ROTEIRO PARA O RELATÓRIO DAS AULAS PRÁTICAS

DISCIPLINA: BACTERIOLOGIA CLÍNICA (DF 232)

NOME DO ALUNO: Tainá da Silva Dias dos Santos

RELATÓRIO NÚMERO 1

ASSUNTO: BASTONETES GRAM NEGATIVOS-FERMENTADORES DA GLICOSE_

CITOCROMOXIDASE NEGATIVOS

MATERIAL ESTUDADO: Amostra nº 3

DESENVOLVIMENTO

1) MEIO(S) DE CULTURA(S) UTILIZADO(S) PARA O ISOLAMENTO DAS COLÔNIAS

(Composição + características, características das colônias crescidas e resultado dos testes)
● Ágar McConkey: meio possui peptona e polipeptona como fonte de C, lactose é o único carboidrato
e serve para diferenciar bactérias fermentadoras ou não de lactose, sais biliares e cristal violeta para
selecionar bactérias gram negativas, já que bactérias gram positivas não crescem na presença de sais
biliares. O vermelho de neutro é indicador de pH. Bactérias fermentadoras de lactose intensas
produzem colônias vermelhas circundadas por zona de bile precipitada e fermentadores lentos ou
fracos podem ter colônias de rosadas até incolores. Os não fermentadores formam colônias incolores.
● Ágar EMB e EMB Levine: O ágar EMB possui peptona como fonte de C, lactose e sacarose como
carboidratos (não é possível saber qual açúcar fermentou), diopotássio, ágar, eosina Y, azul de
metileno como indicador de pH e agá destilada. Já o EMB Levine possui só lactose, então os testes
precisam ser feitos com os 2 meios para saber qual açúcar fermentou. As colônias fermentadoras
intensas de lactose são vistas com cor negro-esverdeadas com brilho metálico. Os fermentadores
fracos produzem coloração transparente.
● KIA (Kligger Iron Agar): O meio possui peptona como fonte de C, 1g de glicose e 10 g de sacarose
para observar a fermentação desses açúcares. O complexo escuro formado para a indicação de
produção do gás H2S é composto por sulfato ferroso, trissulfato de sódio e cloreto férrico, igual ao
TSI. O meio inicialmente é vermelho devido ao vermelho de fenol. Também possui extrato de carne
e levedura, ágar e água destilada. Como resultado, alcalino/alcalino (vermelho) indica ausência de
fermentação de carboidratos. Alcalino (vermelho) na rampa e ácido (amarelo) no fundo indica
fermentação de glicose e ausência de fermentação de lactose. Alcalino na rampa e fundo preto indica
fermentação de glicose, ausência de fermentação de lactose e produção de H2S. Meio todo ácido
(amarelo) indica fermentação da glicose e lactose.
● TSI (triplo sugar iron): meio sólido de composição 1g de glicose, 10 g de lactose e 10 g de sacarose
para observar a fermentação desses 3 açúcares pela bactéria. Além disso, possui sulfato ferroso,
trissulfato de sódio para ver se forma H2S, e cloreto férrico, que indica a produção de H2S. Esses
últimos formam um complexo de cor escura quando há a produção do gás H2S. A rampa do tubo
possibilita ver a oxidação, que quando ocorre deixa a rampa amarela, e o fundo permite ver a
fermentação. Coloração amarela uniforme: fermentação da glicose, lactose e/ou sacarose; - Bolhas de
gás do meio: gás a partir da glicose; - Escurecimento do meio: produção de H2S; - Meio amarelado
na base e inalterado na superfície indica fermentação apenas da glicose.
● Meio de Hugh e Leifson (O/F glicose): meio com concentração de peptona reduzida (de 10g para
2g) para evitar formação de substâncias alcalinas que podem mascarar a pequena acidez formada
pela via oxidativa. A concentração do carboidrato é aumentada (de 0,5% a 1%) para manter a acidez
da oxidação. A concentração de ágar é reduzida (de 1,5% a 0,3%) para deixar o meio semi-sólido
para permitir que os ácidos se formem na superfície do ágar e permeiem o meio. Usa um indicador
de pH sensível e que detecta a pequena acidez – azul de bromotimol.
● Ágar nitrato (nitrato): O ágar nitrato é composto por extrato de carne bovina, peptona, nitrato de
potássio (KNO3), presente para ver se a bactéria reduz nitrato em nitrito, ágar e água destilada. Ele
deve ser utilizado para o teste de redução de nitrato, primeiramente é feita a inoculação da bactéria
no meio e, depois da incubação, utilizar o reagente de Nessler, com o reagente A, composto de alfa-
naftilamina e ácido acético, e o reagente B, composto de ácido sulfanílico e ácido acético. O meio
fica vermelho quando indica presença da redução do nitrato, o não aparecimento da cor indica teste
negativo ou a desnitrificação de nitrato para nitrogênio gasoso, sendo este ultimo revelado pela
adição de reagente de Limallia de Ferro ou Zinco.
● Meio líquido de triptofano (indol): é um meio líquido, que possui na composição triptofano 1%,
peptona, cloreto de sódio e água destilada. Utiliza-se em conjunto o reagente de Kovac, composto
por álcool amílico p- dimetilaminobenzaldeído e HCl concentrado. O p- dimetilaminobenzaldeído
reage com indol e forma um complexo vermelho, indicando teste positivo. Se for indol negativo,
formará um anel amarelo.
● Meio Clark e Lubs (VM/VP): é um meio líquido composto por polipeptona, glicose, fosfato
dipotássio e água destilada. Para os testes VM e VP, o meio deve ser inoculado e incubado. Para o
este VM, deve-se utilizar o reagente de vermelho de metila, a qual indica a presença de ácidos
suficientes para manter o pH ácido após 48/72h do teste, deixando o meio vermelho e com resultado
VM positivo, se ficar amarelo é VM negativo. Já para o teste VP, deve-se adicionar alfa-naftol, que é
um catalisador que produz cor vermelha, e KOH e agitar. Se aparecer cor vermelha em 15 minutos
indica a presença de diacetila, indicando teste VP positivo.
● Ágar de Simmons (citrato): O meio possui diidrogênio fosfato de amônio como fonte de
nitrogênio, fosfato dipotássio, cloreto de sódio, citrato de sódio como fonte de carbono inorgânico,
sulfato de magnésio, ágar, azul de bromotimol como indicador de pH e água destilada. O pH neutro é
de dor verde, se o pH tornar-se alcalino e de cor azul, indica que houve metabolização da fonte de N.
Se a cor for inalterada e sem crescimento bacteriano, o teste é negativo.
● Ágar ureia de Christensen (urease): meio composto por peptona, glicose em baixa concentração
para ser uma fonte rápida de energia, abaixar o pH e ativar a enzima urease, ureia em alta
concentração para ser usada depois da glicose, cloreto de sódio, fosfato monopotássico, vermelho de
fenol como indicador de pH, ágar e água destilada. Em primeiro momento o meio fica amarelo pela
metabolização da glicose, se houver ativação da urease rápida, o meio torna-se vermelho, se for
lento, a rampa fica vermelha primeiro e a base amarela, se não houver ativação da ureia, o meio
permanece amarelo.
● Ágar fenil alanina (FAD): meio é composto por alfa-fenilalanina, extrato de levedo como fonte de
C e N, cloreto de sódio, fosfato dissódico, ágar e água. Não pode ser utilizado extrato de carne ou
hidrolisados de proteína, devido ao conteúdo natural e variável de fenilalanina. A bactéria deve ser
inoculada no meio inoculado e é incubando. Depois é necessário utilizar o reagente de cloreto férrico
com HCl concentrado e água destilada, pois o reagente é o revelador do ácido fenil pirúvico formado
 se houver a ação da enzima fenilalanina desaminase (FAD) com a alanina. Se aparecer a coloração
verde, há o ácido e o teste é positivo.
● Meio de descarboxilase de Moeller (descarboxilases): meio composto por peptona como fonte de
C, extrato de carne bovina como fonte de N, cresol vermelho e bromocresol púrpura como
indicadores de pH, glicose para ser fonte rápida de metabolização, pirridoxal e água destilada. Para
cada teste de descarboxilases, o meio deve ser preparado igual e somente adicionar uma
descarboxilase por tubo, sendo elas lisina, ornitina ou arginina mais a bactéria que será inoculada.
Para que a reação seja mais rápida sem a presença de oxigênio, é adicionado em cima do meio uma
camada de óleo mineral. Os indicadores de pH são lilás em meio neutro, após 6-8h de incubação, o
meio torna-se ácido (amarelo) devido a fermentação da glicose e serve para ativar as descarboxilases
(se presentes), se tornar-se roxo, indica que a bactéria descarboxilou e o pH mudou para alcalino,
sendo resultado positivo para a descarboxilase utilizada no teste. Se permanecer amarelo, o teste é
negativo, pois o meio ácido não teve nenhuma descarboxilase para ativar.
2) TESTES FENOTÍPICOS (OU BIOQUÍMICOS) REALIZADOS PARA A IDENTIFICAÇÃO
BACTERIANA (princípio do teste, meio de cultura utilizado, princípio / fundamento/ finalidade do
teste utilizado e resultados)
● Teste da fermentação Glicose/ Sacarose/ Lactose: o teste vê a se há a fermentação de glicose,
sacarose e/ou lactose em um meio. Além disso, também vê se há a formação de gás H 2S. Os testes
podem ser feito no meio TSI (para os 3 açúcares) ou KIA (para glicose e sacarose). A bactéria é
inoculada no meio e pode-se ter os seguintes resultados de acordo com o pH do meio e a produção
ou não do gás no meio TSI: Coloração amarela uniforme: fermentação da glicose, lactose e/ou
sacarose; - Bolhas de gás do meio: gás a partir da glicose; - Escurecimento do meio: produção de
H2S; - Meio amarelado na base e inalterado na superfície indica fermentação apenas da glicose. Já
no KIA: O teste indica fermentação de glicose quando, após 6-8h o pH é acidificado pela produção
de ácidos fortes (pH 4,0-4,5) e muda o meio de vermelho para amarelo, permanecendo amarelo até
24h depois da inoculação da bactéria no meio. A glicose é oxidada quando, após 6-8h houve a
produção de ácidos fracos (pH 6,4-6,8) tornando o meio amarelo e, ativando a enzima
descarboxilase, que neutraliza o pH dos ácidos fracos produzidos inicialmente e o meio volta a ser
vermelho. Quando há fermentação da lactose, a base do meio oxida a lactose por meio de ácidos
fracos, tornando o meio amarelo, já o pico fermenta a lactose, formando ácidos fortes e deixando o
meio amarelo também. Se houver formação do gás H2S, o meio terá também a formação de uma cor
escura.
● O/F glicose: Diferencia bastonetes gram negativos quanto à capacidade de usar carboidratos
(principalmente glicose) pela via oxidativa ou fermentativa. O princípio é que a metabolização da
glicose pela via fermentativa produz ácidos mistos relativamente fortes (pH=3,0-4,0) que podem ser
detectados por provas de fermentação convencional. Já pela via oxidativa há a formação de ácidos
fracos (pH=6,0-6,8), que precisam de um meio mais sensível para detecção, com indicador sensível
de pH. O teste é feito no meio O/F de Hugh e Leifson, com 2 tubos de ensaio com o meio e a
bactéria inoculada, a qual um é o tubo aberto e o outro fechado, sendo que o fechado possui uma
camada de óleo para retirar o O 2 para ver a via fermentativa. Quando há produção de ácido, a cor
verde do meio se torna amarelo. No tubo aberto ácido (amarelo) e no tubo fechado alcalino (verde) o
metabolismo é oxidativo. Se for ácido (amarelo) no tubo aberto e fechado o metabolismo é
fermentativo. Se for alcalino (verde/azul) no tubo aberto e fechado o metabolismo é não-sacarolítico.
● Redução NO3 🡪 NO2: usada na identificação de bacilos gram negativos da Ordem Enterobacterales,
pois o teste identifica a produção de enzima nitrato redutase, que reduz nitrato a nitrito. O teste é
 feito no ágar nitrato e com o regente de Nessler. A presença no nitrito é revelada pelo reagente de
Nessler. O teste é positivo se aparecer cor vermelha. O não aparecimento do vermelho pode indicar
teste negativo, mas também pode indicar a desnitrificação, redução de NO 2 em N2 (gasoso). Logo,
quando o teste é negativo, precisa confirmar. Isso é feito adicionando Zn, pois ele reduz nitrato a
nitrito. Se, após adicionar o Zn, não houver a produção do vermelho, o teste é positivo, pois há
ausência de nitrato na cultura. Se aparecer vermelho, indica a presença de nitrito no meio que foi
reduzido a nitrato com a adição do Zn, o teste é negativo para redução de nitrato pela bactéria.
● Citocromo Oxidase: usado para diferenciar bastonetes gram negativos da Ordem Enterobacterales
(todos -) de outras bactérias +. O sistema citocromo é encontrado em microrganismos aeróbios ou
microaerófilos e anaeróbios facultativos. Os anaeróbios obrigatórios carecem da enzima. O teste
deve ser feito junto com O/F glicose. No teste é utilizado um corante / reagente, como o reagente de
Kovac, que substitui o oxigênio como aceptor artificial de elétron. No estado reduzido, o corante é
incolor, na presença de citocromo oxidase e oxigênio, o corante é oxidado dando uma coloração azul.
A coloração deve aparecer nos primeiros 10s.
● Indol: identifica bactérias que tem a enzima triptofanase, que é capaz de hidrolisar e desaminar o
triptofano, com formação de indol, ácido pirúvico e amônia. É útil para diferenciar E. coli (indol +)
de Klebsiella, Enterobacter, Hafnia e Serratia (indol -). O teste é feito em meio líquido de triptofano,
rico de triptofano, para poder observação a ação (ou não) da enzima. O microrganismo é adicionado
no meio, que é incubado por 24-48h, após isso é adicionado o reagente de Kovac. Se houver o
aparecimento de um anel vermelho fúcsia segundos após a adição do reagente, o teste é positivo,
houve produção de indol. O teste negativo quando aparece um anel amarelo.
● VM (vermelho de metila): é um teste quantitativo para a produção de ácido forte (lático, acético e
fórmico) através da glicose pela via de fermentação ácida mista. O VM é um indicador de pH com
faixa de variação de 6,0 a 4,4. O pH que o VM detecta ácido é mais baixo do que outros indicadores,
portanto, para haver viragem, o microrganismo precisa produzir grandes quantidades de ácido. O
meio mais usado para este teste é o meio líquido de vermelho de metila-Voges-Proskauer. O meio
com o microrganismo é incubado por mais de 48h e depois é adicionado 5 gotas do reagente VM. Se
houver aparecimento de coloração vermelha estável na superfície do meio indica a produção de ácido
o suficiente para abaixar o pH para 4,4 e o teste é positivo. Se permanecer amarelado, o teste é
negativo.
● VP: O acido pirúvico, formado pela degradação fermentativa da glicose, é posteriormente
metabolizado por diversas vias. Uma dessas vias produz acetoína (acetil metil carbinol). Na presença
de oxigênio e hidróxido de potássio 40%, a cetoína é convertida em diacetil, que é visto com auxílio
de alfa-naftol, catalisador para a produção de um complexo vermelho. Esse teste vê a presença de
diacetil. O microrganismo é inoculado no meio líquido VM/ VP, incubado por 24h a 35°C. Após
isso, o alfa-naftol é adicionado e depois o KOH, o tubo é agitado e deixado em repouso por 15
minutos. A presença de cor vermelha indica teste positivo, indicando a presença de diacetil pelo
produto da oxidação da acetoína. Reações negativas possuem coloração amarelada.
● Citrato: Identifica bactérias capazes de crescer em meios contendo citrato como única fonte de
carbono e fosfato de amônio como única fonte de nitrogênio. Isso ocorre, pois algumas bactérias
conseguem obter energia de outras formas que não pela fermentação de carboidratos. O teste ajuda a
identificar membros da família Enterobacteriaceae. A utilização do citrato pela bactéria é detectada
no meio pela formação de subprodutos alcalinos (hidroxido de amônio), que alcalinizam o meio. A
bactéria é inoculada no meio de Simmons, que é verde em pH neutro, em tubo de ensaio inclinado. O
meio deve ser desprovido de proteínas e carboidratos como fonte de carbono. O azul de bromotimol
 é o indicador de pH. O teste positivo é visto quando o meio verde vira para azul escuro entre 24 e
48h, tornando o meio alcalino e mostrando que a bactéria foi capaz de utilizar citrato e formar
produtos alcalinos. Além disso, também é positivo se o meio continuar verde, mas tiver
aparecimento de crescimento bacteriano. O teste negativo é quando o meio permanece inalterado e
não há crescimento.
● Urease: Identifica microrganismos com atividade urease rápida e intensa, degradadores lentos e
fracos e degradadores de ureia. Faz isso através da verificação da atividade da enzima urease, que
degrada a ureia liberando amônia e dióxido de carbono. A amônia reage em solução formando
carbonato de amônio, o que resulta em alcalinização e aumento de pH do meio. O teste é feito no
meio de cultura ágar ureia de Christensen, que possui alta quantidade de ureia, baixa concentração de
glicose para ser uma fonte rápida de energia para depois usar a ureia e um tampão fraco de fosfato
monopotássico. A leitura do teste em 6h indica a formação de ácidos fracos pela oxidação da glicose.
Esses ácidos fracos ativam a enzima urease. Na degradação rápida, antes de 24h, há a degradação da
ureia, que é visto pela alcalinização do meio, com aparecimento da cor vermelho intenso. Na
degradação lenta, dentro de 24h haverá a alcalinização do meio e formação de cor vermelho intenso
inicialmente apenas na inclinação do tubo. Se não houver a degradação da ureia, não há alcalinização
do meio, que permanece amarelo (ácido) devido a oxidação inicial da glicose.
● FAD (fenilalanina desaminase): Identifica bactérias produtoras da enzima fenil alanina desaminase
através da ação da reação que a enzima que desanima fenil alanina a ácido fenil pirúvico. O teste é
feito em ágar fenil alanina, que possui levedo de cerveja como fonte de carbono, com inoculação da
bactéria e incubação. Após 24h pingar 5 gotas do reagente ácido férmico 10% ma cultura. Se houver
aparecimento da cor verde escura há presença de ácido fenil pirúvico, teste positivo. Se o meio
manter amarelo, há ausência do ácido e o teste é negativo.
● Teste das descarboxilases (LIS, ORN, ARG): Observa a ação das enzimas descarboxilases com
atividade em aminoácidos específicos – lisina, ornitina e arginina – que são capazes de reagir com o
grupo carboxila para formar aminas alcalinas. Cada enzima é específica para um aminoácido, então
deve ser feito 1 tubo para cada aminoácido mais o controle. Ao fazer o teste no meio de
descarboxilase de Moeller, é adicionado um aminoácido específico a cada meio, a bactéria e tudo é
coberto por uma camada de óleo mineral (para a reação ser mais rápida na ausência de oxigênio).
Nas primeiras 6-8h, o meio lilás torna-se amarelo devido a fermentação da glicose e o pH torna-se
ácido forte. Depois de 24-48h a bactéria pode descarboxilar o aminoácido e tornar o meio alcalino e
de cor roxo, indicando teste positivo. Se continuar amarelo, o teste é negativo.

3) TABELA + PROPOSTA DE IDENTIDICAÇÃO

4) FAZER COMENTÁRIO(S) QUE JULGAR RELEVANTE(S) OU NECESSÁRIO(S)

RELATIVO(S) AO DESENVOLVIMENTO DO TRABALHO PRÁTICO.

A identificação de bactérias faz-se muito importante para o correto tratamento do paciente. As

aulas práticas são uma ótima oportunidade de aprendizado, mesmo só sendo possível fazer a leitura
dos testes, ao invés de prepara-los também.
Foi possível observar, após fazer a identificação das bactérias que a identificação pode ser
difícil, devido, principalmente, a bactérias que podem dar resultado positivo ou negativo para o
mesmo teste. Quando isso ocorre, atrapalha a fazer a identificação.
RELATÓRIO 2- Bastonetes Gram Negativos- Não Fermentadores da Glicose- Móveis-
Citocromoxidase Positivos

1) Meio de cultura utilizado para o isolamento das colônias

Os meios utilizados para a realização desta identificação são quase os mesmos do que os relatados na
prática 1, sendo eles: ágar KIA (duplo açúcar para teste de fermentação Glicose/ Sacarose), meio de
Hugh e Leifson (O/F glicose), ágar Simmons (teste do citrato), ágar ureia de Christensen, meio de
Moeller (teste das descarboxilases). As diferenças foram que a colônia de bactérias foi obtida após
inoculação em ágar sangue e houve 1 teste a mais, feito no ágar Cetrimide (teste), ambos explicados a
seguir:

● Ágar sangue: é um meio de cultivo para a grande maioria das bactérias gram positivas e gram
negativas. É composto por extrato de levedura que fornece nitrogênio, carbono, aminoácidos e
vitaminas, protoema e peptona como fonte de nitrogênio e o equilíbrio do meio é mantido pela
concentração de cloreto de sódio, utilizado como agente lubrificante. Como é um meio que
possibilita o cultivo de muitas espécies de bactérias, é necessário consultar o resultado obtido, pois
pode gerar diversos tipos de colônias de características diferentes.

2) Testes realizados
As colônias utilizadas foram obtidas através da inoculação da bactéria no ágar sangue,
encontrou-se o crescimento de uma colônia de bactérias incolores. Após isso, os testes realizados
foram de fermentação Glicose/ Sacarose, O/F glicose, citrato, uréase, teste das descarboxilases
(Lisina, Arginina, Ornitina), assim como explicados no relatório 1, e foi feito mais um teste,
explicado a baixo:
● Teste para confirmação de Pseudomonas aeruginosa: Quando há a desconfiança que a bactéria pode
ser Pseudomonas aeruginosa, esse teste pode ser feito através do ágar Cetrimide para confirmar a
presença desta espécie. O Ágar Cetrimide é usado para o isolamento seletivo e diferencial de
Pseudomonas aeruginosa. A peptona serve como fonte de nitrogênio e o glicerol é usado como
carbono e fonte de energia. A produção de piocianina é estimulada pelo cloreto de magnésio e
sulfato de potássio presentes no meio. A cetrimida (brometo de cetiltrimetilamina) é um composto
amónio quaternário, que inibe uma vasta variedade de outros organismos, incluindo outras espécies
de Pseudomonas e organismos relacionados. O meio é inicialmente âmbar claro. É detectada a
presença de P. aeruginosa quando há crescimento da bactéria com pigmento azul-esverdeado e
fluorescência sub luz UV, após incubação de 24-48h. O teste é negativo quando não há mudança no
meio.

3) Tabela de identificação

KIA O/F glicose Citrato Urease LIS ARG ORN CETRIMIDE

Amostra k/k, gás -/ +/- - + - + - +

1 H2S -

Identificação: Pseudomonas aeruginosa

4) Comentários
Foi possível observar como é importante utilizar um meio seletivo e diferencial para confirmar uma
identificação de bactéria.