas foram divididas em grupo com sono normal e
fragmentação de sono
• Fragmentação de sono – gaiola motorizada
• 5 dias (14 – 19) – estímulo tátil
• Durante a lcatação, todas as mães foram alimentadas com ração
regular com baixo teor de gordura e os filhotes mantidos com suas
mães até o desmame
Prole
• Depois de serem desmamados, filhotes machos (ou seja, SCOM e
SFOM) e camundongos fêmeas (ou seja, SCOF e SFOF) foram
colocados em gaiolas individuais, tiveram acesso irrestrito a água e
dieta regular
• Os pesos corporais de cada um dos camundongos descendentes (SC ou
SF) foram avaliados desde o nascimento até 20 semanas de idade.
• Todos os animais foram monitorados periodicamente quanto a sinais
de morbidade, mortalidade e pelo eriçado. O peso corporal e a
ingestão alimentar foram medidos semanalmente no mesmo horário.
Instrumentos
• O teste de tolerância à glicose intraperitoneal (GTT) foi realizado às 20
semanas de idade.
• Camundongos foram injetados com glicose (intra-peritoneal 2 mg/g de peso
corporal) após 3 h de jejum
• Amostras de sangue para determinação de glicose foram coletadas em tubos
capilares revestidos com heparina da veia da cauda em 0, 15, 30, 60, 90 e 120
min.
• Camundongos foram injetados intraperitonealmente com insulina (0,25
U/kg de peso corporal) e amostras de sangue foram coletadas através
da veia da cauda de cada camundongo, e os níveis de glicose foram
medidos imediatamente usando um glicosímetro OneTouch Ultra2
• Os níveis de insulina plasmática, leptina e adiponectina foram
examinados usando kits de ensaio imunossorvente ligado a enzima
• Perfis lipídicos, incluindo colesterol total e triglicerídeos (TG) foram
determinados usando kits Infinity
• Expressão de RNA: Os genes-alvo incluíram: proteína quimioatraente
de monócitos 1 (MCP-1), fator de necrose tumoral-α (TNF-α), leptina,
receptor de leptina, adiponectina, receptores 1 e 2 de adiponectina,
interleucina 6 (IL-6) , Fizz-1 (“Encontrado na zona inflamatória” e
também referido como RELMα para molécula semelhante à resistina α)
e IL-10, e seus níveis de expressão foram avaliados por qRT-PCR
usando RNA de alta capacidade para complementar DNA
• Citometria de fluxo: Macrófagos M1 e M2
• O DNA genômico foi isolado de fígado de camundongo, músculo
esquelético e tecidos viscerais usando sistema automatizado (Promega,
Madison, WI, EUA) de acordo com o protocolo do fabricante.
• Pirosequenciamento quantitativo de bissulfito foi usado para
determinar a porcentagem de metilação em sítios CpG individuais
dentro da região diferencialmente metilada 0 e promotores. Os ensaios
realizados neste estudo incluíram adiponectina, leptina e regiões
promotoras do gene do receptor de leptina
Análise estatística
• SPSS
• Anova one-way ou Two-way
• Post-hoc Tukey Kramer
• Teste T não pareado
Resultados

Após 20 semanas de idade, SFOM

exibiu aumento de peso corporal
(~10% maior versus SCOM; P <
0,0001) e consumiu mais
alimentos ingeridos g/semana (P <
0,0001; Figura 1C).
Essas diferenças no peso corporal
começaram a surgir por volta da
11ª a 12ª semana de vida no
SFOM, mas estavam totalmente
ausentes na prole feminina
SFOM exibiu massas SCAT e VWAT maiores em comparação com SCOM (VWAT: P < 0,02;
SCAT: P < 0,04). No entanto, não houve diferenças significativas nesses dois depósitos de
tecido adiposo entre SFOF e SCOF.
Leptina
Receptores de leptina
Adiponectina
Receptores de ADI
Exposições SF no utero estão associadas com
aumento do número de macrófagos no VWAT
SVF de machos, mas também em fêmeas
(Figura 6; n = 8/grupo experimental).

No entanto, embora tais aumentos tenham sido

representados principalmente por macrófagos
exibindo o fenótipo pró-inflamatório M1 em
machos (isto é, aumento de CD11c/CD206;
Figura 6),

mostrou reduções na predominância de

macrófagos pró-inflamatórios (Figura 6; n =
8/grupo experimental). Digno de nota, SCAT
manifestou um padrão divergente de mudanças
de polaridade (Figura 6).
Resumo tabela 3
• Globalmente, camundongos SFOM exibiram metilação aumentada de
AdipoQ, particularmente em VWAT (Tabela 3).
• De fato, encontramos quatro sítios Cytosine-phosphate-guanine (CpG) no
AdipoQ nas posições (+12, +176, +8740 e +8749) do sítio de início da
transcrição (TSS) que mostraram aumento da metilação no SFOM em
comparação com camundongos SCOM (Tabela 3),
• enquanto no SFOF houve foi apenas um sítio CpG em AdipoQ em que
a metilação aumentada foi encontrada na posição +95 de TSS.
• O aumento da metilação nos locais CpG também foi encontrado para AdipoQ
em SFOM apenas no fígado e músculo esquelético
• Com base nessas descobertas, analisamos os níveis de expressão
gênica para DNA metiltransferases (DNMTs), incluindo DNMT1,
DNMT3a e DNMT3b em VWAT em todos os quatro grupos
experimentais.
• Não encontramos evidências de diferenças significativas na expressão de
mRNA de DNMT1 em SFOM em comparação com SCOM ou entre SFOF e
SCOF (Tabela 4).
• No entanto, a expressão de DNMT3a e DNMT3b foi acentuadamente
aumentada em SFOM (P < 0,002 e P < 0,003, respectivamente; Tabela 3),
enquanto em SFOF tais alterações estavam totalmente ausentes (Tabela 4).
Discussão
• Neste estudo mostramos que a fragmentação do sono durante a gestação
está associada a profundas alterações metabólicas,como obesidade,
resistência à insulina e lipídios séricos anormaisna prole masculina
(SFOM), mas não em suas ninhadas fêmeas(SFOF).
• Causa do dimorfismo sexual?
• Encontramos expressão gênica alterada e níveis plasmáticos de adipocinas, bem
como grandes diferenças nas populações de macrófagos, particularmente no
VWAT.
• Além disso, a polaridade dos macrófagos também foi distintamente afetada em
SFOM e SFOF, com o SFOM exibindo abundância aumentada do fenótipo de
macrófago M1 pró-inflamatório, enquanto o oposto, ou seja, abundância
aumentada de M2, era aparente nos tecidos VWAT de camundongos SFOF.
• Doenças crônicas podem não ser fruto exclusivo das nossas ações no
presente
• Estudos de modelos humanos e animais demonstraram que a
predisposição para intolerância à glicose, pressão sanguínea e doença
cardíaca coronária pode ter origem na vida fetal.
• Dimorfismo sexual – Dieta controlada para evitar viés alimentar e
isolar o sono??
• Baixo teor de gordura
• Alimentação ad libitum
• No entanto, não podemos ter certeza de que a composição do leite
materno e a capacidade geral de lactação e a disposição das mães
expostas ao SF não foram afetadas, embora nenhuma evidência de
trajetórias alteradas de peso corporal tenha sido aparente durante as
primeiras 3 semanas de vida até o desmame.
• Em nosso estudo, mostramos aumentos estatisticamente significativos
no peso corporal, ingestão calórica e massa de tecido adiposo em
filhotes machos expostos durante a gestação a SF quando comparados
a camundongos machos controle, e que tais mudanças estão ausentes
em filhotes fêmeas expostos
• Acúmulo do tecido adiposo pode promover inflamação de baixo grau
• Os camundongos SFOM, mas não os camundongos SFOF, exibiram
aumentos nos níveis plasmáticos de colesterol e triglicerídeos, bem
como aumentos no HOMA-IR e alterações nas respostas GTT e ITT
indicativas de resistência sistêmica à insulina.
• A distribuição diferencial de tecidos adiposos na SFOM poderia ser a fonte
primária de processos pró-inflamatórios, de modo que a expansão acelerada do
VWAT na SFOM poderia gerar condições que levassem à liberação de uma
ampla gama de pró-inflamatórios e anti-inflamatórios mediadores que foram
associados ao desenvolvimento de resistência à insulina e tolerância à glicose.