Profa. Dra.

Fernanda de Rezende Pinto

 
 Urina / Soro / LCR
 Visualização de espiroquetas – lâmina – microscópio de campo
escuro (objetivas: 10x e 20x)

 Espiroqueta x leptospira

 Resultado:
 Soro: encontrar uma ou mais espiroquetas características por
morfologia e movimentos: ESPIROQUETEMIA
 Não encontrar espiroquetas: AUSÊNCIA DE ESPIROQUETEMIA NA
AMOSTRA ANALISADA
 Urina: ESPIROQUETÚRIA / AUSÊNCIA DE ESPIROQUETÚRIA
 
 Leptospiras (antígeno) sofrem aglutinação na presença dos
anticorpos no soro

Negativo Positivo
• Microplaca = 96 poços
• Luvas / jaleco
• Lâmina de vidro
• Micropipetas (mono e multicanal)
• Ponteiras
• Tubos de vidro (tampa) – diluição soro e cultura
• Descarte: hipoclorito sódio 5% ou pinho-sol 1:256
 Cultura de leptospiras (sorovares)
 Bateria de culturas da OMS + isolados locais (antígenos)
 Meio de cultura líquido: EMJH
 Solução salina fisiológica (0,85%)
 Soros a testar

 Ex: bateria de cultura

 Sorogrupo: Grippotyphosa / Sorovares: grippotyphosa (8)

 Sorogrupo: Icterohaemorragie / Sorovares: copenhagi

(10A); lai (10G)
 Controles Positivos e negativos

 Controle positivo: soro positivo (Acs contra leptospira) mais

de um sorovar

 Controle negativo interno (sem soro) – 20µL Ag + 20µL sol.

salina

 Microscópio de campo escuro (objetivas 10x, 20x e 40x)

 Estufa 30ºC
• Considerar reação positiva na sorologia de triagem (título)

• Humano e caninos domiciliados: 1/25

• Sinais: 2 a 3 dpi  médico
• Dono do cão – visualiza início dos sinais clínicos

• Bovinos: 1/100
• Aborto – ajuda veterinário (tempo maior – produção maior de
Acs)

• Janela imunológica – tempo que o sistema imune necessita

para produzir Acs em nível suficiente para ser detectado
 Usar um sorovar de cada sorogrupo (no mínimo)

 Sorovares locais

 Sorovares de mesmo sorogrupo: determinantes

antigênicos comuns  reação cruzada entre sorovares

 Também pode ocorrer reação cruzada entre sorogrupos

diferentes
 Tubo com cultura de leptospiras (meio líquido EMJH)
 Olhar contra a luz – contaminação
 Densidade (quantidade de leptospiras – densidade)
 1 gota lâmina: MCE – contagem (verificar o nº lept. por campo,
se há auto-aglutinação)

 Repique semanal: 10% volume para outro tubo

2 a 3 dias (30°C)

 Usar como antígeno no teste: 7 a 14 dias no meio

 Poços da primeira linha (A) – colocar o controle negativo
interno do teste (antígeno = cultura de leptospira e
solução salina)

 20 µL Ag + 20 µL sol.
 Linha A: colocar o Ag diluído em salina (diferentes sorovares em
cada poço)
20 µL sol. salina + 20 µL do Ag
CONTROLE NEGATIVO
INTERNO (sem soro)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A Ag 1 Ag 2 Ag 3 Ag 4
B
C
D
E
F
G
H
 Diluição do soro – sempre a metade do ponto de corte da
leitura do resultado

 Humano ou cão domiciliado: diluição do soro adicionado à

microplaca: 1: 12,5

 Bovino: 1: 50

 Quando se adiciona o Ag o volume final no poço da

microplaca dobra, e assim, a diluição também dobra (1:25
e 1:100)
 Primeiro faz a diluição inicial 1:5
 100 µL do soro em 400 µL de solução salina

Soro diluído 1:5

100 µL do soro teste 400 µL salina

 Em seguida, faz a segunda diluição: a partir da diluição 1:5.
 A segunda diluição é metade do valor da diluição de leitura no teste
 Ex: Leitura 1:25 Diluição do soro: 1:12,5 (Humano, cão)

Diluição 1:12,5
400 µL do soro diluído 1:5 +
Soro diluído 1:5 600µL salina
 Segunda diluição: a partir da diluição 1:5
 Leitura 1:100 Diluição do soro: 1:50 (bovino)

Diluição 1:50
200 µL do soro diluído 1:5 +
Soro diluído 1:5 1800 µL salina
 Cada linha B até H: Soro a testar
B = soro do bovino 1
CONTROLE NEGATIVO C = soro do bovino 2
INTERNO (sem soro)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A Ag 1 Ag 2 Ag 3 Ag 4
B
C
D
E
F
G
H

1º: 20µL do soro (diluído 1 / 50 ) do bovino 1

2º: 20µL do Ag (em cada soro a ser testado)  1 / 100 (dobro volume e
dilui para 1:100) – O Ag é a cultura de leptospira mantida em tubo de vidro
no meio de cultura líquido EMJH.
 Cada linha B até H: Soro a testar
B = soro do bovino 1
CONTROLE NEGATIVO C = soro do bovino 2
INTERNO (sem soro)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A Ag 1 Ag 2 Ag 3 Ag 4
B
C
D
E
F
G
H

• Agitar a placa  agitador de placa para homogeneizar

• Incubar em estufa a 30ºC por 1 a 3 horas
 Agitar a placa  agitador de placas

 Estufa 30°C por 1 a duas horas

 Diluição do soro, reação (manhã)

 Leitura: logo após almoço

 Leitura dos resultados: microscópio de campo escuro –

visualizar se há aglutinação (Ag + Acs – soro)
 Soros a testar

1ª gota – controle negativo interno (sem

soro) = Ag com leptospiras livres 1 gota (3 a 5 µL) – placa
Objetiva de 10 x
Verificar se não há aglutinação nas Tempo de leitura não > 1,5 hora
leptospiras do antígeno (auto-aglutinação)
Comparar o controle negativo interno com
os soros a testar
• Reação positiva para aglutinação: redução maior que 50% das leptospiras vivas
(livres)
• Aglutinação em mais de 50%
• Redução da densidade do Ag = aglutinação
 Negativo Positivo

Soro (anticorpos) + antígeno (leptospiras)

 Resultado: não é o título final do soro do bovino!

 Informa apenas: reação positiva ou negativa (título é

fixo no teste) para um sorovar

 Testede triagem: indica a presença de Acs no soro,

mas não necessariamente a presença da doença

 Soros reagentes na triagem  sorologia / titulação

 
 Testar o soro com sorovares que apresentaram reação
positiva (aglutinação) no teste de triagem

 Usar apenas os sorovares que reagiram com o soro

teste na sorologia de triagem

 Diluição seriada nos soros a testar (diluições dobradas)

 Indica a titulação real do animal/pessoa

 Soro humano (diluições  Soro bovino
possíveis em uma
microplaca)
 1:100
 1:25
 1:200
 1:50
 1:400
 1:100
 1:800
 1:200
 1:1.600
 1:400
 1:3.200
 1:800
 1:6.400
 1:1600
 Em cada pocinho da primeira linha (por coluna)  Antígeno ( 20µL
de sol. Salina + : 20µL do Ag) = controle negativo interno

CONTROLE NEGATIVO
INTERNO (sem soro)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A Ag 1 Ag 2 Ag 3 Ag 4
B 1:25
C 1:50
D 1:100
E 1:200
F 1:400
G 1:800
H 1:1600

Cada coluna (B até H): um soro a testar para cada sorovar (Ag)
Cada linha é uma diluição do soro teste (diluições seriadas)
 Em cada pocinho da primeira linha (por coluna)  Antígeno ( 20µL
de sol. Salina + : 20µL do Ag)

CONTROLE NEGATIVO
(sem soro)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A Ag 1 Ag 2 Ag 3 Ag 4
B 1:25
C 1:50
D 1:100
E 1:200
F 1:400
G 1:800
H 1:1600

1º: Cada coluna (C até H): 20µL de sol. Salina

2º: Poço B: 40 µL do soro diluído 1:12,5 (sem salina)
 Diluição seriada do soro teste:
20 µL soro 1:12,5 (B)  Poço C (1:25)  Poço D (1:50)  Poço E
(1:100)  Poço F (1:200)  Poço G (1:400)  Poço H (1:800) 
desprezar 20 µL finais

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A Ag 1 Ag 2 Ag 3 Ag 4
B 1:25
C 1:50
D 1:100
E 1:200
F 1:400
G 1:800
H 1:1600

Adicionar 20 µL do Ag (cultura de sorovar de leptospira mantido em tubo de

vidro com meio de cultura EMJH) em cada poço com soro  dobro o volume
contido no poço  dobro a diluição  alcança o título de leitura do soro
 Agitar a placa  agitador de placas

 Estufa 30°C por 1 a duas horas

 Leitura

 Microscópio de campo escuro – visualizar se há

aglutinação (Ag + Acs – soro)
 Soros a testar

1:25 1:100 1:400 1:1600

1:50 1:200 1:800

1ª gota – controle negativo (sem soro)

Cultura de leptospiras 1 gota (3 a 5 µL) – placa

Objetiva de 10 x ou 20X
Se não há aglutinação Tempo de leitura não > 1,5 hora
Comparar com os soros a testar
 Fechar diagnóstico: Clínica + Epidemiológico + Título

 Bovino: Aborto + Roedores/Aguada + título > 1:400

 Sorovar infectante: título mais alto

 2 sorovares com mesmo título: resultado positivo para os

dois títulos (reação cruzada ou infecção pelo 2)
 Diluir mais o soro  descobrir qual desses 2 sorovares é
infectante (título mais alto)
 Ou infecção por um sorovar não existente na bateria
 Diferenciar sorovar: estudos epidemiológicos ou
vacinação

 Para clínica não interessa: tratamento é o mesmo

 Título vacinal: bovino até 6 meses pós vacinação

 Título 1:400
 Perguntar: quando foi a vacinação, para quais sorovares
 Sem clínica nem evidência epidemiológica = vacinal
 Título vacinal: bovino até 6 meses pós vacinação
 Título 1:400

 Tem clínica + epidemiológico

 Título alto de sorovar diferente do encontrado na vacina
 doença
 Ideal é fazer diagnóstico sorológico populacional

 Amostra representativa:
 Animais que abortaram (3-4 dias após aborto – queda
imunidade – sem Acs) + outras categorias

 Títulos altos e baixos

 Vaca aborto + > 1:400  infectado (não precisa novo teste)

 1:100 (início ou fim infecção0  7-10 dias (PI: 2-14 dias,

média 7 d)  nova coleta  soroconversão