Prática laboratorial: Determinação de

flavonoides na cebola (Allium cepa)

Introdução

Os flavonóides são moléculas

polifenólicas solúveis em água,
contendo 15 átomos de carbono. Os
flavonóides pertencem à família dos
polifenóis. Os flavonóides são
constituídos por dois anéis de benzeno
unidos por uma cadeia com 3C. Um dos
átomos de carbono de cadeia curta está
sempre ligado a um carbono de um dos
anéis de benzeno, quer diretamente ou
através de uma ponte de oxigénio,
formando deste modo um terceiro anel
no meio, que pode ser de cinco ou seis
membros. Os flavonóides incluem 6 Figura 1: Estrutura de alguns dos principais subgrupos dos flavonoides.
subgrupos principais: calconas,
flavonas, flavonois, flavanonas,
antocianinas e isoflavonóides (figura
1).
A quercetina é um flavonóide
natural que possui propriedades
farmacológicas (antinflamatória, anti-
carcinogénica, antiviral, anti-histamí-
nica, cardiovascular). Tem massa molar
de 302,236 g/mol e forma complexos
com alumínio (figura 2).
A quercetina apresenta uma
forte banda de absorção a 372 nm. A
adição de Al (III) à solução mostra que
o pico de absorção a 372 nm diminui,
enquanto uma banda centrada em 428
nm aumenta com a quantidade de
metal adicionado até que a proporção
Figura 2: Estrutura molecular da quercetina e dos seus complexos (I e II) com
molar [AICI3]/[Q] seja <0.5 alumínio.
(correspondente ao complexo I). Para
proporções [AICI3]/[Q] ≥ 2.5 a banda de
absorção passa para 456 nm
(correspondente ao complexo II)
(figuras 2 e 3).
A ação antioxidante da quercetina
parece ser uma combinação de reação
com radicais livres e da complexação
com iões metálicos. A quercetina liga
diferentes iões metálicos (Fe2+, Fe3+,
Al3+, Cu2+) e elimina de radicais peroxil
(H2O2) enquanto o seu efeito na
eliminação de radicais OH. é muito
menos importante.

Figura 3: Espectros de absorção da quercetina em metanol na ausência e na

presença de Al (III). As proporções molares [AICI3] / [Q] são indicadas em cada
espectro (Cornard e Merlin, 2002).
Metodologia
A- Quantificação de flavonoides (quercetina)
Preparação do extrato
1. Pesar 0.1g de material vegetal (brácteas secas de cebola roxa ou amarela) e
macerar em almofariz com 10 ml de etanol a 85%. O procedimento deverá ser
realizado na escuridão para evitar a degradação dos flavonoides.
2. Colocar o homogenado em tubo de centrífuga tapado com papel de alumínio e
centrifugar a 10000x g durante 10 minutos a 4ºC.
3. Acertar o sobrenadante para 10 ml com etanol a 85%, adicionar 150 µl 5% NaNO2
e incubar 5 min a 50ºC.
4. Dividir o sobrenadante equitativamente (5 ml) por 2 tubos falcon tapados (A e B)
com papel de alumínio.
5. Ao tubo falcon B adicionar respetivamente 100 µl de 10% AlCl3 e incubar 5 min a
50ºC.
6. Fazer duas séries de padrões (A e B). Na série A pipetar para microtubos 5000 µl
de soluções padrão de quercetina (0, 0.01, 0.02, 0.03 e 0.05 mg/ml) em etanol 85%
adicionar 75 ul NaNO2 e incubar 5 min a 50ºC. Na série B pipetar para microtubos
5000 µl de soluções padrão de quercetina (0, 0.01, 0.05, 0.1 e 0.5 mg/ml) em
etanol 85% adicionar 75 ul NaNO2 e incubar 5 min a 50ºC. Adicionar 100ul
10%AlCl3 e incubar mais 5 minutos.
7. Arrefecer todos os tubos em gelo antes de passar as soluções para cuvetes PMMA
(UV).

Obtenção dos espectros de absorção dos flavonoides (quercetina)

8. Calibrar o espectrofotómetro com etanol a 85% (tubo 0 série A).
9. Fazer os espectros de absorção entre 320 e 550 nm para os padrões e as
amostras da série A.
10. Imprimir o espetro e os valores de absorvância.
11. Repetir os passos 9 a 11 para os tubos da série B (padrões e amostras).

Cálculos
12. Determinar a quantidade de quercetina em mg/g DW usando a equação da reta.
13. Comparar os conteúdos de quercetina obtidos com valores descritos na
bibliografia.