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9221 TÉCNICA DE FERMENTAÇÃO DE MÚLTIPLOS TUBOS PARA MEMBROS DO

GRUPO COLIFORMES*

9221 A. Introdução

As bactérias coliformes têm sido utilizadas há muito tempo como
indicadores da qualidade da água com base na premissa de que, como estes
organismos estão presentes nos intestinos de animais de sangue quente, a
sua presença na água pode indicar que ocorreu contaminação fecal recente.
curado. Historicamente, este grupo de organismos foi definido pela sua
capacidade de fermentar a lactose, e não pelos princípios da bacteriologia
sistemática, pelo que o grupo consiste em bactérias de vários géneros
pertencentes à família Enterobacteriaceae.
Os métodos descritos nesta seção usam um produto à base de lactose
meio caldo para detectar os produtos metabólicos finais da fermentação da
lactose. A presença de coliformes deve ser confirmada em meio contendo
lactose e sais biliares [caldo de bile com lactose verde brilhante (BGLB)].
Portanto, quando as técnicas de fermentação nesta seção são usadas, os
coliformes são definidos como todas as bactérias facultativamente
anaeróbicas, Gram-negativas, não formadoras de esporos e em forma de
bastonete, que fermentam a lactose com produção de gás e ácido na presença
de sais biliares dentro de 48 h a 35°C.
O teste padrão para o grupo coliforme pode ser realizado pela técnica de
fermentação de tubos múltiplos ou procedimento de presença-ausência
(através das fases presuntivamente confirmadas ou teste concluído) aqui
descrito, a técnica de filtro de membrana (MF) (Seção 9222), ou o teste
enzimático de coliformes de substrato (Seção 9223). Cada técnica é aplicável
dentro das limitações especificadas e com a devida consideração ao propósito
do exame. A produção de resultados válidos exige o cumprimento estrito dos
procedimentos de controle de qualidade (CQ).
As diretrizes de CQ estão descritas na Seção 9020.
A técnica de fermentação pode ser usada para detectar coliformes em
água potável ou quantificar coliformes em água potável e não potável. Quando
vários tubos são usados, a densidade de coliformes é estimada através de
uma tabela de número mais provável (NMP). Esse número, gerado por meio
de fórmulas de probabilidade específicas, é uma estimativa da densidade
média de coliformes na amostra. Os resultados dos testes de coliformes,
juntamente com outras informações obtidas de pesquisas de engenharia ou
sanitárias, fornecem a melhor avaliação da eficácia do tratamento de água e
da qualidade sanitária da água de origem.
A precisão do teste de fermentação na estimativa da densidade de
coliformes depende do número de tubos utilizados. A informação mais
satisfatória será obtida quando o maior inóculo de amostra examinado
apresentar ácido e/ou gás em alguns ou todos os tubos e o menor inóculo de
amostra não apresentar ácido ou gás em nenhum ou na maioria dos tubos. A
densidade bacteriana pode ser estimada pela fórmula indicada ou pela tabela
utilizando o número de tubos positivos nas diluições múltiplas (9221C.2). O
número de porções de amostra selecionadas será determinado pela precisão
desejada do resultado. As tabelas MPN baseiam-se no pressuposto de uma
distribuição de Poisson (dispersão aleatória). No entanto, se a amostra não
for agitada adequadamente antes de as alíquotas serem removidas ou se as
bactérias
aglomeração de células, o valor MPN será uma subestimação da densidade
bacteriana real.
1. Água de qualidade potável
Ao analisar a água potável para determinar se a sua qualidade atende aos
padrões da Agência de Proteção Ambiental dos EUA (EPA), uma amostra de
100 mL deve ser analisada; use a técnica de fermentação com 10 tubos
replicados, cada um contendo 10 mL, 5 tubos replicados, cada um contendo
20 mL, ou um único frasco contendo uma porção de amostra de 100 mL. Ao
examinar a água potável através da técnica de fermentação nique, processe
todos os tubos ou garrafas que demonstrem crescimento - com ou sem reação
ácida ou gasosa positiva - durante a fase confirmada (9221B.4). Amostras de
água potável positivas para coliformes totais também devem ser testadas
para coliformes termotolerantes (fecais) (9221E) ou Escherichia coli (9221F).
Para exames de rotina do abastecimento público de água, o objetivo do
teste de coliformes totais é determinar a eficiência das operações da estação
de tratamento e a integridade do sistema de distribuição.
O teste também é usado para rastrear a presença de contaminação fecal.
Algumas ocorrências de coliformes em um sistema de distribuição podem ser
atribuídas ao crescimento ou sobrevivência de coliformes em biofilmes
bacterianos na rede, em vez de falha no tratamento na planta ou fonte de
poço, ou contaminação externa do sistema de distribuição.
Como é difícil distinguir os coliformes que entram no sistema de distribuição
e os coliformes já presentes no biofilme da tubulação e nos sedimentos,
assuma que todos os coliformes se originam de uma fonte fora do sistema de
distribuição.
2. Água de qualidade diferente da água potável
Ao analisar águas não potáveis, inocular uma série de tubos com diluições
decimais apropriadas da água (múltiplos de 10 mL) com base na provável
densidade de coliformes. Use as fases presumivelmente confirmadas do
procedimento de tubos múltiplos. Use o teste mais trabalhoso concluído
(9221B.5) como uma medida de CQ em 10% (ou uma porcentagem definida)
de amostras de água não potável positivas para coliformes trimestralmente.
Geralmente, o objetivo da análise de água não potável é estimar a densidade
bacteriana, determinar uma fonte de poluição, impor padrões de qualidade da
água ou rastrear a sobrevivência de microrganismos.
A técnica de fermentação em tubos múltiplos pode ser usada para obter
estimativas estatisticamente válidas de NMP da densidade de coliformes.
Examine um número suficiente de amostras de água para produzir resultados
representativos para a estação de amostragem. Geralmente, a média
geométrica ou o valor mediano dos resultados de um número de amostras
produzirá um valor no qual o efeito da variação de amostra para amostra é minimizado.
3. Outras amostras

A técnica de fermentação em tubos múltiplos é aplicável à análise de águas

*Aprovado pelo Comitê de Métodos Padrão, 2014.
Grupo de Trabalho Conjunto: Ellen B. Braun-Howland (presidente), Jennifer Best, Robert J.
Blodgett, Laura Boczek, Gil Dichter, Clifford H. Johnson.
salgadas ou salobras, bem como lamas, sedimentos e lamas. Colete amostras
conforme indicado na Seção 9060A, usando recipientes de amostras
especificados na Seção 9030B.19. Segue o

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TÉCNICA DE FERMENTAÇÃO DE MÚLTIPLOS TUBOS (9221)/Técnica Padrão de Fermentação de Coliformes Totais

precauções fornecidas acima sobre tamanhos de porções e números de tubos em um frasco liquidificador estéril, adicione 270 mL de tampão fosfato estéril ou 0,1%
por diluição. água de diluição de peptona e misture por 1 a 2 min em alta velocidade
Para preparar amostras sólidas ou semissólidas, pese a amostra e adicione (8000 rpm). Prepare as diluições decimais apropriadas da pasta homogeneizada o
diluente para fazer uma diluição de 10–1 . Por exemplo, coloque 30 g de amostra em mais rápido possível para minimizar a sedimentação.

9221 B. Técnica padrão de fermentação de coliformes totais

1. Amostras TABELA 9221:I. PREPARAÇÃO DO CALDO LAURYL TRYPTOSE

Quantidade de Volume de Lauril desidratado

Colete amostras conforme indicado na Seção 9060A, usando amostra Médio em Médio Caldo de triptose
contêineres especificados na Seção 9030B.19. Siga as diretrizes de CQ Inóculo Tubo Inóculo Obrigatório
para frascos de amostra descritos na Seção 9020B.5d. Garanta que mL mL mL g/ L
as amostras atendem aos critérios de aceitação do laboratório no momento do recebimento.
10 ou mais 11 ou mais 35,6
1 10 20 71,2
2. Controle de qualidade 10 20 30 53,4
10 10 30 106,8
Todas as fases da técnica de fermentação (9221B–G) requerem 20 50 150 106,8
adesão às diretrizes de garantia de qualidade/controle de qualidade (QA/QC)
100 35 135 137,1
100 100 20 120 213,6
apresentadas na Seção 9020, incluindo, mas não se limitando a,
CQ analítico (Seção 9020B.9), instrumentação/equipamento (Seções 9020B.4 e
9030B) e suprimentos (Seção 9020B.5). Referir-se
Hidrogenofosfato dipotássico (K2HPO4). . . . . . . . . . 2,75g
Tabela 9020:I para os principais procedimentos de CQ. Além disso, observe as
Dihidrogenofosfato de potássio (KH2PO4).......... 2,75 g
seções relativas ao armazenamento e preparação adequados de cultura desidratada
Cloreto de sódio (NaCl). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5,0g
mídia e qualidade da água (Seções 9050 e 9020B.5f).
Lauril sulfato de sódio. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,1g
Use mídia desidratada comercial quando possível e garanta 1L
Água de grau reagente ..........................
que suas formulações correspondam às especificadas aqui porque as formulações
comerciais podem variar. Meia lata de fermentação preparada Adicione os ingredientes desidratados à água, misture bem e aqueça até
ser armazenado em tubos ou frascos bem fechados por até 3 meses em dissolver. Antes da esterilização, distribua meio suficiente em tubos de fermentação
no escuro, se as temperaturas estiverem entre 1 e 30°C e a evaporação for inferior contendo frascos invertidos (também conhecidos como tubos Durham)
a 10% do volume original. Se os tubos fossem cobrir o frasco invertido pelo menos metade a dois terços após a
refrigerados após a esterilização, devem ser incubados durante a noite em ilização. Alternativamente, omitir o frasco invertido e adicionar 0,01 g/L
temperatura ambiente (20°C) antes do uso e aqueles que apresentarem roxo de bromocresol em caldo lauril triptose (para determinar ácido
crescimento ou bolhas devem ser descartados para evitar falsos positivos produção, um indicador de resultado positivo nesta parte do
resultados. Para demonstrar um desempenho aceitável do meio, os controles de teste de coliformes). Fechar os tubos com tampas metálicas ou plásticas resistentes ao calor.
cultura positivos e negativos devem ser testados antes da primeira Prepare de acordo com a Tabela 9221:I, fazendo caldo para tosse lauril tryp
uso e conforme especificado de outra forma (ver Tabela 9020:VI). Esterilidade, concentrado o suficiente para adicionar 100, 20 ou 10 mL
o volume por tubo e o pH também devem ser verificados e registrados. porções de amostra no meio não reduzirão o ingrediente
Para demonstrar a comparabilidade entre lotes de mídia, realize um teste de uso concentrações abaixo daquelas do meio padrão. Autoclave
[Seção 9020B.5f2)]. meio a 121°C por 12 a 15 min. Certifique-se de que os frascos invertidos, se
Se um laboratório estiver mudando para a fermentação em tubos múltiplos usados, estão livres de bolhas de ar. O pH médio deve ser 6,8 0,2
técnica, o ideal é que os analistas primeiro realizem testes paralelos após a esterilização.
com o método anterior para demonstrar aplicabilidade e comparabilidade. Os b. Procedimento:

resultados de muitos estudos de desempenho de coliformes são
disponíveis na literatura, e as taxas de falso-positivos e
-os resultados negativos podem diferir entre vários meios. Os usuários devem
selecione cuidadosamente o meio e o procedimento que melhor atende às suas necessidades.
3. Fase Presumida
Use caldo lauril triptose nesta fase do tubo múltiplo
teste, seguindo as diretrizes de CQ citadas em 9221B.2.
para. Reagentes e meio de cultura:
Caldo Lauril Triptose:
Triptose................................ 20,0 g
Lactose. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5,0g
1) Disponha os tubos de fermentação em fileiras de cinco ou dez tubos cada
em um suporte para tubos de ensaio. O número de linhas e os volumes de amostra
selecionados dependem da qualidade e do caráter da água a ser
examinado. Para água potável, devem ser testados 100 mL. Use cinco
porções de 20 mL, dez porções de 10 mL ou uma porção de 100 mL (um
única garrafa). Para água não potável, use cinco tubos por diluição
(de 10, 1, 0,1 mL, etc.).
Ao fazer diluições e medir volumes de amostras diluídas, siga as precauções
fornecidas na Seção 9215B.2. Usar
Figura 9215:1 como guia para preparar diluições. agitar amostra
e diluições vigorosamente 5 s (cerca de 25 vezes). Inocular cada tubo
em um conjunto de cinco com volumes de amostra replicados em aumento
diluições decimais, se forem utilizadas quantidades decimais da amostra.
Misture as porções de teste no meio com agitação suave.

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TÉCNICA DE FERMENTAÇÃO DE MÚLTIPLOS TUBOS (9221)/Técnica Padrão de Fermentação de Coliformes Totais
2) Incubar imediatamente tubos ou frascos inoculados, qualquer cultura
controles e/ou brancos de esterilidade a 35 0,5°C. Depois de 24 2 horas,
Agite cada tubo ou frasco suavemente e examine-o em busca de crescimento, gás,
e/ou reação ácida (tons de cor amarela) e, se não houver gás ou
a reação ácida for evidente, incube novamente e reexamine no final
de 48 3h. Registre a presença ou ausência de crescimento, gás e/ou
produção de ácido. Se o frasco interno for omitido, o crescimento com acidez
(cor amarela) significa uma reação presumivelmente positiva.
c. Interpretação: Detecção de uma reação ácida (amarelo
cor) e/ou gás nos tubos ou garrafas dentro de 48 constitui uma reação
presumivelmente positiva. Enviar tubos ou frascos com reação presumivelmente
positiva à fase confirmada
(9221B.4).
A ausência de reação ácida e/ou formação de gás no final
de 48 3 horas de incubação constitui um teste negativo. Enviar
amostras de água potável demonstrando crescimento sem resultado positivo
reação gasosa ou ácida à fase confirmada (9221B.4).
4. Fase Confirmada
para. Meio de cultura: Use tubos de fermentação em caldo BGLB para
a fase confirmada, seguindo as diretrizes de CQ citadas em
9221B.2.
Caldo biliar com lactose verde brilhante:
Peptona................................. 10,0 Lactose............ ................... 10,0
Galha de boi................................. 20,0 g
Verde brilhante ........................... 0,0133 g
Água de grau reagente........................... 1 L
Adicione ingredientes desidratados à água, misture bem e aqueça
dissolver. Antes da esterilização, dispense o meio em tubos de fermentação com um
frasco invertido, garantindo volume suficiente de
meio para cobrir o frasco invertido pelo menos metade a dois terços
após a esterilização. Feche os tubos com metal ou plástico resistente ao calor
rapazes. Autoclave o meio a 121°C por 12 a 15 min. Garanta que
os frascos invertidos estão livres de bolhas de ar. O pH médio deve ser
7,2 0,2 após esterilização.
b. Procedimento: Envie imediatamente todos os tubos ou frascos presumíveis
que apresentem crescimento, qualquer quantidade de gás ou reação ácida
dentro de 24 2 horas após a incubação até a fase confirmada. Se
presumíveis tubos ou garrafas adicionais mostram fermentação ativa
ou reação ácida no final de um período de incubação de 48 3 horas,
Envie-os imediatamente para a fase de confirmação. Para confirmar colônias
presuntivas de coliformes crescendo em meio sólido usando
meio de fermentação, consulte a Seção 9222B.4g.
Agite ou gire suavemente os presumíveis tubos ou frascos mostrando
gás ou crescimento ácido para ressuspender os organismos. Com um
alça estéril de 3,0 a 3,5 mm de diâmetro, transfira uma ou mais
alças cheias de cultura para um tubo de fermentação contendo BGLB
caldo. Alternativamente, insira um aplicador de madeira estéril pelo menos
2,5 cm na cultura, remova imediatamente e mergulhe o aplique no fundo do tubo de
fermentação contendo BGLB
caldo. Remova e descarte o aplicador. Repita para todos os outros
tubos presumivelmente positivos. Os analistas podem ocular simultaneamente o
caldo BGLB para coliformes totais e o caldo EC para
coliformes termotolerantes (fecais) (ver 9221E) ou EC-MUG
caldo para Escherichia coli (ver 9221F). No entanto, se usar o
mesma alça ou bastão aplicador de madeira para inocular uma cultura
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em mais de um meio, inocular o mais inibitório
meio (caldo BGLB) por último.
Incubar imediatamente os tubos de caldo BGLB inoculados a 35 0,5°C.
Qualquer quantidade de gás formada no frasco invertido do
Tubo de fermentação de caldo BGLB a qualquer momento dentro de 48 3 h
constitui uma fase positiva confirmada. Para estimar os coliformes
densidade, calcule o valor MPN a partir do número de positivos
Tubos BGLB conforme descrito em 9221C.
c. Procedimento alternativo: Utilize esta alternativa apenas para
3 horas água ou águas residuais conhecidas por produzir resultados positivos de forma
consistente.
Se todos os tubos presuntivos forem positivos em duas ou mais diluições
consecutivas dentro de 24 horas, então apenas submeter ao teste confirmado
fasear os tubos de maior diluição (menor inóculo de amostra) em
qual todos os tubos são positivos, juntamente com quaisquer tubos positivos ainda
diluições mais altas. Enviar para fase confirmada todos os tubos em
qual gás ou crescimento ácido é produzido em 24 a 48 horas.
5. Fase Concluída
O teste concluído conforme descrito aqui não é necessário para
análises de amostras de conformidade de água potável. Para amostras de água não
potável coletadas de acordo com a Lei da Água Limpa, o requisito
que 10% de todos os tubos positivos para coliformes totais sejam submetidos ao
o teste concluído sazonalmente não existe mais. O teste concluído está incluído aqui
g como uma recomendação de CQ e para uso
g Quando os resultados dos testes são incertos. Como testes adicionais para
coliformes termotolerantes (fecais) e/ou E. coli são necessários para
testes de coliformes positivos, testes adicionais usando EC e/ou EC-MUG
caldos é considerado um teste concluído. Para fins de CQ, se não
amostras positivas de água potável são recebidas dentro de um quarto,
em seguida, analise pelo menos uma amostra positiva de água de nascente para confirmar
que a mídia respondeu adequadamente.
Para verificar a presença de bactérias coliformes e fornecer CQ
dados para análise de amostras de água não potável, use o formulário preenchido
teste em pelo menos uma amostra positiva por trimestre. Se não for positivo
amostra ocorrer dentro de um trimestre, realize uma verificação de CQ usando um
amostra positiva conhecida. Os analistas podem inocular simultaneamente
meio presumivelmente positivo em caldo BGLB para confirmação de coliformes
totais e caldo CE para termotolerante (fecal)
coliformes (9221E) ou caldo EC MUG para Escherichia coli
(9221F) desde que o caldo BGLB seja inoculado por último. Positivo
resulta da incubação em caldos EC e/ou EC-MUG em níveis elevados
temperatura (44,5 0,2°C) pode ser considerada um teste concluído.
Culturas paralelas positivas em caldo BGLB com CE negativo ou
As culturas em caldo EC-MUG indicam a presença de formas de coli não fecais.
Tubos EC ou EC-MUG positivos paralelos e tubos negativos
Culturas em caldo BGLB indicam a presença de termotolerantes
coliformes (fecais) ou E. coli, respectivamente. Alternativamente, o teste completo
para coliformes totais positivos pode ser realizado como
segue.
para. Meios de cultura e reagentes: Siga as diretrizes de CQ
citado em 9221B.2.
1) Ágar LES Endo – Consulte a Seção 9222B.2a. Usar 100-
Placas de Petri de 15 mm.
2) Ágar MacConkey:
Peptona. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17 g
Peptona proteose ........................... 3 g
Lactose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 g
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TÉCNICA DE FERMENTAÇÃO DE MÚLTIPLOS TUBOS (9221)/Técnica Padrão de Fermentação de Coliformes Totais
Sais biliares. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1,5g
Cloreto de sódio (NaCl) ....................... 5 g
Ágar ................................... 13,5 g
Rede neutra. ................................... 0,03g
Violeta cristalina ................................ 0,001 g
Água de grau reagente......................... 1L
Adicione os ingredientes à água, misture bem e aqueça até ferver
dissolver. Esterilize em autoclave por 15 minutos a 121°C. Temperamento
ágar após a esterilização e despeje em placas de Petri (100 15 mm).
O pH médio deve ser 7,1 0,2 após a esterilização.
3) Ágar nutriente:
Peptona. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5,0g
Extrato de carne . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3,0g
Ágar ................................................... 15,0 g
Água de grau reagente ...........................
Adicione os ingredientes à água, misture bem e aqueça para dissolver. Antes da
esterilização, distribua em tubos com tampa de rosca. Au toclave a 121°C por 15 min.
O pH médio deve ser 6,8 0,2
após a esterilização. Após a esterilização, coloque imediatamente os tubos em
uma posição inclinada para que o ágar solidifique com uma inclinação
superfície. Aperte as tampas de rosca após o resfriamento e guarde em uma área de
armazenamento protegida e fresca.
4) Reagentes de coloração de Gram – Os reagentes estão disponíveis comercialmente
capazes como soluções preparadas.
a) Cristal violeta de oxalato de amônio (Hucker) - Dissolver 2 g
violeta cristal (90% de teor de corante) em 20 mL de álcool etílico a 95%.
CUIDADO: Inflamável. Dissolva 0,8 g (NH4)2C2O4 H2O em
80 mL de água grau reagente. Misture as duas soluções e deixe envelhecer
24 horas antes do uso. Filtre através de papel em um frasco de coloração.
b) Solução de Lugol, modificação de Gram - triturar 1 g de iodo
cristais e 2 g de KI em um almofariz. Adicione água de grau reagente, alguns
mililitros de cada vez e triture bem após cada adição
até que a solução esteja completa. Enxágue a solução em um vidro âmbar
garrafa com o restante da água, totalizando 300 mL.
c) Contracoloração - Dissolva 2,5 g de corante safranina em 100 mL 95%
Álcool etílico. Adicione 10 mL a 100 mL de água grau reagente.
CUIDADO: Inflamável.
d) Álcool acetônico - Misture volumes iguais de álcool etílico
(95%) com acetona. CUIDADO: Inflamável.
b. Procedimento:
1) Usando técnica asséptica, espalhe um ágar LES Endo (Seção
9222B.2a) ou placa de ágar MacConkey de cada tubo presumivelmente positivo de
caldo BGLB o mais rápido possível depois que o gás for
observado. Riscar as placas de maneira a garantir a presença de
algumas colônias discretas separadas por pelo menos 0,5 cm. Para obter um
alta proporção de isolamentos bem-sucedidos se organismos coliformes
estão presentes, use a seguinte abordagem:
a) Utilize uma alça estéril de 3 mm de diâmetro ou uma agulha inoculante
ligeiramente curvado na ponta;
b) bata e incline o tubo de fermentação para evitar pegar
qualquer membrana ou espuma na agulha;
c) insira a ponta do laço ou agulha no líquido do
tubo até uma profundidade de aproximadamente 0,5 cm; e
d) riscar uma placa para isolamento com a seção curva do
agulha em contato com o ágar para evitar arranhões ou rasgos
superfície. Acenda o loop entre o segundo e o terceiro
quadrantes para melhorar o isolamento da colônia.
Incubar as placas, invertidas, a 35 0,5°C durante 24 2 h.
https://doi.org/10.2105/SMWW.2882.192
2) As colônias que se desenvolvem no ágar LES Endo são definidas como
típico (rosa a vermelho escuro com um brilho superficial metálico verde) ou
atípicas (colônias rosadas, vermelhas, brancas ou incolores e sem brilho) após
Incubação de 24 horas. Colônias típicas de fermentação de lactose se desenvolvem em
O ágar MacConkey é vermelho e pode estar rodeado por uma zona opaca
de bile precipitada. De cada prato, escolha um ou mais típicos,
colônias de coliformes bem isoladas ou, se não houver colônias típicas,
escolha duas ou mais colônias consideradas com maior probabilidade de serem coliformes.
Transfira o crescimento de cada isolado para um tubo de fermentação de caldo de
tosse lauril tryp de força única e para um ágar nutriente inclinado.
Se necessário, use um dispositivo de ampliação de colônias para fornecer uma
ampliação ideal quando as colônias forem colhidas do
Placas de ágar LES Endo ou MacConkey. Ao transferir colônias, escolha aquelas bem
isoladas e mal toque na colônia
superfície com uma agulha de transferência esterilizada por chama e resfriada a ar para
1L minimizar o perigo de transferência de uma cultura mista.
Incubar tubos de caldo secundário (caldo lauril triptose com
frascos de fermentação invertidos) a 35 0,5°C durante 24 2 h; se gás
não for produzido dentro de 24 2 horas, reincubar e examinar novamente
às 48h30. Examinar microscopicamente preparações coradas por Gram
daquelas culturas inclinadas de ágar nutriente de 24 horas correspondentes ao
tubos secundários que mostram gás.
3) Técnica de coloração de Gram – A coloração de Gram pode ser omitida
do teste concluído para amostras de água potável apenas porque
Bactérias Gram-positivas e organismos formadores de esporos na bebida
a água raramente sobrevive a este procedimento de triagem seletiva.
Existem várias modificações da técnica de coloração de Gram. Usar
Modificação de Hucker (como segue) para coloração de esfregaços de
culturas; incluem uma cultura Gram-positiva e uma Gram-negativa como
controles.
Em uma lâmina, prepare emulsões leves separadas da massa
crescimento bacteriano e culturas de controle positivo e negativo usando
gotas de água destilada na lâmina. Secar ao ar, fixar passando a lâmina
através de uma chama e corar por 1 min com solução cristal violeta de oxalato de
amônio. Lave a lâmina em água corrente e escorra
excesso; aplique a solução de Lugol por 1 min.
Enxágue a lâmina manchada em água corrente. Descolorir por aproximadamente
15 a 30 s com álcool acetônico, segurando a lâmina entre as
dedos e deixando o álcool acetonado fluir através do esfregaço corado
até que o solvente flua incolormente da lâmina. Não descolorir demais. Contracolorar
com safranina por 15 s, enxaguar com torneira
água, seque com papel absorvente ou deixe secar ao ar e examine
microscopicamente. Os organismos Gram-positivos são azuis; Organismos Gram
negativos são vermelhos. Os resultados são aceitáveis apenas quando
os controles deram reações adequadas.
c. Interpretação: Formação de gás no tubo secundário do
caldo lauril triptose dentro de 48 3 h e demonstração de
Bactérias Gram-negativas, não formadoras de esporos e em forma de bastonete, provenientes do
a cultura em ágar constitui um resultado positivo para o teste concluído,
demonstrando que um membro do grupo coliforme está presente.
6. Bibliografia
HUCKER, GJ e HJ CONN. 1927. Estudos adicionais sobre os métodos de
Coloração de Gram; Tecnologia. Touro. Nº 128. Estação de Experimentos
Agrícolas do Estado de NY, Genebra, NY
COWLES, PB 1939. Um tubo de fermentação modificado. J. Bacteriol. 38:677.
SKERMAN, VBD 1967. Um Guia para a Identificação dos Gêneros de
Bactéria. Williams & Wilkins, Baltimore, Maryland.
4
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TÉCNICA DE FERMENTAÇÃO DE MÚLTIPLOS TUBOS (9221)/Estimativa da Densidade Bacteriana

EVANS, TM, CE WAARVICK, RJ SEIDLER & MW LECHEVALLIER.
1981. Falha da técnica do número mais provável para detectar
coliformes na água potável e no abastecimento de água bruta. Apl. Meio Ambiente.
Microbiol. 41:130.
GERHARDS, P., ed. 1981. Manual de Métodos para Bacteriologia Geral.
Sociedade Americana de Microbiologia, Washington, DC
SEIDLER, RJ, TM EVANS, JR KAUFMAN, CE WAARVICK & MW
LECHEVALLIER. 1981. Limitações da enumeração padrão de coliformes
técnicas. J. Amer. Associação de Obras de Água. 73:538.
AGÊNCIA DE PROTEÇÃO AMBIENTAL DOS EUA . 2000. Regulamentações nacionais sobre
GARRITY, GM, ed. 2005. Parte B: As gamaproteobactérias. Em Bergey
Manual de Bacteriologia Sistemática, 2ª ed.; Volume 2: As Proteobactérias. Springer,
Nova York, NY
AGÊNCIA DE PROTEÇÃO AMBIENTAL DOS EUA . 2005. Manual para o Certi
organização de Laboratórios de Análise de Água Potável; EPA 815-R 05-004. Desligado.
Centro de Apoio Técnico de Água Subterrânea e Água Potável,
Cincinnati, Ohio.
AGÊNCIA DE PROTEÇÃO AMBIENTAL DOS EUA . 2012. Diretrizes para Estab
estabelecer Procedimentos de Teste para Análise de Poluentes Sob o

água potável primária. 40 CFR Partes 141 e 142; Reg. Fed. Lei da Água Limpa; Procedimentos de Análise e Amostragem: Regra Final.
65(8):1950. 40 CFR Partes 136, 260, et al.; Reg. Fed 77(97):29797.

9221 C. Estimativa da Densidade Bacteriana

1. Precisão do Teste de Fermentação em Tubos Múltiplos maior diluição (menor volume de amostra) se tiver todos negativos
tubos e pelo menos uma diluição restante tem um tubo negativo.
O teste de fermentação em tubos múltiplos não é muito preciso, a menos que Em seguida, remova a diluição mais baixa (maior volume de amostra) se
muitas porções de amostra são examinadas, portanto, tenha cuidado ao interpretar têm todos os tubos positivos e pelo menos uma diluição restante tem um
o significado sanitário de qualquer resultado de coliformes único. tubo positivo. De acordo com estas diretrizes, as três diluições
A precisão melhora muito quando várias amostras de um determinado no Exemplo A são selecionados pela remoção do valor mais alto (0,001 mL)
ponto de amostragem são estimados separadamente e sua geometria e as diluições mais baixas (10 mL).
a média é calculada. Se a diluição mais baixa não tiver todos os tubos positivos, e
Embora tabelas e cálculos de números mais prováveis (NMP) sejam descritos várias das diluições mais altas têm todos os tubos negativos, então
para uso no teste de coliformes, eles também podem ser remova as diluições negativas mais altas (Exemplo B).
usado para determinar o NMP de qualquer organismo, desde que adequado
meios de teste estão disponíveis. Calculadoras MPN online estão disponíveis, TABELA 9221:II. ÍNDICE MPN E LIMITES DE CONFIANÇA DE 95% PARA TODOS
COMBINAÇÕES DE RESULTADOS POSITIVOS E NEGATIVOS QUANDO CINCO 20 ML
mas até que a precisão da calculadora seja verificada, confirme sua
PORÇÕES SÃO USADAS
resultados usando uma tabela MPN nesta seção.
95% de confiança
2. Uso de tabelas para determinar o MPN Nº de tubos fornecidos
Limites (exatos)
Reação Positiva Índice MPN/
de 5 (20 mL cada) 100mL Mais baixo Superior
Registre a concentração de coliformes como MPN/100 mL. O MPN
1,1 – 3.5
Os valores para uma variedade de combinações de tubos positivos e negativos são 0

dados nas Tabelas 9221:II, III e IV. Os volumes de amostra indicados 1,1 0,051 5.4
1 2,6 0,40 8.4
nas Tabelas 9221:II e III são escolhidos especialmente para água potável
exames. A Tabela 9221:IV ilustra os valores do NMP para combinações de 2 4,6 1,0 13
3 8,0 2,1 23
resultados positivos e negativos quando cinco 10 mL, cinco 1,0 mL, –
45 8,0 3,4
e cinco volumes de amostra de 0,1 mL de água não potável são
testado. Se os volumes das porções de amostra testadas forem idênticos aos
encontrados nas tabelas e, em seguida, informar o valor correspondente a
TABELA 9221:III. ÍNDICE MPN E LIMITES DE CONFIANÇA DE 95% PARA TODOS
combinação apropriada de resultados positivos e negativos como o
COMBINAÇÕES DE RESULTADOS POSITIVOS E NEGATIVOS QUANDO DEZ 10 ML
NMP/100 mL. Porém, se a série de diluições decimais for diferente, selecione o
PORÇÕES SÃO USADAS
valor MPN na Tabela 9221:IV que corresponde a
a combinação de resultados positivos e calcular o MPN atual 95% de confiança
Nº de tubos fornecidos
usando a seguinte fórmula: Limites (exatos)
Reação Positiva Índice MPN/
de 10 (10 mL cada) 100mL Mais baixo Superior
NMP/100 mL (Tabela NMP/100 mL) 10/V –
0 1,1 3.4
1,1 0,051 5.9
onde:
1 2,2 0,37 8.2
2 3,6 0,91 9.7
Volume V da porção da amostra na diluição mais baixa selecionada. 3 5,1 1,6 13
4 6,9 2,5 quinze

5 9,2 3,3 19
Se a série decimal1 incluir mais de três diluições, usar
6 12 4,8 24
as seguintes diretrizes para selecionar os três mais apropriados
7 16 5,8 3. 4
diluições e, em seguida, use a Tabela 9221:IV e a equação acima para
8 23 8,1 53
calcular o MPN. Consulte a Tabela 9221:V, que fornece vários 9 10 23 13 –
exemplos (A – G) de combinações de positivos. Primeiro, remova o

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TÉCNICA DE FERMENTAÇÃO DE MÚLTIPLOS TUBOS (9221)/Estimativa da Densidade Bacteriana

TABELA 9221:IV. ÍNDICE MPN E LIMITES DE CONFIANÇA DE 95% PARA VÁRIAS COMBINAÇÕES DE RESULTADOS POSITIVOS QUANDO CINCO TUBOS SÃO UTILIZADOS POR DILUIÇÃO

(10ML , 1,0ML , 0,1ML )*

Confiança Confiança
Limites Limites
Combinação de Combinação de
Positivos Índice NMP/100 mL Baixo Alto Positivos Índice NMP/100 mL Baixo Alto

0-0-0 1,8 — 6,8 0,090 6,8 4-0-3 25 9,8 70

0-0-1 1,8 0,090 6,9 0,70 10 4-1-0 17 6,0 40
0-1-0 1,8 0,70 10 1,8 15 1,8 15 4-1-1 21 6,8 42
0-1-1 3,6 0,10 10 0,70 10 1,8 4-1-2 26 9,8 70
0-2-0 3,7 15 0,71 12 1,8 15 4-1-3 31 10 70
0-2-1 5,5 3,4 22 1,8 15 3,4 4-2-0 22 6,8 cinquenta

0-3-0 5,6 22 3,4 22 3,5 22 4-2-1 26 9,8 70

1-0-0 2,0 3,5 22 0,79 15 1,8 4-2-2 32 10 70
1-0-1 4,0 15 3,4 22 1,8 17 4-2-3 38 14 100
1-0-2 6,0 3,4 22 4,1 26 3,4 4-3-0 27 9,9 70
1-1-0 4,0 22 4,1 26 5,9 36 4-3-1 33 10 70
1-1-1 6,1 4,1 26 5,9 36 5,9 4-3-2 39 14 100
1-1-2 8,1 36 2,1 22 3,5 23 4-4-0 34 14 100
1-2-0 6,1 5,6 35 3,5 26 5,6 4-4-1 40 14 100
1-2-1 8,2 36 6,0 36 5,7 36 4-4-2 47 15 120
1-3-0 8,3 6,8 40 6,8 40 6,8 4-5-0 41 14 100
1-3-1 10 40 6,8 40 9,8 70 6. 4-5-1 48 15 120
1-4-0 11 8 40 9,8 70 9,8 70 5-0-0 23 6,8 70
2-0-0 4,5 4,1 35 5,9 36 6,8 40 5-0-1 31 10 70
2-0-1 6,8 5-0-2 43 14 100
2-0-2 9,1 5-0-3 58 22 150
2-1-0 6,8 5-1-0 33 10 100
2-1-1 9,2 5-1-1 46 14 120
2-1-2 12 5-1-2 63 22 150
2-2-0 9,3 5-1-3 84 34 220
2-2-1 12 5-2-0 49 15 150
2-2-2 14 5-2-1 70 22 170
2-3-0 12 5-2-2 94 34 230
2-3-1 14 5-2-3 120 36 250
2-4-0 15 5-2-4 150 58 400
3-0-0 7,8 5-3-0 79 22 220
3-0-1 11 5-3-1 110 34 250
3-0-2 13 5-3-2 140 52 400
3-1-0 11 5-3-3 170 70 400
3-1-1 14 5-3-4 210 70 400
3-1-2 17 5-4-0 130 36 400
3-2-0 14 5-4-1 170 58 400
3-2-1 17 5-4-2 22 0 70 440
3-2-2 20 5-4-3 280 100 710
3-3-0 17 5-4-4 350 100 710
3-3-1 21 5-4-5 430 150 1100
3-3-2 24 5-5-0 240 70 710
3-4-0 21 5-5-1 350 100 1100
3-4-1 24 5-5-2 540 150 1700
3-5-0 25 5-5-3 920 220 2600
4-0-0 13 5-5-4 1600 400 4600
4-0-1 17 5-5-5 1600 700 -

4-0-2 21

* Resultados com dois algarismos significativos.

Mais de três diluições podem permanecer após a remoção da menor
diluição com todos os tubos positivos e diluições altas com todos os negativos
tubos. Neste caso, se a diluição mais elevada com todos os tubos positivos for
dentro de duas diluições da diluição mais alta com quaisquer tubos positivos,
em seguida, use a diluição mais alta com quaisquer tubos positivos e os dois
diminuir imediatamente as diluições. No Exemplo C, a diluição mais alta
com todos os tubos positivos é de 0,1 mL, o que está dentro de duas diluições de
0,001 mL, que possui um tubo positivo. No Exemplo D, o maior
diluição com todos os tubos positivos é de 0,01 mL, o que está dentro de dois
diluições decimais de 0,001 mL, para produzir uma combinação de 4-5-1.
Se, após a remoção da diluição mais baixa com todos os tubos positivos, não
diluição com todas as reações positivas permanece, então selecione o menor

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TÉCNICA DE FERMENTAÇÃO DE MÚLTIPLOS TUBOS (9221)/Estimativa da Densidade Bacteriana

TABELA 9221:V. EXEMPLOS PARA ESCOLHA DE TRÊS COMBINAÇÕES DE POSITIVOS DE CINCO DILUIÇÕES

Volume
mL
Combinação de Índice MPN
Exemplo 10 1 0,1 0,01 0,001 Positivos Nº/ 100 mL

Para 0 5 51 0 0 x-5-1-0- 330

B 45 1 0 x 4-5-1- 48
C 52 52 1 xx 7.000
D 45 45 1 xx-5-2-1 4800
E 5 44 0 1 xx-4-5-1 400
F 43 0 1 1 x-4-4-1- 39
G 43 32 1 x 4-3-2-xx xx-3- 2-1 1700

duas diluições e atribua a soma de quaisquer diluições restantes ao
terceira diluição. No Exemplo E, a diluição mais alta com todos os resultados positivos
tubos contendo 10 mL; esta diluição foi removida na segunda etapa.
Restam quatro diluições, nenhuma das quais com todos os tubos positivos. Sob
nessas circunstâncias, selecione as duas diluições restantes mais baixas
correspondentes a 1 e 0,1 mL de amostra. Para a terceira diluição, adicione o
número de tubos positivos em todas as diluições mais altas (0,01 e 0,001 mL
amostra), para produzir uma combinação final de 4-4-1.
Se nenhuma diluição tiver todos os tubos positivos (Exemplo F), selecione o
duas diluições mais baixas, correspondentes a 10 e 1 mL de amostra. Para
terceira diluição, adicione o número de tubos positivos na
diluições restantes (0,1, 0,01 e 0,001 mL de amostra), para produzir um
combinação final de 4-3-2. Se a terceira diluição for atribuída mais
de cinco tubos positivos, então a combinação selecionada não será
na Tabela 9221:IV.
Se as três diluições selecionadas não forem encontradas na Tabela 9221:IV,
então algo na diluição em série era incomum. Nesse caso,
os métodos usuais de cálculo do NMP, aqui apresentados, podem
não se aplica. Se uma nova amostra não puder ser coletada e um MPN
valor ainda for desejado, use a diluição mais alta com pelo menos um
tubo positivo e as duas diluições diminuem imediatamente à medida que o
três diluições selecionadas. No Exemplo G, a primeira seleção, 4-3-6
(o resultado das três diluições mais altas), não está na Tabela
9221:IV porque 6 é maior que 5. A segunda seleção,
De acordo com as orientações acima, seria 3-2-1. Se este segundo
conjunto de diluições selecionadas não estiver na Tabela 9221:IV, então use o
seguinte fórmula para calcular o MPN:
Por exemplo, na série xx-3-0-0, onde a terceira diluição
nível (zs) é igual a 0,1 mL, xszs o 0,3 e nj z j 0,555. Por isso,
MPN calculado 7800/100 mL.
Esta fórmula também se aplica a diluições em série com todos os resultados positivos
tubos em uma única diluição, e pode servir como uma aproximação para
resultados como 5-5-5-0-0-0, onde cinco tubos são usados por diluição,
usando apenas as últimas quatro diluições.
A Tabela 9221:IV mostra todos, exceto o improvável tubo positivo
combinações para uma série de três diluições. Ao testar 10 amostras,
há 99% de chance de encontrar todos os resultados entre esses 95
resultados. Se combinações não tabuladas ocorrerem com uma frequência
superior a 1%, indica que a técnica está defeituosa ou que
os pressupostos estatísticos subjacentes à estimativa do MPN não são
sendo cumpridas (por exemplo, inibição do crescimento em baixas diluições).
O NMP para combinações que não aparecem na tabela, ou para
outras combinações de tubos ou diluições, pode ser estimado como
segue: Primeiro, selecione a diluição mais baixa que não tenha todos
resultados positivos. Segundo, selecione a diluição mais alta com pelo menos
um resultado positivo. Por fim, selecione todas as diluições entre elas.
Por exemplo, de (10/10, 10/10, 4/10, 1/10, 0/10) use apenas
(–, –, 4/10, 1/10, –), correspondente a 4/10 @ 0,1 mL de amostra/
tubo e 1/10 @ 0,01 mL de amostra/tubo. Da mesma forma, a partir de (10/10,
10/10, 10/10, 0/10, 0/10), selecione apenas (–, –, 10/10, 0/10, –),
correspondente a 10/10 @ 0,1 mL de amostra/tubo e 0/10 @
0,01 mL de amostra/tubo. Use apenas as diluições selecionadas no
seguinte fórmula de Thomas: 1
1/2
MPN/100 mL (aprox.) 100 P/N T

xs zs
230,3
1 onde:
K
registro10
zs njzj Número P de resultados positivos,
js
N volume de amostra em todas as porções negativas combinadas,
mL, e
onde: T volume total da amostra nas diluições selecionadas, mL.

zs a quantidade da amostra original inoculada em cada tubo P

da ésima diluição, e Ou seja, N (nj -xj )zj , e T nj zj, onde o
xs o número de tubos positivos na s-ésima diluição, xj , os somatórios são sobre as diluições selecionadas e xj o número
K o número de diluições, de melodias positivas na j-ésima diluição.
j uma diluição, No primeiro exemplo acima,
é a diluição mais alta com pelo menos um tubo positivo,
nj o número de tubos na j-ésima diluição, e MPN/100 mL (aprox.) 100 5/(0,69 1,1)1/2
zj a quantidade da amostra original inoculada em cada tubo
na j-ésima diluição.
500/0,87 570/100 mL

https://doi.org/10.2105/SMWW.2882.192 7
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TÉCNICA DE FERMENTAÇÃO DE MÚLTIPLOS TUBOS (9221)/Presença-Ausência (P–A) Teste de Coliformes
No segundo exemplo acima,
MPN/100 mL (aprox.) 100 10/(0,1 1,1)1/2
1000/0,332 3000/100 mL
Os dois exemplos se comparam bem com os NMPs verdadeiros, 590/100 mL
e 2.400/100 mL, respectivamente. O segundo exemplo é um caso especial
para o qual uma solução exata pode ser calculada diretamente para as duas
diluições selecionadas.
Quando se deseja resumir os resultados de diversas amostras com um único
valor MPN, utilize a média geométrica ou a mediana. A média geométrica é
calculada pela média dos valores logarítmicos; por exemplo, a média geométrica
de A, B e C é 10L onde:
L log10 A log10 B log10 C/3
Os valores médios são relatados como o antilog de L.
3. Referência
1. THOMAS, HA, JR. 1942. Densidades bacterianas de testes em tubos de fermentação J.
Amer. Associação de Obras de Água. 34:572.
4. Bibliografia
MCCRADY, MH 1915. A interpretação numérica da fermentação
resultados do tubo. J. Infectar. Dis. 12:183.
9221 D. Teste de Coliformes Presença-Ausência (P–A)
O teste de presença-ausência (P–A) para o grupo coliforme é uma modificação
simples do procedimento de tubos múltiplos que se destina ao uso em amostras
de rotina coletadas de sistemas de distribuição ou estações de tratamento de
água. Esta simplificação usando uma grande porção de teste (100 mL) em um
único frasco de cultura para determinar qualitativamente se os coliformes estão
presentes ou ausentes é justificada pela teoria de que nenhum coliforme deve
estar presente em 100 mL de uma amostra de água potável. Além disso, permite
que os analistas examinem mais amostras em um determinado período de
tempo em comparação com métodos quantitativos. Estudos comparativos com
o procedimento de filtro de membrana indicam que o teste P-A pode maximizar
a detecção de coliformes em amostras contendo muitos organismos que
poderiam crescer demais em colônias de coliformes e causar problemas de
detecção.
O caldo P – A contém lactose e um indicador de pH para detectar a presença
de produção de ácido. Os analistas observam os frascos de cultura em busca
de produção de gás e/ou ácido – os produtos metabólicos finais da fermentação
da lactose. Os resultados de coliformes presumivelmente positivos obtidos do
caldo P–A devem ser confirmados com o caldo BGLB.
1. Amostras
Colete amostras conforme indicado na Seção 9060, usando recipientes de
amostras especificados na Seção 9030B.19. Siga o guia de controle de qualidade
https://doi.org/10.2105/SMWW.2882.192
MCCRADY, MH 1918. Tabelas para interpretação rápida de fermentação
resultados do tubo. Saúde do Pub J 9:201.
HALVORSON, HO e NR ZIEGLER. 1933–35. Aplicação de estatística a problemas de
bacteriologia. J. Bacteriol. 25:101; 26:331, 559; 29:609.
HOSKINS, JK 1933. Os números mais prováveis de B. coli na água
análise. J. Amer. Associação de Obras de Água. 25:867.
HOSKINS, JK 1934. Números mais prováveis para avaliação de testes de coli
aerogenes pelo método de tubo de fermentação. Representante de Saúde do Pub
49:393.
EISENHART, C. & PW WILSON. 1943. Métodos estatísticos e controle em
bacteriologia. Bacteriol. Apocalipse 7:57.
COCHRAN, WG 1950. Estimativa de densidades bacterianas por meio do
“número mais provável”. Biometria 6:105.
WOODWARD, RL 1957. Quão provável é o número mais provável?
J. Amer. Associação de Obras de Água. 49:1060.
DEMAN, JC 1983. Tabelas MPN, corrigidas. Eur. J. Appl. Biotecnologia.
17:301.
BLODGETT, RJ E NÓS GARTHHRIGHT. 1998. Vários modelos MPN para diluições
seriadas com crescimento suprimido em baixas diluições. Microbiol Alimentar.
15:91.
GARTHRIGHT, WE 1998. Apêndice 2: Número mais provável de diluições em série.
Manual Analítico Bacteriológico da FDA, 8ª ed., Rev.
AOAC Internacional, Gaithersburg, Maryland.
BLODGETT, RJ 2002. Medição de improbabilidade de resultados de um teste de
diluição seriada. Comum. Estatista. Teoria Metanfetamina. 31:2209.
GARTHIGHT, NÓS E RJ BLODGETT. 2003. Métodos MPN preferidos da FDA para
testes padrão, grandes ou incomuns, com uma planilha.
Microbiol Alimentar. 20:439.
BLODGETT, RJ 2010. Apêndice 2: Número mais provável de diluições seriadas. Manual
analítico bacteriológico da FDA. Disponível em: http://www.fda.gov/food/
foodscienceresearch/laboratory methods/ucm109656.htm. Acessado em novembro
de 2016.
linhas para frascos de amostra descritos na Seção 9020B.5d. Certifique-se de que as
amostras atendam aos critérios de aceitação do laboratório no momento do recebimento.
2. Fase Presumida
para. Meio de cultura:
Caldo PA: Siga as diretrizes de CQ citadas em 9221B.2.
Extrato de carne bovina. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3,0 g
Peptona. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5,0 lactose
g ................................ 7,46 g Triptose ............. .................... 9,83 g
Hidrogenofosfato dipotássico (K2HPO4)....... 1,35 Dihidrogenofosfato de potássio
(KH2PO4) ....... . 1,35 g Cloreto de sódio (NaCl) ...................... 2,46 g Lauril g
sulfato de sódio ............... . ........ 0,05 g Roxo de bromocresol .........................
0,0085 g Água grau reagente...... . .................. 1L
Faça esta formulação com força tripla (3) ao examinar amostras de 100 mL.
Dissolva o meio P – A em água mexendo (não use calor). Dispense 50 mL do
meio preparado em frascos de diluição de leite de 250 mL com tampa de rosca
ou recipientes equivalentes. A inserção do frasco de fermentação é
desnecessária. Autoclave por 12 min a 121°C; limite o tempo total na autoclave
a 30 minutos ou menos.
O pH médio deve ser 6,8 0,2 após a esterilização.
8
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TÉCNICA DE FERMENTAÇÃO DE MÚLTIPLOS TUBOS (9221)/Presença-Ausência (P–A) Teste de Coliformes
Figura 9221:1. Esboço esquemático das fases presumível, confirmada e concluída para detecção de coliformes totais.
Se esterilizado por filtração, um meio P – A de concentração 6 pode
ser usado. Distribua assepticamente 20 mL do meio 6 em um frasco de
diluição estéril de 250 mL ou recipiente equivalente.
b. Procedimento: Agitar a amostra vigorosamente por 5 s
(aproximadamente 25 vezes) e inocular 100 mL em um frasco de cultura
P–A. Misture bem invertendo o frasco uma ou duas vezes para distribuir
uniformemente a amostra por todo o meio. Incubar a 35 0,5°C e
inspecionar após 24 2 horas e 48 3 horas para ver se há reações ácidas.
c. Interpretação: Se existirem condições ácidas após a fermentação
da lactose, uma cor amarela distinta se formará no meio. Se também
estiver sendo produzido gás, ocorrerá formação de espuma quando a
garrafa for suavemente agitada. Qualquer quantidade de gás e/ou ácido
constitui um teste presuntivamente positivo que requer confirmação.
3. Fase Confirmada
A fase confirmada está descrita na Figura 9221:1. para.
Meio de cultura: Use tubos de fermentação em caldo BGLB (ver
9221B.4).
b. Procedimento: Após a incubação, use imediatamente uma alça
estéril de 3,0 a 3,5 mm de diâmetro para transferir uma ou mais alças
cheias de cultura de um frasco presumivelmente positivo para um tubo
de fermentação contendo caldo BGLB. Alternativamente, insira um
aplicador de madeira estéril pelo menos 2,5 cm na cultura, remova-o
imediatamente e mergulhe o aplicador no fundo de um tubo de
fermentação contendo caldo BGLB. Remova e descarte o aplicador. Repita para todos15:771.
https://doi.org/10.2105/SMWW.2882.192
outros tubos presumivelmente positivos e inocular a 35 (ver 0,5ºC
9221B.4).
Alças cheias de cultura de frascos presumivelmente positivos também
podem ser transferidas para caldo EC [para determinação de coliformes
termotolerantes (fecais)] e/ou caldo EC-MUG (para determinações de E.
coli) ao mesmo tempo, desde que o máximo o meio inibitório (caldo
BGLB) é inoculado por último.
c. Interpretação: A produção de gás na cultura em caldo BGLB dentro
de 48 3 h confirma a presença de bactérias coliformes.
Reportar resultado como teste P–A positivo ou negativo para coliformes
totais em 100 mL de amostra. Amostras de água potável positivas para
coliformes totais também devem ser testadas para coliformes
termotolerantes (fecais) (9221E) ou E. coli (9221F).
4. Fase Concluída
A fase concluída, necessária para amostra de água não potável
análise, está descrito em 9221B.5 e na Figura 9221:1.
5. Bibliografia
WEISS, JE e CA HUNTER. 1939. Exame bacteriológico simplificado da água. J.
Amer. Associação de Obras de Água. 31:707.
CLARK, JA 1969. A detecção de várias bactérias indicativas de poluição da água
por um procedimento de presença-ausência (P – A). Cachorro. J. Microbiol.
9
Machine Translated by Google
TÉCNICA DE FERMENTAÇÃO DE MÚLTIPLOS TUBOS (9221)/Procedimento de Coliformes Termotolerantes (Fecal)
CLARK, JA e LT VLASSOFF. 1973. Relações entre poluição
bactérias indicadoras isoladas de água bruta e sistemas de distribuição
pelo teste de presença-ausência (P–A). Laboratório de Saúde Sci 10:163.
CLARK, JA 1980. A influência do número crescente de não-indicadores
organismos após a detecção de organismos indicadores pela membrana
filtro e testes de presença-ausência. Cachorro. J. Microbiol. 26:827.
CLARK, JA, CA BURGER & LE SABATINOS. 1982. Caracterização de
bactérias indicadoras em água bruta municipal, água potável e novas
principais amostras de água. Cachorro. J. Microbiol. 28:1002.
9221 E. Procedimento de Coliformes Termotolerantes (Fecal)
Tradicionalmente chamados de coliformes fecais, coliformes termotolerantes
(aqueles que fermentam a lactose para produzir gás a 44,5°C) foram
documentado em águas organicamente ricas ou climas tropicais no
ausência de contaminação fecal recente. Então, ao procurar
evidência de contaminação fecal, testes para E. coli – um método mais
indicador específico – é recomendado. No entanto, regulamentos
pode exigir que coliformes termotolerantes (fecais) sejam identificados
e enumerado.
Para testar coliformes termotolerantes, use um dos procedimentos de múltiplos
tubos descritos aqui ou os métodos de filtro de membrana
descrito nas Seções 9222D e E. Na técnica de fermentação em tubos múltiplos, os
coliformes termotolerantes são identificados por seus
capacidade de fermentar a lactose para produzir gás a 44,5 0,2°C dentro
24 2 horas.
1. Teste de Coliformes Termotolerantes (Meio CE)
O teste de coliformes termotolerantes utilizando meio EC é aplicável a
investigações de água potável, poluição de rios,
fontes de água bruta não filtrada, sistemas de tratamento de águas residuais,
águas balneares, águas do mar e monitorização geral da qualidade da água.
Não use meio EC para isolar diretamente formas de coli termotolerantes da água;
o enriquecimento prévio em um meio presuntivo é
necessária para a recuperação ideal de coliformes termotolerantes. (Para
testar presumíveis colônias de coliformes crescendo em meio sólido, consulte
para a Seção 9222G.3c)
para. Meio CE: Prepare o meio CE seguindo as diretrizes de CQ
citado em 9221B.2.
Triptose ou tripticase ........................... 20,0 g
Lactose. .5,0g
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Mistura de sais biliares ou sais biliares nº 3. . . . . . . . . . . . . . . . 1,5g
Hidrogenofosfato dipotássico (K2HPO4). . . 4,0g . . . . . . . .
Dihidrogenofosfato de potássio (KH2PO4) . . 1,5g. . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Cloreto de sódio (NaCl). . . 5,0g
Água de grau reagente........................... 1 L
Adicione ingredientes desidratados à água, misture bem e aqueça
dissolver. Antes da esterilização, distribua meio suficiente em
tubos de fermentação com um frasco invertido para cobrir o invertido
frasco pelo menos meio a dois terços após a esterilização. Fechar tubos
com tampas de metal ou de plástico resistente ao calor. Meio autoclave em
121°C por 12 a 15 minutos. Certifique-se de que os frascos invertidos estejam livres de ar
bolhas. O pH médio deve ser 6,9 0,2 após a esterilização.
https://doi.org/10.2105/SMWW.2882.192
JACOBS, NJ, WL ZEIGLER, FC REED, TA STUKEL & EW RICE.
1986. Comparação de filtro de membrana, tubo de fermentação
múltipla e técnicas de presença-ausência para detecção de total
coliformes em pequenos sistemas de água comunitários. Apl. Meio Ambiente.
Microbiol. 51:1007.
ARROZ, EW, EE GELDREICH & EJ LEIA. 1989. A presença-ausência
teste de coliformes para monitoramento da qualidade da água potável. Pub. Saúde
Rep 104:54.
b. Procedimento:
1) Após a incubação, agite ou gire suavemente os tubos de fermentação
ou garrafas mostrando gás, crescimento ou acidez para ressuspender o
organismos. Use imediatamente uma alça estéril de 3 a 3,5 mm de diâmetro para
transferir uma ou mais voltas cheias de cultura de garrafas ou tubos
mostrando crescimento com produção de ácido e/ou gás para um tubo de
fermentação contendo caldo EC. Alternativamente, insira um estéril
aplicador de madeira pelo menos 2,5 cm na cultura, imediatamente
remova e mergulhe o aplicador no fundo de uma fermentação
tubo contendo caldo EC. Remova e descarte o aplicador. Repita a repetição para
todos os outros tubos presumivelmente positivos e incube em
44,5 0,2°C.
Inoculação simultânea em caldo EC e/ou EC-MUG
caldo junto com caldo BGLB é aceitável, se o meio mais inibidor (caldo BGLB) for
inoculado por último.
2) Coloque todos os tubos de CE em banho-maria circulante (de preferência
com cobertura triangular) dentro de 30 minutos após a inoculação. Incubar
tubos de caldo EC inoculados a 44,5 0,2°C por 24 2 h.
Mantenha uma profundidade de água suficiente na incubadora de banho-maria para
Mergulhe os tubos no nível superior do meio.
c. Interpretação: Produção de gás com crescimento em caldo CE
a cultura dentro de 24 horas ou menos é considerada uma reação positiva de
coliformes termotolerantes (fecais). Falha na produção de gás (com
pouco ou nenhum crescimento) constitui uma reação negativa. Se vários
tubos, calcule o NMP de coliformes termotolerantes
do número de tubos de caldo EC positivos, conforme descrito em
9221C. Ao usar apenas um tubo para subcultura de um único
frasco presuntivo, reportar como presença ou ausência de coliformes
termotolerantes. Se ocorrer um crescimento intenso sem produção de gás, submeta
a cultura a um coliforme termotolerante ou E. coli
teste usando um meio diferente.
2. Teste direto de coliformes termotolerantes (fecais) (meio A-1)
para. Meio A-1: Este meio pode ser usado para isolar diretamente
coliformes termotolerantes provenientes de água de origem não filtrada, tratada
águas residuais e água do mar, mas não água potável. Siga as orientações em
9221B.1 para coleta de amostras. Ao contrário do meio EC, A-1
meio não requer enriquecimento prévio em um presumível
meio para recuperação ideal de coliformes termotolerantes. Usar
Diretrizes de CQ citadas em 9221B.2.
Lactose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5,0g
Triptona.................................. 20,0 g
Cloreto de sódio (NaCl). . . 5,0g . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
10
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TÉCNICA DE FERMENTAÇÃO DE MÚLTIPLOS TUBOS (9221)/Procedimento de Escherichia coli usando substrato fluorogênico
Salicina. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,5 g Éter p-
isooctilfenílico de polietilenoglicol* Água de grau . . . . . . . . . . 1,0mL
reagente ...........................
Aquecer para dissolver os ingredientes sólidos, adicionar éter p-isooctilfenílico
de polietilenoglicol e ajustar para pH 6,9 0,1. Para amostras de 10 mL, prepare
meio de concentração dupla para que a concentração final dos ingredientes após
a adição da amostra seja correta. Antes da esterilização, distribua meio suficiente
em tubos de fermentação com um frasco invertido para cobrir o frasco invertido
pelo menos metade a dois terços após
esterilização. Feche com tampas de metal ou plástico resistente ao calor. Esterilize
em autoclave a 121°C por 10 min. Certifique-se de que os frascos invertidos estão
livres de bolhas de ar. Armazenar no escuro em temperatura ambiente por no
máximo 7 dias. Ignore o precipitado formado durante o armazenamento.
b. Procedimento: Inocular tubos de caldo A-1 conforme indicado em 9221B.3b.
Incubar durante 3 horas a 35 0,5°C. Transferir os tubos para um banho-maria a
44,5 0,2°C e incubar por mais 21 2 hc. Interpretação: A produção de gás em
qualquer cultura em caldo A-1 dentro de 24 horas ou menos é uma reação
positiva [isto é, coliformes termotolerantes (fecais) estão presentes]. Calcule o MPN
de coliformes termotolerantes (fecais) a partir do número de tubos de caldo A-1
positivos, conforme descrito em 9221C.
* Triton X-100, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO ou equivalente.
Procedimento 9221 F. Escherichia coli usando substrato fluorogênico
Escherichia coli é um membro da flora fecal indígena de animais de sangue
quente. A presença de E. coli na água é considerada um indicador específico de
contaminação fecal e da possível presença de patógenos entéricos. Os testes para
E. coli são aplicáveis à análise de água potável, superficial, do solo e residual. O
teste para E. coli pode ser realizado usando o procedimento de tubos múltiplos
descrito aqui, pelo método de filtro de membrana descrito na Seção 9222G, ou
pelos testes de substrato enzimático cromogênico descritos na Seção 9223. Outros
procedimentos de E. coli são apresentados em 9221G.
Para o teste de E. coli utilizando meio EC-MUG, E. coli é definida como a
espécie de bactéria coliforme que possui a enzima -glucuronidase, que pode clivar
o substrato fluorogênico 4-metilumbeliferil--D-glucuronídeo (MUG), liberando
assim o fluorógeno dentro de 24 2 h ou menos quando cultivado em meio EC-MUG
a 44,5 0,2°C.
1. Teste de Escherichia coli (meio EC-MUG)
O uso do meio EC-MUG para detectar E. coli é aplicável a investigações de
água potável, poluição de riachos, fontes de água bruta não filtrada, sistemas de
tratamento de águas residuais, águas balneares, águas do mar e monitoramento
geral da qualidade da água. Não utilize EC-MUG para o isolamento direto de E.
coli; O enriquecimento prévio num meio presuntivo é necessário para uma
recuperação óptima. (Para testar presumíveis colônias de coliformes crescendo em
meio sólido, consulte a Seção 9222G.2.)
Use meio EC-MUG para testar E. coli em coliformes totais
cultura positiva, seguindo as diretrizes de CQ citadas em 9221B.2.
https://doi.org/10.2105/SMWW.2882.192
3. Bibliografia
1L PERRY, CA & AA HAJNA. 1933. Um meio Eijkman modificado.
J. Bacteriol. 26:419.
PERRY, CA & AA HAJNA. 1944. Avaliação adicional do meio EC para o isolamento
de bactérias coliformes e Escherichia coli. Amer. J.
Saúde do Pub 34:735.
GELDREICH, EE, HF CLARK, PW KABLER, CB HUFF e RH BORDNER.
1958. O grupo coliforme. II. Reações em meio EC a 45°C.
Apl. Microbiol. 6:347.
GELDREICH, EE, RH BORDNER, CB HUFF, HF CLARK & PW
CABEL. 1962. Tipo de distribuição de bactérias coliformes nas fezes de
animais de sangue quente. J. Poluição da Água. Controle do Fed.
34:295.
GELDREICH, EE 1966. Significado Sanitário de Coliformes Fecais no Meio
Ambiente; Publicação FWPCA WP-20-3. Departamento do Interior dos EUA,
Washington, DC
ANDREWS, WH & MW PRESNELL. 1972. Recuperação rápida de Escherichia coli
da água estuarina. Apl. Microbiol. 23:521.
OLSON, BH 1978. Melhor precisão dos testes de coliformes em água do mar por
meio de uma modificação do método do número mais provável. Apl. Microbiol.
36:438.
STANDRIDGE, JH e JJ DELFINO. 1981. Meio A-1: Técnica alternativa para
enumeração de organismos coliformes fecais em águas residuais cloradas.
Apl. Meio Ambiente. Microbiol. 42:918.
para. Meio EC-MUG: Prepare o meio EC-MUG seguindo as diretrizes de CQ
citadas em 9221B.2.
Triptose ou tripticase ....................... 20,0
Lactose g . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5,0 g de mistura de
sais biliares ou sais biliares nº 3. . . . . . . . . . . . . . . 1,5 g de hidrogenofosfato
dipotássico (K2HPO4). . . . . . . . . . 4,0 g de dihidrogenofosfato de potássio
(KH2PO4). . . . . . . . . . 1,5 g de cloreto de sódio
(NaCl). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5,0 g de 4-metilumbeliferil--D-glicuronídeo
(MUG) ........ 0,05 g de água de grau reagente ..................... .. .
1L
Adicione os ingredientes desidratados à água, misture bem e aqueça para
dissolver. Antes da esterilização, dispense em tubos que não apresentem
fluorescência sob luz ultravioleta (UV) de comprimento de onda longo (365–366
nm). Não é necessário um tubo invertido. Fechar os tubos com tampas metálicas
ou plásticas resistentes ao calor. O pH do meio deve ser de 6,9-0,2 após
esterilização por 15 minutos a 121°C. b.
Procedimento: 1)
Agite ou gire suavemente os tubos ou garrafas de fermentação que apresentem
crescimento, gás ou acidez para ressuspender os organismos. Usando uma alça
estéril de 3 ou 3,5 mm de diâmetro, transfira uma ou mais alças cheias de
crescimento do tubo ou frasco de fermentação para o caldo EC-MUG.
Alternativamente, insira um aplicador de madeira estéril pelo menos 2,5 cm na
cultura, remova-o imediatamente e mergulhe o aplicador no fundo de um tubo de
fermentação contendo caldo EC-MUG.
2) Coloque todos os tubos EC-MUG em banho-maria dentro de 30 minutos após
a inoculação. Incubar tubos EC-MUG inoculados e controles negativos por 24 2 h
em banho-maria circulante (de preferência com uma tampa de frontão) mantido a
44,5 0,2°C. Mantenha uma quantidade suficiente
onze
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TÉCNICA DE FERMENTAÇÃO DE MÚLTIPLOS TUBOS (9221)/Outros procedimentos de Escherichia coli
profundidade da água na incubadora de banho-maria para mergulhar os tubos no
nível superior do meio. c.
Interpretação: Examine todos os tubos que apresentam crescimento de
fluorescência usando uma lâmpada UV de comprimento de onda longo de 6 W,
365–366 nm. A presença de fluorescência azul brilhante é considerada um
resultado positivo para E. coli. O crescimento na ausência de fluorescência azul
brilhante é considerado um resultado negativo. Para ajudar a interpretar os
resultados e evitar a identificação incorreta da autofluorescência fraca do meio
ou dos tubos de vidro como uma resposta positiva, inclua no ensaio um controle
positivo [uma cultura conhecida de E. coli (positiva para MUG)], um controle
negativo [uma Klebsiella pneu moniae termotolerante (cultura MUG-negativa)] e
um meio de controle não inoculado. A distância entre a lâmpada UV e os tubos
deve ser tal que o controlo positivo de E. coli apresente fluorescências distintas,
enquanto os controlos MUG-negativos e não inoculados não.
Se utilizar vários tubos, calcule o MPN para E. coli a partir do número de tubos
de caldo EC-MUG positivos, conforme descrito em 9221C.
Ao usar apenas um tubo ou subcultivar de um único frasco ou colônia presuntiva,
relate a presença ou ausência de E. coli.
2. Determinação Simultânea de Coliformes Termotolerantes
e E. coli
A presença de coliformes termotolerantes e E. coli pode ser determinada
simultaneamente incluindo um frasco invertido (tubo de Durham) em tubos de
caldo EC-MUG. Prepare o caldo EC-MUG de acordo com 9221F.1. para.
Preparação: Antes da
esterilização, distribua, em tubos de fermentação com frasco invertido, meio
suficiente para cobrir o frasco invertido pelo menos metade a dois terços após a
esterilização. Fechar com tampas metálicas ou resistentes ao calor. O pH do
meio deve ser de 6,9-0,2 após esterilização por 15 minutos a 121°C. b.
Procedimento: 1) Agite ou gire suavemente os
tubos ou garrafas
de fermentação que apresentem crescimento, gás ou acidez para
ressuspender os organismos. Usando uma alça estéril de 3 ou 3,5 mm de
diâmetro, transfira uma ou mais alças cheias de crescimento do tubo ou frasco
de fermentação para o caldo EC-MUG.
Alternativamente, insira um aplicador de madeira estéril pelo menos 2,5 cm na
cultura, remova-o imediatamente e mergulhe o aplicador no fundo de um tubo de
fermentação contendo caldo EC-MUG.
9221 G. Outros procedimentos para Escherichia coli
Para o teste de E. coli utilizando o reagente GAD, E. coli é definida como a
espécie de bactéria coliforme que possui a enzima glutamato descarboxilase
(GAD), que pode produzir uma reação alcalina em 4 horas em um reagente
contendo ácido glutâmico e um agente lítico. agente.
Este procedimento é usado para testar E. coli após enriquecimento prévio em um
meio usado para identificar bactérias coliformes. O procedimento é particularmente
útil para determinar a presença de cepas de E. coli negativas para MUG, algumas
das quais são patogênicas (ver também Seção 9260F).
https://doi.org/10.2105/SMWW.2882.192
2) Coloque todos os tubos EC-MUG em banho-maria dentro de 30 minutos
após a inoculação. Incubar tubos EC-MUG inoculados, juntamente com controles
positivos e negativos, por 24 2 h em banho-maria circulante (de preferência com
uma tampa de frontão) mantido a 44,5 0,2°C.
Mantenha uma profundidade de água suficiente na incubadora de banho-maria
para imergir os tubos até o nível superior do meio. c.
Interpretação: Examine todos os tubos que apresentam crescimento e/ou gás
para fluorescência usando uma lâmpada UV de comprimento de onda longo de 6
W, 365–366 nm. O crescimento com produção de gás é considerado um resultado
positivo para coliformes termotolerantes. A presença de fluorescência azul
brilhante é considerada um resultado positivo para E. coli. Tubos com crescimento
e/ou gás e fluorescência são considerados positivos tanto para coliformes
termotolerantes quanto para E. coli. Tubos com crescimento e/ou gás, mas sem
fluorescência azul brilhante, são considerados positivos para coliformes
termotolerantes e negativos para E. coli.
Devido à autofluorescência nativa do meio ou dos tubos/inserções de vidro,
tenha cuidado na interpretação dos resultados. Para ajudar a interpretar os
resultados, inclua em cada ensaio um controle positivo [uma cultura conhecida
de E. coli (positiva para MUG)], um controle negativo [uma cultura termotolerante
de Klebsiella pneumoniae (negativo para MUG)] e um controle de meio oculado
de união. A distância entre a lâmpada UV e os tubos deve ser tal que o controle
positivo de E. coli apresente fluorescência distinta, enquanto os controles MUG-
negativos e oculados por união não. Se forem utilizados vários tubos, calcule o
NMP para E. coli e coliformes termotolerantes a partir do número
de tubos de caldo EC-MUG positivos, conforme descrito em 9221C. Ao usar
apenas um tubo ou subcultivar de um único frasco ou colônia presumível, relate
a presença ou ausência de E. coli e coliformes termotolerantes.
3. Bibliografia
FENG, PCS & PA HARTMAN. 1982. Ensaios fluorogênicos para confirmação
imediata de Escherichia coli. Apl. Meio Ambiente. Microbiol. 43:1320.
HARTMAN, PA 1989. O teste MUG (glucuronidase) para E. coli em alimentos e
água. Em A. Balows, RC Tilton & A. Turano, eds. Métodos Rápidos e
Automação em Microbiologia e Imunologia. Processo. 5º Simpl. Internacional
sobre Métodos Rápidos e Automação em Microbiologia e Imunologia,
Florença, Itália, 4 a 6 de novembro de 1987.
ARROZ SHADIX, LC & EW . 1991. Avaliação do ensaio de -glucuronidase para a
detecção de Escherichia coli em águas ambientais.
Cachorro. J. Microbiol. 37:908.
1. Teste de Escherichia coli (procedimento GAD)
Use o procedimento GAD para testar E. coli em uma cultura positiva para
coliformes totais seguindo as diretrizes de CQ citadas em 9221B.2.
para. Reagente GAD:
Ácido L-glutâmico. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1,0 g Cloreto de
sódio (NaCl) ..................... 90,0 g Verde de bromocresol.................. ........0,05g
12
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TÉCNICA DE FERMENTAÇÃO DE MÚLTIPLOS TUBOS (9221)/Outros procedimentos de Escherichia coli
Éter octilfenílico de polietilenoglicol* Água de . . . . . . . . . . . 3,0mL
grau reagente ........................ 1L
Adicione os ingredientes à água e misture bem até que todos os ingredientes
estejam dissolvidos. O pH deve ser 3,4 0,2. O reagente é estável durante 2
meses quando armazenado a 5°C. Pode ser esterilizado por filtro (filtro de 0,2 m)
e tratado como uma solução estéril. b. Procedimento:
1) Agite ou gire suavemente os presumíveis tubos ou garrafas que apresentem
crescimento, gás ou acidez. Usando uma pipeta graduada, transfira 5 mL de
caldo do tubo ou garrafa de fermentação para um tubo de centrífuga de 15 mL.
2) Concentre as células bacterianas centrifugando o caldo a 2.500 a 3.000 g
por 10 min. Descarte o sobrenadante e ressuspenda as células em 5 mL de
tampão fosfato. Reconcentre as células por centrifugação a 2.500 a 3.000 g por
10 min. Descarte o sobrenadante e adicione 1,0 mL de reagente GAD. Agite
vigorosamente o tubo para ressuspender as células no reagente GAD.
3) Incubar os tubos a 35°C e observar após 1 h. Os tubos podem ser
incubados por no máximo 4 horas.
c. Interpretação: Examine todos os tubos para verificar se há uma mudança
de cor distinta de amarelo para azul, o que é considerado um resultado positivo
para E. coli. Para auxiliar na interpretação dos resultados, incorpore no ensaio
um controle positivo [uma cultura conhecida de E. coli (GAD-positiva)], um
controle negativo [um organismo coliforme total conhecido, como Enterobacter
cloacae (GAD-negativo)] e um controle de reagente GAD não inoculado. Se
forem utilizados vários tubos, calcule o MPN para E. coli a partir do número de
tubos GAD positivos, conforme descrito em 9221C. Ao usar apenas um tubo ou
frasco presuntivo, reportar presença ou ausência de E. coli.
2. Teste de Escherichia coli (produção de indol)
Para efeitos deste teste, E. coli é definida como a espécie de bactéria coliforme
que pode produzir indol em 24 2 horas quando cultivada em água triptonada a
44,5 ± 0,2°C. Há exceções: Klebsiella oxytoca e algumas cepas de C. freundii e
Enterobacter spp. também são de natureza positiva. Use água triptona e reagente
de Kovac para testar E. coli em uma cultura positiva para coliformes totais.
para. Reagentes: Prepare água triptona e reagente de Kovac seguindo as
orientações citadas em 9221B.2.
1) Água triptona:
Triptona. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20 g Cloreto de sódio
(NaCl) ........................... 5g Água grau reagente ............ . ...............
1L
* Triton X-100, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO ou equivalente.
https://doi.org/10.2105/SMWW.2882.192
Adicione os ingredientes à água e misture bem até dissolver.
Ajuste o pH para 7,5. Dispense porções de 5 mL em tubos, tampe e esterilize por
10 min a 121°C.
2) Reagente de Kovac:
p-Dimetilaminobenzaldeído................. 5g Álcool amílico (grau
analítico) . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75 mL Ácido clorídrico,
conc. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25mL
Dissolva o aldeído em álcool. Adicione cuidadosamente o ácido à mistura de
aldeído-álcool e agite para misturar. Armazenar no escuro a 4°C.
CUIDADO: O reagente é corrosivo e inflamável. Este reagente deve ter uma
cor amarelo pálido a castanho claro. A utilização de álcool amílico de baixa
qualidade pode produzir um reagente de cor escura; não use esse reagente. b.
Procedimento:
Agite ou gire suavemente os tubos ou frascos presumíveis que apresentem
crescimento, gás ou acidez. Usando uma alça de metal estéril de 3 ou 3,5 mm
de diâmetro ou um bastão aplicador de madeira estéril, transfira o crescimento
do tubo ou garrafa de fermentação presumível para um tubo contendo 5 mL de
água triptonada. Incubar tubos de água triptona inoculados em banho-maria ou
incubadora mantida a 44,5 0,2°C por 24 2 h. Após a incubação, adicione 0,2 a
0,3 mL de reagente de Kovac a cada tubo de água triptona. c. Interpretação:
Examine todos os tubos quanto ao aparecimento de uma cor
vermelha profunda na camada superior, o que é considerado um resultado
positivo para E. coli. Para auxiliar na interpretação dos resultados, incorpore no
ensaio um controle positivo [uma cultura conhecida de E. coli (indole positiva)],
um controle negativo [um organismo coliforme total conhecido, como Enterobacter
cloacae (indole-negativo)] e um controle de reagentes não inoculados. Se forem
utilizados vários tubos, calcule o NMP para E. coli a partir do número de tubos
positivos para indol, conforme descrito em 9221C. Ao usar apenas um tubo ou
frasco presuntivo, reportar presença ou ausência de E. coli.
3. Bibliografia
FIEDLER, J. & J. REISKE. 1990. Glutaminasauredecarboxilase-
schnelltest para identificação de Escherichia coli. Z. Ges. Hig.
Grenzgeb. 36:620.
ARROZ, EW, CH JOHNSON, ME DUNNIGAN & DJ REASONER. 1993.
Ensaio rápido de glutamato descarboxilase para detecção de Escherichia
coli. Apl. Meio Ambiente. Microbiol. 59:4347. Errata. 1995. Ap. Eles
enviaram rum. Microbiol. 61:847.
COMITÊ PERMANENTE DE ANALISTAS. 1994. Relatório sobre Saúde Pública e
Assuntos Médicos No. 71: Métodos para o Exame de Águas e Materiais
Associados, A Microbiologia da Água Parte 1 – Água Potável. HMSO Books,
Londres, Reino Unido
ARROZ, EW, CH JOHNSON & DJ RAZÃO. 1996. Detecção de Esche richia coli O157:H7
em água de culturas de enriquecimento de coliformes.
Vamos. Apl. Microbiol. 23:179.
13
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9222 TÉCNICA DE FILTRO DE MEMBRANA PARA MEMBROS DO GRUPO COLIFORM*

9222 A. Introdução

A técnica do filtro de membrana (MF) é reprodutível, pode ser
usado para testar volumes de amostra relativamente grandes e geralmente produz
resultados numéricos mais rapidamente do que o procedimento de fermentação
em tubos múltiplos. É útil no monitoramento da água potável e
diversas águas naturais. Contudo, a técnica MF tem limitações, particularmente
quando se testa águas com alta turbidez ou
um grande número de bactérias não coliformes (de fundo). Se ocorrer interferência
de bactérias heterotróficas, por exemplo, os resultados da amostra
pode precisar ser invalidado e novas amostras coletadas.
Se um laboratório nunca utilizou a técnica MF antes, os analistas
deve realizar testes paralelos com o método atual do laboratório para
demonstrar aplicabilidade e comparabilidade. Muitos estudos de desempenho de
coliformes foram relatados na literatura; as taxas de
resultados falso-positivos e negativos podem diferir entre vários
meio coliforme, portanto os usuários devem selecionar cuidadosamente o meio e
procedimento que melhor atenda às suas necessidades.
Enzima ß-glucuronidase em 5-bromo-4-cloro-3-indolil-ß-D glicuronídeo (BCIG),
também presente no meio.
c. Meio MI fluorógeno/ cromógeno: Este meio filtrante de membrana diferencial
detecta e enumera simultaneamente ambos
coliformes totais (TC) e Escherichia coli (E. coli) em água
amostras em 24 h com base em suas atividades enzimáticas específicas.
O meio inclui dois substratos enzimáticos - o fluorógeno
4-metilumbeliferil--D-galactopiranosídeo (MUGal) e o
cromogênio indoxil-D-glicuronídeo (IBDG) para detectar as enzimas -galactosidase
e -glucuronidase produzidas por TC e
E. coli, respectivamente. Neste procedimento, as bactérias coliformes são
definido como bactérias que produzem colônias fluorescentes dentro de 24 horas
quando exposto à luz ultravioleta (UV) de ondas longas (365–366 nm)
a 35°C, enquanto as colónias de E. coli aparecem azuis neste meio.
2. Aplicações

A técnica MF pode ser usada para testar o consumo, a superfície,

1. Terminologia
solo, piscina e águas marinhas. Não use para testar
efluente primário de tratamento de águas residuais, a menos que a amostra seja
Na técnica MF, o grupo coliforme é definido como anaeróbio facultativo, Gram-
diluída, porque o alto nível de turbidez pode entupir a membrana
negativo, não formador de esporos, em forma de bastonete.
filtrar antes que amostra suficiente tenha sido filtrada. Clorado
bactérias que desenvolvem colônias com características distintas em
os efluentes devem ter contagens e turbidez baixas. Além disso, não use
mídia específica. Quando culturas purificadas de bactérias coliformes são
a técnica MF para testar águas residuais contendo altos níveis de
testados, eles produziram citocromo oxidase negativo e positivo
metais tóxicos ou compostos orgânicos tóxicos (por exemplo, fenóis) porque
reações de teste de -galactosidase. Detalhes dessas características de
o filtro pode concentrar tais substâncias, inibindo assim
coliformes são fornecidos abaixo para o MF de coliformes totais padrão.
crescimento de coliformes. Para amostras que não sejam de águas residuais, alta turbidez
procedimento (9222B) (¶ a abaixo) e para dois procedimentos para
níveis podem obstruir o filtro e altas concentrações de bactérias heterotróficas
detectando coliformes totais e E. coli simultaneamente (9222J e
podem interferir no crescimento de coliformes no filtro,
K) (¶s bec abaixo ) .
possivelmente exigindo o uso de múltiplos filtros por amostra e/ou
para. Meio ágar tipo Endo (Endo ágar LES ou caldo Endo
várias diluições de amostra. Para detectar coliformes totais estressados em
MF): Neste procedimento, as bactérias coliformes são definidas como bactérias
água potável tratada e água clorada secundária ou terciária
que desenvolvem colônias vermelhas com brilho metálico (verde-dourado)
efluentes de tratamento de águas residuais, use um método projetado para
dentro de 24 horas a 35°C em meio tipo Endo contendo lactose.
recuperação de organismos estressados (ver Seção 9212B.1). Modificado
Alguns membros do grupo coliforme total também produzem vermelho escuro,
A técnica MF para coliformes termotolerantes em águas residuais cloradas
colônias mucóides ou nucleadas sem brilho metálico; quando
(Seção 9212) pode ser usada se 3 meses de testes paralelos
verificadas, estas são classificadas como colônias de coliformes atípicas.
com a técnica de fermentação em tubos múltiplos mostra comparabilidade para
Geralmente, colônias rosa (não mucóides), azuis, brancas ou incolores
cada tipo de amostra específico do local.
sem brilho na mídia Endo são considerados não coliformes neste
O volume padrão a ser filtrado é de 100 mL para amostras de água potável;
técnica.
isso pode ser distribuído entre vários membros, se necessário. No entanto, para
b. Meio m-ColiBlue24 com cromogênio duplo: Este diferencial
fins especiais de monitoramento
meio filtrante de membrana detecta e enumera simultaneamente
(por exemplo, solução de problemas de qualidade da água ou identificação de
tanto coliformes totais (TC) quanto Escherichia coli (E. coli) na água
rupturas de coliformes em baixas concentrações em barras de tratamento), pode
amostras em 24 h com base em suas atividades enzimáticas específicas.
ser desejável testar amostras de 1 litro. Se partículas
Bactérias coli (exceto E. coli) são definidas como aquelas que
impedir que um filtro processe uma amostra de 1 L, divida a amostra
produz colônias vermelhas em 24 horas a 35°C neste meio, o que
em quatro porções de 250 mL para análise. Contagens totais de coliformes
contém lactose e um corante não seletivo [cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazólio (TTC)].
em cada membrana para relatar o número de coliformes por litro.
E. coli distingue-se de outras bactérias da forma coli pelas colônias azuis a roxas
Amostras que não sejam de água potável devem ser analisadas usando
da ação de
vários níveis de diluição. As diluições recomendadas para medições de formas
totais de coli são apresentadas na Tabela 9222:I e para os coliformes e E. coli
mais tolerantes na Tabela 9222:IV.
*Aprovado pelo Comitê de Métodos Padrão, 2015.
Grupo de Trabalho Conjunto: Nancy H. Hall (presidente), Jennifer Best, Gil Dichter, Sandra M. Comparações estatísticas dos resultados obtidos pelo método de tubos
Kleunder, Mark W. LeChevallier, Mark Rodgers. múltiplos e pela técnica MF mostram que MF é mais preciso

https://doi.org/10.2105/SMWW.2882.193 1
Machine Translated by Google
TÉCNICA DE FILTRO DE MEMBRANA (9222)/Procedimento padrão de filtro de membrana de coliformes totais usando meio Endo
(compare as Tabelas 9221:III e IV com a Tabela 9222:III). Os dados de cada teste
produzem aproximadamente a mesma qualidade da água na formação, embora os
resultados numéricos não sejam idênticos.
3. Bibliografia
CLARK, HF, EE GELDREICH, HL JETER & PW KABLER. 1951. O filtro de membrana
em bacteriologia sanitária. Representante de Saúde do Pub 66:951.
KABLER, PW 1954. Exames de água por filtro de membrana e procedimentos MPN.
Amer. J Pub Saúde 44:379.
THOMAS, HA & RL WOODWARD. 1956. Uso de membranas filtrantes moleculares para
controle de potabilidade da água. J. Amer. Associação de Obras de Água. 48:1391.
MCCARTHY, JA, JE DELANEY & RJ GRASSO. 1961. Medindo formas de coli na
água. Obras de Esgoto de Água 108:238.
LIN, S. 1973. Avaliação do teste de coliformes para efluentes secundários clorados.
J. Poluição da Água. Controle Fed 45:498.
MANDEL, J. & LF NANNI. 1978. Avaliação de medição. No SL
Inhorn, ed. Práticas de Garantia de Qualidade para Laboratórios de Saúde, p.
209. Associação Americana de Saúde Pública, Washington, DC
BRENNER, KP, CC RANKIN, YR ROYBAL, GN STELMA, JR., PV
SCARPINO & AP DUFOUR. 1993. Novo meio para o simultâneo
9222 B. Procedimento padrão de filtro de membrana de coliformes totais usando meio Endo
Este método pode ser usado para medir coliformes totais em águas potáveis, não
potáveis e outras águas usando meios do tipo Endo.
Colônias típicas cultivadas em meios do tipo Endo podem ser posteriormente
particionadas para diferenciar coliformes termotolerantes (fecais) e E.coli usando os
métodos de particionamento em 9222G, H e I. Este método pode não ser apropriado
para amostras com alto teor de partículas que podem obstruir filtros ou amostras com
alta proporção de coliformes totais em relação a E. coli. Para medição simultânea de
coliformes totais e E.coli usando filtração por membrana, consulte os Métodos 9222J
e K.
1. Aparelho de Laboratório
Para análises de MF, utilize vidrarias e outros aparelhos compostos
de material livre de agentes que possam afetar o crescimento bacteriano.
para. Frascos de amostra: Consulte a Seção 9030B.19.
b. Frascos de diluição: Consulte a Seção 9030B.13.
c. Pipetas e cilindros graduados: Consulte a Seção 9030B.9. Antes da esterilização,
cubra frouxamente a abertura dos cilindros graduados com folha metálica ou um
substituto adequado de papel de embrulho grosso. Imediatamente após a
esterilização, proteja a tampa para evitar contaminação.
d. Recipientes para meio de cultura: Utilizar frascos de vidro borossilicato limpos.
Qualquer tamanho ou formato de frasco pode ser usado, mas frascos Erlenmeyer
com tampas de metal, tampas de folha de metal ou tampas de rosca fornecem mistura
adequada do meio interno e são convenientes para armazenamento. e. Placas de
cultura:
Utilize vidro borossilicato estéril ou placas de Petri plásticas pré-esterilizadas
descartáveis, de 15 a 60 mm, 9 a 50 mm ou outro tamanho apropriado. Embrulhe um
número conveniente de placas de cultura de vidro limpas em papel alumínio se
esterilizado por calor seco, ou papel de embrulho pesado adequado quando
esterilizado em autoclave. Incubar pratos de cultura de vidro e plástico descartáveis
com tampa solta em recipientes bem fechados para evitar a evaporação da umidade
com a secagem resultante
https://doi.org/10.2105/SMWW.2882.193
detecção de coliformes totais e Escherichia coli em água. Apl.
Meio Ambiente. Microbiol. 59:3534.
BRENNER, KP, CC RANKIN, M. SIVAGANESAN & PV SCARPINO. mil novecentos e noventa e seis.
Comparação das recuperações de Escherichia coli e formas totais de coli da
água potável pelo método de ágar MI e pelo método de filtro de membrana
aprovado pela Agência de Proteção Ambiental dos EUA. Apl. Meio Ambiente.
Microbiol. 62:203.
GRANT, MA 1997. Um novo meio de filtração por membrana para detecção e
enumeração simultânea de Escherichia coli e formas de coli totais. Apl. Meio
Ambiente. Microbiol. 63:3526.
FRANCY, DS & RA DARNER. 2000. Comparação de métodos para determinar
concentrações mineiras de Escherichia coli em águas recreativas. Água Res.
34:2770.
AGÊNCIA DE PROTEÇÃO AMBIENTAL DOS EUA. 2002. Método 1604: Total
Coliformes e Escherichia coli em Água por Filtração por Membranas Utilizando
Técnica de Detecção Simultânea (Meio MI); EPA 821-R-02-024. Desligado.
Água, Washington, DC
OLSTADT, J., JJ SHAUER, J. STANDRIDGE & S. KLUENDER. 2007. Uma
comparação de dez coliformes totais/E. testes de coli.
J Água e Saúde 05:267.
de meio e para manter um ambiente úmido para o desenvolvimento ideal da colônia.
Pratos de plástico descartáveis pré-esterilizados com tampas herméticas que
atendem às especificações acima estão disponíveis comercialmente e são amplamente
utilizados. Sele novamente os pacotes abertos de suprimentos de pratos descartáveis
para armazenamento.
F. Unidades de filtragem: O conjunto porta-filtro (construído em vidro, plástico
autoclavável, porcelana, aço inoxidável ou plástico disponível) consiste em um funil
sem costura preso a uma base por meio de um dispositivo de travamento ou força
magnética. O projeto deve permitir que o filtro de membrana seja fixado firmemente
na placa porosa do receptáculo sem danos mecânicos e permitir que todo o fluido
passe através da membrana durante a filtração. Descarte funis de plástico com riscos
profundos na superfície interna ou funis de vidro com superfícies lascadas. Substitua
telas danificadas em unidades de aço inoxidável.
Embrulhe o conjunto (como um todo ou em partes separadas) em papel de
embrulho grosso ou papel alumínio, ou coloque em sacos comerciais para chaves
automotivas; esterilizar em autoclave; e guarde até o uso. As unidades de campo
podem ser higienizadas por imersão ou pulverização com álcool e depois acesas ou
imersas em água fervente por 2 min. Use água reagente para evitar depósitos de
água dura (consulte a Seção 9020B.4d para especificações de qualidade da água de
grau reagente). Depois de submergir a unidade em água fervente, deixe esfriar até a
temperatura ambiente antes de reutilizá-la. Não acenda peças de plástico. Também
podem ser utilizadas unidades de campo estéreis e descartáveis.
Para filtração, monte o receptáculo do conjunto porta-filtro em um frasco de
filtragem de 1 L com um braço lateral ou outro dispositivo adequado (coletor para
conter três a seis conjuntos de filtros) de modo que um diferencial de pressão (34 a
51 kPa) possa ser exercido sobre a membrana do filtro. Conecte o frasco a uma linha
de vácuo, uma bomba de vácuo elétrica, uma bomba de filtro operando com pressão
de água, um aspirador manual ou outro meio de garantir um diferencial de pressão
(138 a 207 kPa). Conecte um frasco de aproximadamente
2
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TÉCNICA DE FILTRO DE MEMBRANA (9222)/Procedimento padrão de filtro de membrana de coliformes totais usando meio Endo
tem a mesma capacidade entre o frasco de filtragem e a fonte de vácuo para
reter a água residual. g.
Filtros de membrana: Use filtros de membrana com diâmetro de poro
classificado para reter completamente bactérias coliformes (geralmente 0,45
m) (para especificações adicionais, consulte a Seção 9020B.5i).
Utilize apenas membranas de filtro que tenham sido comprovadas - através
de testes de controle de qualidade (CQ) adequados e certificação do
fabricante - para exibir o seguinte: •
retenção total dos organismos a serem cultivados, •
estabilidade no uso,
• ausência de extraíveis químicos que possam inibir crescimento e
desenvolvimento bacteriano, • uma
velocidade de filtração satisfatória (dentro de 5 min), •
nenhuma influência significativa no pH do meio (acima de 0,2 unidades),
e conhecidas) para estabelecer a recuperação comparativa do lote.
• nenhum aumento no número de colónias confluentes ou espalhadores em
comparação com filtros de membrana de controlo.
Use membranas marcadas em grade para que o crescimento bacteriano
não seja inibido nem estimulado ao longo das linhas da grade quando as
membranas com bactérias presas forem incubadas em um meio adequado.
Utilize preferencialmente estoques novos de filtros de membrana e, se
necessário, armazene-os em ambiente sem extremos de temperatura e
umidade. Obtenha no máximo um suprimento para um ano de cada vez.
De preferência, utilize filtros de membrana pré-esterilizados para os quais
o fabricante tenha certificado que a técnica de esterilização não induziu
toxicidade nem alterou as propriedades químicas ou físicas da membrana.
Se as membranas forem esterilizadas em laboratório, autoclave por 10
minutos a 121–124°C e depois deixe o vapor escapar rapidamente para
minimizar a condensação nos filtros. h. Almofadas
absorventes: Utilize discos de papel filtro ou outro material que o fabricante
tenha certificado, por lote, como sendo de alta qualidade e isento de sulfito
ou outros agentes tóxicos em concentração que possa inibir o crescimento
bacteriano. Use almofadas de aproximadamente 48 mm de diâmetro e
grossas o suficiente para absorver 1,8 a 2,2 mL de meio.
Algumas almofadas podem exigir 3,0 mL de meio. Esterilize as almofadas em
envelopes kraft reutilizáveis ou separadamente em outros recipientes
adequados por 15 minutos em autoclave (ciclo seco). Seque as almofadas
para que fiquem livres de umidade visível antes de usar. Veja filtro de membrana estéril
procedimento de ização no ¶ g acima.
Ei. Pinça: Use uma pinça lisa e romba, sem ondulações nas laterais
internas das pontas. Esterilize antes de usar mergulhando em álcool etílico
ou metílico absoluto a 95% e flamejando. j. Incubadoras:
Use incubadoras para fornecer uma temperatura de 35 0,5°C. Para evitar
a secagem excessiva, mantenha um ambiente húmido para as placas
durante a incubação, utilizando uma incubadora humidificada (entre 60 e
90% de humidade relativa) ou colocando as placas num recipiente selado
com tampa hermética (ou saco selado). As placas não devem perder mais
de 15% do peso do ágar durante a incubação. k. Microscópio e fonte de luz:
Para determinar a contagem
de colônias em filtros de membrana, use uma ampliação de 10 a 15 e
uma fonte de luz fluorescente branca fria ajustada para fornecer o máximo
discernimento de brilho. O ideal é usar um microscópio binocular de
dissecação de campo amplo. Não use um microscópio com iluminador que
concentre luz de uma fonte incandescente ao discernir colônias de coliformes
em meios do tipo Endo.
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2. Materiais e Meios Culturais
Como os resultados dos testes precisam ser uniformes, use meio
desidratado comercial; nunca prepare meios a partir de ingredientes básicos
quando meios desidratados adequados estiverem disponíveis. Siga as
instruções do fabricante para reidratação. Armazene suprimentos abertos de
mídia desidratada em um dessecador (se necessário). Meios líquidos
comerciais (ampolas estéreis, etc.) podem ser usados se forem conhecidos
por fornecerem resultados equivalentes. Consulte a Seção 9020B.5j. Teste
cada novo lote médio para confirmar se o desempenho é satisfatório (ver
Seção 9020B.5j). O uso de gráficos de controle é útil para identificar
tendências e garantir consistência de longo prazo no desempenho da mídia.
A cada novo lote de meio tipo Endo, verifique no mínimo 10% de colônias de
coliformes (obtidas de amostras naturais ou amostras com adições
Antes de usar, teste cada lote de meio MF preparado em laboratório
quanto ao desempenho com controles de cultura positivos e negativos. Se o
meio preparado comercialmente não estiver disponível, prepare a partir de
componentes individuais conforme descrito nos parágrafos a e b abaixo.
para. Endo ágar LES (formulação da Estação Experimental de Lawrence):
Extracto de levedura. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1,2 g de
Casitone ou tripticase. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3,7 g de tiopeptona
ou tiotona. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3,7 g de
triptose. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7,5g de
lactose. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9,4 g de hidrogenofosfato
dipotássico (K2HPO4) . . . . . . . . . 3,3 g de dihidrogenofosfato de potássio
(KH2PO4). . . . . . . . . . 1,0 g de cloreto de sódio
(NaCl). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3,7 g de desoxicolato de
sódio. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,1 g de laurilsulfato de
sódio ......................... 0,05 g de sulfito de sódio
(Na2SO3) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1,6 g de fucsina
básica. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,8 g Agar....................................
15,0 g Água grau reagente.... . ................... 1L
CUIDADO: A fucsina básica é suspeita de ser cancerígena e
mutagênica. Evite contato com a pele, ingestão e exposição às
membranas mucosas. Siga as instruções do fabricante e da ficha de
dados de segurança (SDS).
Reidratar o produto de acordo com as instruções do fabricante ou
componentes individuais em 1 L de água contendo 20 mL de etanol a 95%.
Não use etanol desnaturado, que reduz o crescimento de fundo e o tamanho
das colônias de coliformes. Deixe quase ferver para dissolver o ágar, retire
imediatamente do fogo e deixe esfriar entre 45 e 50°C. Não esterilize em
autoclave. O pH final deve ser 7,2 0,2. Um precipitado é normal em meios do
tipo Endo. Distribua quantidades de 5 a 7 mL na seção inferior de placas de
Petri de vidro de 60 mm ou quantidades de 4 a 6 mL na seção inferior de
placas de Petri de plástico de 50 mm e deixe solidificar. Se forem utilizados
pratos de qualquer outro tamanho, ajuste a quantidade para obter uma
profundidade equivalente de 4 a 5 mm. Não exponha as placas vazadas à
luz solar direta; leve à geladeira no escuro, de preferência em sacos plásticos
lacrados ou outros recipientes para reduzir a perda de umidade. Descarte o
meio não utilizado após 2 semanas
[ou antes se houver evidência de perda de umidade, meio com contaminação,
deterioração do meio (escurecimento do meio) ou formação de brilho
superficial].
3
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TÉCNICA DE FILTRO DE MEMBRANA (9222)/Procedimento padrão de filtro de membrana de coliformes totais usando meio Endo

b. Meio m-Endo:* TABELA 9222:I. VOLUMES DE AMOSTRA SUGERIDOS PARA FILTRO DE MEMBRANA
TESTE DE COLIFORME TOTAL
Triptose ou polipeptona ......................... 10,0 g
VOLUME (X) A SER FILTRADO
Tiopeptona ou tiotona. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5,0g
M.L.
Casitone ou tripticase. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5,0g
Extracto de levedura. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1,5g FONTE DE ÁGUA 100 50 10 1 0,1 0,01 0,001 0,0001
Lactose ........................................ 12,5 g
água potável x
Cloreto de sódio (NaCl). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5,0g
Piscinas
Hidrogenofosfato dipotássico (K2HPO4) .......... 4,375 g
Poços, nascentes XXX
Dihidrogenofosfato de potássio (KH2PO4). . . . . . . . . . . 1.375g Lagos, reservatórios XXX
Lauril sulfato de sódio ............................ 0,05 g XXX
Entrada de abastecimento de água
Desoxicolato de sódio ........................... 0,10 g Praias balneares XXX
Sulfito de sódio (Na2SO3) ......................... 2,10 g água do rio XXX x
Fucsina básica ................................... 1,05 g Esgoto clorado XXX
Ágar (opcional) ................................... 15,0 g esgoto bruto XX x x

Água de grau reagente...............................1 L

CUIDADO: A fucsina básica é suspeita de ser cancerígena e mutagênica. TABELA 9222:II. NÚMEROS DE COLÔNIAS NA FAIXA IDEAL PARA

Evite contato com a pele, ingestão ou exposição a mucosas DETERMINAÇÕES QUANTITATIVAS

membranas. Siga as instruções do fabricante e da FDS.
Faixa de contagem de colônias
1) Preparação de ágar – Reidratar o produto em 1 L de água contendo 20 mL de
etanol a 95%. Não use etanol desnaturado, que Teste Mínimo Máximo
reduz o crescimento de fundo e o tamanho das colônias de coliformes. Não
Coliformes totais 20 80
esterilizar em autoclave. Aqueça até quase ferver para dissolver o ágar, Coliformes fecais 20 60
Retire imediatamente do fogo e deixe esfriar entre 45 e 50°C. 20 100
Estreptococos fecais
Distribua quantidades de 5 a 7 mL em vidro estéril de 60 mm ou 4 a Enterococos 20 60
Quantidades de 6 mL em placas de Petri plásticas de 50 mm. Se pratos de qualquer E. coli 20 80
outro tamanho for usado, ajuste a quantidade para obter uma profundidade equivalente.
O pH final deve ser 7,2 0,2. Um precipitado é normal em
Meio tipo Endo.
Leve à geladeira o meio acabado no escuro e descarte o não utilizado réplicas de volumes de amostra menores (por exemplo, duplicatas de 50 mL

ágar após 2 semanas [ou antes se houver evidência de umidade porções ou quatro réplicas de porções de 25 mL). Analise outro

perda, contaminação média, deterioração média (escurecimento águas filtrando três volumes diferentes (diluídos ou não diluídos),

do meio), ou formação de brilho superficial]. dependendo da densidade bacteriana esperada. (Ver Seção

2) Preparação do caldo – Prepare como acima, omitindo o ágar. Dispense o meio 9215B.2 para preparação de diluições.) Ao filtrar 10 mL de

líquido (pelo menos 2,0 mL por placa) em recipiente estéril amostra (diluída ou não diluída), adicione aproximadamente 10 mL de solução estéril

almofadas absorventes (ver 9222B.1h) e remova cuidadosamente o excesso água de diluição tamponada ao funil e, em seguida, adicione a amostra seguida por

meio por placa de decantação. O caldo pode ter um precipitado, mas outros 25 a 50 mL de água de diluição antes da filtração ou

isso não interfere no desempenho médio se os pads forem pipetar o volume da amostra em água de diluição estéril e depois filtrar
todo o conteúdo do frasco de diluição. Este aumento de água
certificado livre de sulfito ou outros agentes tóxicos em concentrações que
poderia inibir o crescimento bacteriano. O caldo refrigerado em frascos ou frascos volume ajuda a dispersar a suspensão bacteriana uniformemente sobre

com tampa de rosca pode ser armazenado por até 96 horas. toda a superfície filtrante efetiva.

c. Água de enxágue de diluição tamponada: Consulte a Seção 9050C.1. b. Unidades de filtração estéreis e controle de qualidade: Use unidades de filtração
estéreis no início de cada série de filtração como precaução mínima para evitar

3. Amostras contaminação acidental. Filtração

a série é interrompida quando decorre um intervalo de 30 minutos ou mais

Colete amostras conforme indicado na Seção 9060A. entre filtrações de amostras. Após tal interrupção, trate qualquer
filtração adicional de amostras como uma nova série de filtração e esterilizar todos
4.Procedimentos _ porta-filtros de membrana em uso. (Consulte 9222B.1f para esterilização
procedimentos e Seções 9020B.4l e m para limpeza UV e

para. Seleção do tamanho da amostra: O tamanho da amostra será regido por orientações de segurança.)

densidade bacteriana esperada, grau de turbidez e, se aplicável, c. Filtragem da amostra: Usando uma pinça estéril, coloque uma solução estéril

requisitos regulamentares. (Veja Tabela 9222:I para amostra sugerida filtro de membrana (lado da grade para cima) sobre a placa porosa da base.

volumes.) Coloque cuidadosamente a unidade de funil correspondente sobre a base (trave-a no lugar,

Um volume de amostra ideal renderá de 20 a 80 coliformes totais se aplicável). Misture completamente a amostra ou diluição(ões) da amostra

colônias e 200 colônias de todos os tipos (típicas, atípicas e agitando vigorosamente (por exemplo, 25 vezes para cima e para baixo em um arco de 1 pé

colônias de fundo não coliformes) em uma superfície de filtro de membrana em 7 s) para quebrar aglomerados de bactérias, o que é crucial para um

(Tabela 9222:II). Analise a água potável filtrando 100 mL ou método quantitativo microbiano. Se o frasco de amostra não tiver quantidade suficiente
headspace para uma mistura adequada, despeje a amostra em um recipiente estéril maior
recipiente para misturar adequadamente. Filtrar amostra sob vácuo parcial
* Caldo Difco m-Endo desidratado MF (nº 274920), ou equivalente. (pressão comumente usada: 81 kPa, 24 pol. Hg ou 79% de vácuo).

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TÉCNICA DE FILTRO DE MEMBRANA (9222)/Procedimento padrão de filtro de membrana de coliformes totais usando meio Endo
Com o filtro ainda no lugar, enxágue a superfície interna do funil filtrando três porções
de 20 a 30 mL de água de diluição tamponada estéril de um frasco squeeze (ou outro
dispositivo apropriado). Isto só é satisfatório se o frasco squeeze e o seu conteúdo não
ficarem contaminados durante a utilização. Não reutilize garrafas de água de diluição
parcialmente cheias. O enxágue entre as amostras evita a contaminação.
Quando o enxágue e a filtração finais estiverem concluídos, use uma técnica asséptica
para desengatar o vácuo, destravar e remover o funil, remover imediatamente o filtro de
membrana com uma pinça estéril e rolar o filtro no meio selecionado para evitar a retenção
de ar. A colocação incorreta do filtro é instantaneamente óbvia porque manchas de
membrana sem manchas indicam ar preso. Se tais manchas ocorrerem, reinicie
cuidadosamente o filtro na superfície do ágar. Coloque apenas um filtro de membrana
por prato. Inverta a placa e incube a 35-0,5°C durante 22 a 24 h para m-Endo LES ou m-
Endo MF. Opcionalmente, para higienizar os funis entre as amostras após a remoção do
filtro, exponha todas as superfícies do conjunto previamente limpo e esterilizado à radiação
UV durante 2 minutos antes de reutilizar as unidades para filtrações sucessivas.
Se estiver usando caldo, coloque assepticamente uma almofada estéril no prato de
cultura, sature-a com pelo menos 2,0 a 3,0 mL de meio (dependendo do fabricante da
almofada) e remova cuidadosamente o excesso de meio decantando-o suavemente do
prato para uma toalha felpuda descartável ou vazia. prato. Coloque o filtro de amostra
diretamente na almofada, inverta o prato e incube conforme especificado acima. Se forem
usados pratos com tampa solta, coloque-os em uma câmara úmida (ou incubadora
umidificada).
A diferenciação de algumas colónias pode ser perdida se as culturas forem incubadas
24 horas.
Para amostras de água não potável, os funis devem ser enxaguados ou higienizados
com UV após a remoção do filtro ou após cada amostra (conforme descrito acima) devido
ao elevado número de bactérias coliformes e flora de fundo presentes nestas amostras.
d. Amostras de CQ: Verifique a esterilidade e a contaminação por coliformes no início
e no final de cada série de filtração, respectivamente, filtrando 20 a 30 mL de diluição ou
enxaguando a água através do filtro (um funil por lote de esterilização). Se os controles
indicarem contaminação, rejeite todos os dados das amostras afetadas e solicite novas
amostras. Além disso, para verificar possível contaminação cruzada ou água de enxágue
contaminada, insira uma amostra de água de enxágue estéril (100 mL) após filtração de
10 amostras. Incubar estas amostras de CQ nas mesmas condições que as amostras que
estão sendo analisadas. e. Técnica alternativa de enriquecimento: Use esta técnica
somente com mídia m-Endo LES. Coloque uma almofada absorvente estéril na tampa
de uma
placa de cultura estéril e pipete pelo menos 2,0 mL de caldo lauril triptose (preparado
conforme indicado na Seção 9221B.3a) para saturar a almofada.
Remova cuidadosamente qualquer excesso de líquido da almofada absorvente decantando
a placa. Coloque assepticamente o filtro – através do qual a amostra foi passada – na
almofada. Incubar o filtro, sem inverter o prato, durante 1,5 a 2 horas a 35 0,5°C numa
atmosfera com pelo menos 60% de humidade relativa.
Remova a cultura de enriquecimento da incubadora, levante o filtro da almofada de
enriquecimento e role-o sobre a superfície do ágar m-Endo LES, que foi deixada equilibrar
à temperatura ambiente.
A colocação incorreta do filtro é instantaneamente óbvia porque manchas de membrana
sem manchas indicam ar preso. Se tais manchas ocorrerem, reinicie cuidadosamente o
filtro na superfície do ágar. Se for utilizado meio caldo, prepare a cultura final removendo
a cultura de enriquecimento da incubadora e separando as metades do prato. Coloque
uma almofada estéril nova no fundo do prato, sature com pelo menos 2,0 mL de meio m-
Endo,
https://doi.org/10.2105/SMWW.2882.193
e remova cuidadosamente o excesso de líquido da almofada absorvente inclinando a
placa. Transfira o filtro, com as mesmas precauções acima, para uma nova almofada.
Descarte a almofada de enriquecimento usada.
Com ágar ou meio de caldo e usando este procedimento de duas etapas, inverta a
placa e incube por 22 2 horas a 35 0,5°C.
Prossiga para ¶ f abaixo. F.
Contagem: Para contar unidades formadoras de colônias (UFC) em filtros de
membrana do tipo Endo, use um microscópio binocular de dissecação de campo amplo
de baixa potência (ampliação de 10 a 15) ou outro dispositivo óptico, com uma fonte de
luz fluorescente branca fria direcionada para fornecer visualização de brilho. O ângulo de
luz na colônia afeta a detecção de brilho para colônias de coliformes que crescem em
placas m-Endo. Balançar e girar a placa de Petri reflete a luz em diferentes ângulos e
ajuda a detectar o brilho da colônia. A colônia coliforme típica em meios do tipo Endo tem
uma cor rosa a vermelho escuro com um brilho superficial metálico. Contar colónias de
coliformes típicas e atípicas imediatamente após a incubação. A área de brilho pode variar
em tamanho, desde uma pequena cabeça de alfinete até a cobertura completa da
superfície da colônia. As colônias de coliformes atípicas podem ser vermelho-escuras,
mucóides ou nucleadas sem brilho. Geralmente colônias rosadas, azuis, brancas ou
incolores sem brilho apresentam não coliformes sideradas. Uma contagem elevada de
colônias não coliformes (200 UFC) pode interferir no desenvolvimento máximo de
coliformes. A refrigeração de culturas com altas densidades de colônias de forma de não
coli (após a incubação) por 0,5 a 1 h antes da contagem pode ajudar no discernimento do
brilho. Amostras de água desinfetada ou efluentes de águas residuais podem incluir
organismos estressados que crescem relativamente lentamente e produzem brilho
máximo em 22 a 24 horas.
g. Verificação de coliformes: Ocasionalmente, em meios do tipo Endo, organismos não
coliformes podem produzir colônias com brilho típico, e colônias atípicas (colônias rosa,
vermelhas escuras ou nucleadas sem brilho) podem ser coliformes; portanto, recomenda-
se a verificação de todos os tipos de colônias típicas e atípicas. Verifique todas as colônias
na mídia Endo esfregando toda a membrana ou coletando pelo menos cinco colônias
típicas e cinco colônias atípicas de uma determinada cultura de filtro de membrana.
(Consulte a Seção 9020B.9.) Com base na necessidade e no tipo de amostra, os
laboratórios podem incorporar medidas de CQ mais rigorosas (por exemplo, para amostras
não potáveis, verificar pelo menos uma colônia de cada tipo de colônia típica ou atípica
de uma determinada cultura de filtro de membrana, ou verificar 10% de amostras positivas).
Ajuste as contagens com base nos resultados da verificação. Os testes de verificação
estão listados abaixo.
1) Fermentação de lactose – Transfira o crescimento de cada colônia ou limpe toda a
membrana com um cotonete estéril (para resultados de presença-ausência) e coloque em
caldo de lauril triptose de concentração única; incubar o caldo a 35 0,5°C por até 48 h. O
gás formado em caldo lauril triptose e confirmado em caldo de lactose verde brilhante em
48 horas verifica a colônia como coliforme. (Consulte as Seções 9221B.3 e 4 para
preparação de meios.) A inoculação simultânea de ambos os meios é aceitável (se estiver
usando a mesma alça estéril de inoculação, agulha ou bastão de madeira, inocule primeiro
o caldo de lauril triptose). A inclusão da inoculação em caldo CE incubado a 44,5 ± 0,2°C
por 24 horas fornecerá informações sobre a presença de coliformes termotolerantes. A
inclusão da inoculação EC-MUG incubada a 44,5 ± 0,2°C durante 24 horas fornecerá
informações sobre a presença de E. coli. A ordem de inoculação deve ser sempre da
menos para a mais inibitória [1) CE ou CE-MUG, 2) caldo lauril triptose, 3) caldo lactose
verde brilhante]. (Consulte 9222G e H para procedimentos de partição MF.)
5
Machine Translated by Google
TÉCNICA DE FILTRO DE MEMBRANA (9222)/Procedimento padrão de filtro de membrana de coliformes totais usando meio Endo
2) Verificações alternativas de coliformes — Aplique este procedimento alternativo
de verificação de coliformes para isolar colônias no meio filtrante de membrana
Endo. Se houver suspeita de uma cultura mista ou se a separação das colônias for
de 2 mm, semeie o crescimento em meio m-Endo ou ágar MacConkey para garantir
a pureza da cultura ou submeta o crescimento misto ao método do tubo de
fermentação.
a) Teste rápido – Uma verificação rápida de colônias utiliza reações de teste
para citocromo oxidase (CO) e -galactosidase. As reações em forma de Coli são
negativas para CO e positivas para -galactosidase dentro de 4 horas de incubação
da cultura em tubo ou procedimento de microteste (spot).
b) Sistemas multiteste comerciais - Verifique e/ou identifique as bactérias
coliformes selecionando uma colônia bem isolada, espalhando para isolamento e
inoculando uma colônia pura em um sistema de identificação multiteste para
Enterobacteriaceae que inclui fermentação de lactose e/ou - reações de teste de
galactosidase e CO.
5. Cálculo da Densidade de Coliformes
Selecione a(s) membrana(s) com número aceitável de colônias
(Tabela 9222:II) e 200 unidades formadoras de colônias (UFC) de todos os tipos por
membrana, pela seguinte equação:
Coliformes (Totais), Nº/100 mL
colônias de coliformes contadas 100
Nº UFC/100 mL
mL amostra filtrada
Para amostras de água potável, se não forem observadas colônias de coliformes
totais, relate o total de colônias de coliformes contadas como “1 UFC/100 mL” ou
relate “bactérias coliformes totais ausentes por amostra de 100 mL”.
Para amostras de água não potável, se porções de 10,0, 0,1 e 0,01 mL forem
examinadas e todas as contagens forem 0, calcule o número de coliformes por 100
mL que teria sido relatado se houvesse 1 UFC no filtro representando o maior
volume de filtração. Por exemplo, relate 10 UFC/100 mL para um volume de amostra
de 10 mL sem colônias de coliformes, ou seja,
1/10 100 10 UFC/100 mL
Para contagens verificadas de coliformes, ajuste a contagem inicial com base na
porcentagem de verificação positiva (típica e atípica) e relate da seguinte forma:
Coliformes (totais) verificados, Nº/100 mL
número de colônias verificadas
número total de colônias de coliformes
sujeito a verificação
número total de colônias presumíveis
para. Água potável: Em sua Regra de Coliformes Totais, a Agência de Proteção
Ambiental dos EUA (EPA) exige apenas um registro da presença ou ausência de
coliformes totais em amostras de 100 mL de água potável; No entanto, as
informações quantitativas podem indicar a magnitude de um evento contaminante e/
ou o progresso da remediação, especialmente ao comparar resultados de amostras
de locais diferentes (por exemplo, amostras repetidas). A informação quantitativa
apenas fornece uma
https://doi.org/10.2105/SMWW.2882.193
estimativa bruta da população real de coliformes no momento da coleta devido à
distribuição não uniforme dentro da matriz.
Em água potável de boa qualidade, a ocorrência de coliformes geralmente será
mínima. Portanto, conte todas as colônias de coliformes (desconsiderando o limite
inferior de 20 citado acima) e utilize a fórmula fornecida acima para obter a densidade
de coliformes.
Se ocorrer crescimento confluente – cobrindo toda a área de filtração da
membrana ou uma parte dela com colônias que não são discretas – relate os
resultados como “crescimento confluente com (ou sem) coliformes”. Se o número
total de colônias bacterianas – coliformes mais não coliformes – for 200 por
membrana ou se as colônias não forem distintas o suficiente para serem contadas
com precisão, então relate os resultados como “numerosos demais para
contar” (TNTC) ou “confluentes”, respectivamente. Para amostras de água potável
utilizando meios do tipo Endo, a presença de coliformes nessas culturas pode ser
confirmada (ver 9222B.4g). Como alternativa, escove toda a superfície do filtro com
uma alça estéril, bastão aplicador ou cotonete e inocule esse crescimento em 1) um
tubo de lauril triptose de concentração única e 2) um tubo de caldo de bile de lactose
verde brilhante. Se o tubo do caldo biliar verde brilhante produzir gás dentro de 48
horas a 35 0,5°C, haverá coliformes presentes. Para cumprir a regra de coliformes
totais da EPA, relate crescimento confluente ou TNTC com pelo menos uma colônia
de coliformes detectáveis (verificação necessária apenas com meios do tipo Endo)
como uma “amostra positiva para coliformes totais”. Relate crescimento confluente
ou TNTC sem coliformes detectáveis como “inválido”.
Para amostras inválidas, solicite uma nova amostra no mesmo local em até 24
horas. Selecione volumes mais adequados para filtrar por membrana (lembrando
que a porção padrão de água potável é de 100 mL, conforme regra). Portanto, em
vez de filtrar 100 mL através de uma membrana, filtre porções de 50 mL através de
duas membranas, porções de 25 mL através de quatro membranas separadas, etc.
para reduzir a interferência devido à superlotação. Se alguma membrana contiver
uma colônia de coliformes totais verificada, relate toda a amostra como “coliformes
totais positivas”. Se for desejada uma determinação de densidade, totalize as
contagens de coliformes observadas em todas as membranas e relate como
“[número] por 100 mL”. (Como alternativa, escolha outro método de coliformes que
esteja menos sujeito a interferências bacterianas heterotróficas.) b. Outras águas:
Tal como acontece com as amostras de água potável, se nenhum filtro tiver uma
contagem de coliformes dentro da faixa ideal,
totalize as contagens de coliformes em todos os filtros e relate como “[número]
por 100 mL”. Por exemplo, se porções duplicadas de 50 mL foram examinadas e as
duas membranas tinham cinco e três colônias de coliformes, respectivamente, então
relate a contagem total de coliformes como 8 UFC por 100 mL:
53 100
8 UFC/100 mL
50 50
Alternativamente, se porções de 50, 25 e 10 mL foram examinadas e as contagens
foram de 15, 6 e 1 colônia de coliformes, respectivamente, então calcule com base
no valor mais próximo do aceitável e relate a contagem total de coliformes com uma
observação qualificadora como “estimado em 30 UFC/100 mL”:
quinze 100
estimado em 30 UFC/100 mL
cinquenta
Por outro lado, se porções de 10, 1,0 e 0,1 mL fossem examinadas com contagens
de 40, 9 e 1 colônias de coliformes,
6
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TÉCNICA DE FILTRO DE MEMBRANA (9222)/Procedimento padrão de filtro de membrana de coliformes totais usando meio Endo

TABELA 9222:III. LIMITES DE CONFIANÇA PARA COLIFORM DE FILTRO DE MEMBRANA aquele indicador com o menor volume de filtração e relatório de resultado
RESULTADOS USANDO AMOSTRA DE 100 ML como 800.000 UFC/100 mL (para coliformes totais):

Limites de confiança de 95%

Número de Coliformes 80 100
800.000 UFC/100 mL
Colônias contadas Mais baixo Superior 0,01

0 0,0 3.7
0,1 5.6 c. Confiabilidade estatística dos resultados do filtro de membrana: Embora
1 0,2 7.2 Os resultados de MF são considerados mais precisos do que a maioria dos tubos múltiplos
2 0,6 8.8 resultados de número provável (MPN) (tubos múltiplos de 5 e 10 tubos
3 1,0 10.2 formatos de fermentação), as contagens de membrana podem subestimar o
4 1,6 11.7 número de bactérias coliformes viáveis e as circunstâncias podem afetar
5 2,2 13.1 esta precisão (bactérias de fundo e níveis de diluição, amostra
6 2,8 14.4
tipos, etc.). A Tabela 9222:III ilustra cerca de 95% de confiança
7 3,4 15,8
limites para resultados de MF. Esses valores são baseados na suposição
8 4,0 17.1
que as bactérias são distribuídas aleatoriamente e seguem um Poisson
9 4,7 18.4
distribuição.
10 5,4 19,7
11 6,2 21,0 d. Precisão dos resultados de MF: Calcule a precisão da réplica
12 6,9 22.3 análises para cada tipo de amostra examinada e método utilizado se
13 7,7 23,5 há amostra suficiente disponível para replicar análises (beber
14 8,4 24,8 água, água ambiente, etc.). (Consulte a Seção 9020B.9e.)
15 9,2 26,0
16 9,9 27.2 6. Bibliografia
17 10,7 28,4
18 11,5 29,6 FIFIELD, CW e CP SCHAUFUS. 1958. Meio filtrante de membrana aprimorado para
19 20 12,2 30,8 detecção de organismos coliformes. J. Amer. Sistema hidráulico
Assoc. 50:193.
MCCARTHY, JA e JE DELANEY. 1958. Estudos de meios filtrantes de membrana.
Obras de Esgoto de Água 105:292.
respectivamente, então calcule a densidade de coliformes com base apenas em RHINES, CE & WP CHEEVERS. 1965. Descontaminação de membrana
a porção de 10 mL porque este filtro tinha uma contagem de coliformes dentro porta-filtros por luz ultravioleta. J. Amer. Associação de Obras de Água.
faixa aceitável (ver Tabela 9222:II) e relatar o resultado como 57:500.
400 UFC/100 mL: GELDREICH, EE, HL JETER & JA WINTER. 1967. Considerações técnicas na
aplicação do procedimento de filtro de membrana. Laboratório de Saúde. Sci.
4:113.
40 100
400 coliformes/100 mL WATLING, RH & RJ WATLING. 1975. Nota sobre o conteúdo de vestígios de metais
10 de filtros de membrana. Água SA 1:28.

GELDREICH, EE 1976. Variabilidade de desempenho do filtro de membrana pro

Neste último exemplo, se a membrana com 40 colônias de coliformes ceder. Laboratório de Saúde Pub 34:100.
também tivesse uma contagem total de colônias bacterianas de 200, então relate o LIN, SD 1976. Avaliação de filtros de membrana Millipore HA e HC para
contagem de coliformes como 400 UFC/100 mL ou com qualificação a enumeração de bactérias indicadoras. Apl. Meio Ambiente. Microbiol.
observação como “estimativa de 400 UFC/100 mL”. 32:300.

Se porções de 10,0, 1,0 e 0,1 mL fossem examinadas com contagens STANDRIDGE, JH 1976. Comparação da morfologia dos poros superficiais de dois

de TNTC, 150 e 92 colônias de coliformes, respectivamente, então marcas de filtros de membrana. Apl. Meio Ambiente. Microbiol. 31:316.
AGÊNCIA DE PROTEÇÃO AMBIENTAL DOS EUA . 1978. Métodos Microbiológicos para
calcular com base no valor mais próximo do aceitável e relatar
Monitoramento do Meio Ambiente Água e Resíduos; EPA 600/
com uma observação qualificativa como “estimativa de 92.000 UFC/100 mL”:
8-78-017. Desligado. Res. Develop., Cincinnati, Ohio.
GRABOW, WOK & M. DU PREEZ. 1979. Comparação de m-Endo
92 100 Meios LES, MacConkey e Teepol para filtração por membrana
estimado em 92.000 UFC/100 mL
0,1 contagem de bactérias coliformes totais na água. Apl. Meio Ambiente.
Microbiol. 38:351.
DUTKA, BD, ed. 1981. Aplicações e técnicas de filtração por membrana
Se porções de 1,0, 0,3, 0,1 e 0,03 mL fossem examinadas com
e Problemas. Marcel Dekker, Inc., Nova York, NY
contagens de colônias de coliformes TNTC, TNTC, 78 e 21, respectivamente,
EVANS, TM, RJ SEIDLER & MW LECHEVALLIER. 1981. Impacto de
e então somar as contagens totais de coliformes nas duas últimas
meios de verificação e reanimação na precisão da membrana
filtros contáveis e dividir pela soma de seus volumes para obter
filtrar técnica de enumeração de coliformes totais. Apl. Meio Ambiente. Microbiol.
o valor final relatado de 76.000 UFC/100 mL: 41:1144.
FRANZBLAU, SG, BJ HINNEBUSCH, TM KELLEY & NA SINCLAIR. 1984.

78 21 100 Efeito dos não coliformes na detecção de coliformes em águas subterrâneas

76.000 UFC/100 mL
0,1 0,03
Se porções de 1,0, 0,3 e 0,01 mL foram examinadas com contagens
de TNTC em todas as porções e, em seguida, calcule usando o valor máximo
número de colônias aceitáveis para determinação quantitativa de
potáveis: melhor recuperação com uma técnica de filtro de membrana anaeróbica.
Apl. Meio Ambiente. Microbiol. 48:142.
MCFETERS, GA, JS KIPPIN & MW LECHEVALLIER. 1986. Ferido
coliformes na água potável. Apl. Meio Ambiente. Microbiol. 51:1.
BRENNER, KP, CC RANKIN, YR ROYBAL, GN STELMA, JR., PV
SCARPINO & AP DUFOUR. 1993. Novo meio para o simultâneo

https://doi.org/10.2105/SMWW.2882.193 7
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TÉCNICA DE FILTRO DE MEMBRANA (9222)/Procedimento de Coliformes Totais de Incubação Retardada
detecção de coliformes totais e Escherichia coli em água. Apl.
Meio Ambiente. Microbiol. 59:3534.
BRENNER, KP, CC RANKIN, M. SIVAGANESAN & PV SCARPINO. mil novecentos e noventa e seis.
Comparação das recuperações de Escherichia coli e formas totais de coli da
água potável pelo método de ágar MI e pelo método de filtro de membrana
aprovado pela Agência de Proteção Ambiental dos EUA. Apl. Microbiol
Ambiental. 62:203.
9222 C. Procedimento de Coliformes Totais com Incubação Retardada
Esta modificação da técnica padrão de MF permite o envio ou transporte da
membrana após filtração para um laboratório distante para transferência para
outro substrato, incubação e conclusão do teste. O teste de incubação retardada
pode ser utilizado quando • os procedimentos convencionais são
impraticáveis; • a temperatura desejada da amostra
não pode ser mantida durante
transporte;
• o tempo decorrido entre a coleta e análise da amostra
excederia o prazo aprovado; ou
• o local de amostragem é remoto dos serviços de laboratório
(ver Seção 9060B).
Estudos independentes utilizando amostras de água doce e marinha
mostraram resultados consistentes entre a incubação retardada e os testes
padrão de MF. Determine a aplicabilidade do teste de incubação retardada para
uma fonte de água específica comparando com os resultados dos métodos
convencionais de MF.
Para realizar o teste de incubação retardada, filtre a amostra no campo
imediatamente após a coleta, coloque o filtro no meio de transporte e envie-a ao
laboratório. Determinação completa de coliformes em laboratório transferindo a
membrana para meio padrão m-Endo ou Endo LES, incubando a 35 0,5°C por 20
a 22 horas e contando as colônias de coliformes típicas e atípicas que se
desenvolvem. Para amostras de água potável coletadas para conformidade com
a Regra de Coliformes Totais da EPA, relate a presença ou ausência de
coliformes verificados em amostras de 100 mL. Verifique as colônias conforme
descrito anteriormente em 9222B.4g.
Os meios de transporte são projetados para manter a viabilidade dos
organismos coliformes e geralmente não permitem o crescimento visível durante
o tempo de trânsito. Agentes bacteriostáticos em meios de retenção/conservação
suprimem o crescimento de microorganismos no caminho, mas permitem o
crescimento normal de coliformes após a transferência para um meio fresco.
O teste de incubação retardada segue os métodos descritos para o
procedimento de MF de coliformes totais, exceto conforme indicado abaixo. São
apresentados dois métodos alternativos: um utilizando o meio conservante m-
Endo e outro utilizando o meio de retenção m-ST. Se o meio preparado
comercialmente estiver disponível, prepare a partir de componentes individuais
conforme descrito em 9222B.2a e 9222C.2b.
1. Aparelho de Laboratório
para. Placas de cultura: Use placas de Petri plásticas descartáveis e estéreis
(9 50 mm) com tampas bem ajustadas. Esses contêineres são leves e menos
propensos a quebrar durante o transporte. Em caso de emergência ou quando
não houver placas de plástico disponíveis, utilize placas de Petri de vidro estéreis
embrulhadas em filme plástico ou material semelhante. (Ver 9222B.1e.)
https://doi.org/10.2105/SMWW.2882.193
AGÊNCIA DE PROTEÇÃO AMBIENTAL DOS EUA . 2002. Método 1604: Coliformes
totais e Escherichia coli em água por filtração por membrana utilizando técnica
de detecção simultânea (meio MI); EPA 821-R-02-024. Desligado. Água,
Washington, DC
AGÊNCIA DE PROTEÇÃO AMBIENTAL DOS EUA . 2013. Regulamentos Nacionais
de Água Potável Primária; Revisões da Regra dos Coliformes Totais; Regra
final. 40 CFR Partes 141 e 142; Reg. Fed 78:10270.
b. Unidades de filtragem de campo: Consulte 9222B.1f. A desinfecção por luz
ultravioleta pode ser usada em campo se uma fonte de energia apropriada estiver
disponível (115 V, 60 Hz). Unidades de filtração de vidro ou metal podem ser
esterilizadas por imersão em água fervente por 2 min. Utilize água reagente para
evitar depósitos de água dura. Use um aspirador manual para obter o vácuo
necessário. c. Almofadas
absorventes: Consulte 9222B.1h. d.
Fórceps: Consulte 9222B.1i.
2. Materiais e meios de transporte
para. Métodos m-Endo:
1) Meio conservante m-Endo – Prepare o meio m-Endo conforme descrito em
9222B.2b. Após resfriamento a 45°C, adicione assepticamente 3,84 g de
benzoato de sódio [grau US Pharmacopeia (USP)]/L ou 3,2 mL de solução
de benzoato de sódio a 12% a 100 mL de meio. Misture os ingredientes e
leve à geladeira os pratos derramados. Descarte o meio não utilizado após
96 h.
2) Solução de benzoato de sódio – Dissolva 12 g de NaC7H5O2 em água
reagente suficiente para perfazer 100 mL. Esterilize por autoclave ou
filtrando através de um filtro de membrana com tamanho de poro de 0,22
m. Descarte após 6 meses.
3) Cicloheximida*—Opcionalmente, adicione cicloheximida ao meio
conservante m Endo. Pode ser usado para amostras que anteriormente
apresentaram crescimento excessivo de fungos, incluindo leveduras.
Prepare adicionando assepticamente 50 mg de cicloheximida/100 mL ao
meio conservante m-Endo. Armazene a solução medida de ciclohexi na
geladeira e descarte após 6 meses.
CUIDADO: A cicloheximida é um poderoso irritante para a pele.
Siga as instruções do fabricante e da FDS para o manuseio e
armazenamento adequados deste produto
químico. b. Método m-ST:
Meio de retenção m-ST:
Fosfato de sódio monobásico (NaH2PO4 H2O). . . . . . 0,1 g de
hidrogenofosfato dipotássico (K2HPO4) . . . . . . . . . . 3,0 g de
sulfanilamida. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1,5 g de etanol
(95%). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 mL de Tris (hidroximetil)
aminometano. . . . . . . . . . . . . . . . . 3,0 g de água de grau
reagente................................ 1 L
Dissolva os ingredientes reidratando em água. Esterilizar por
autoclavagem a 121–124°C por 15 min. O pH final deve ser 8,6
* Actidione®, fabricado pela Upjohn Company, Kalamazoo, MI, ou equivalente
encorajado
8
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TÉCNICA DE FILTRO DE MEMBRANA (9222)/Procedimento de filtro de membrana de coliformes termotolerantes (fecais)
0,2. Distribua pelo menos 2,0 a 3,0 mL (dependendo do fabricante da almofada)
em placas de cultura plásticas com tampa hermética contendo uma almofada
absorvente e remova cuidadosamente o excesso de líquido da almofada
decantando a placa. Guarde os pratos na geladeira para uso em 96 horas.
3. Procedimento
para. Preservação e envio da amostra: Coloque a almofada absorvente no
fundo da placa de Petri estéril e sature com meio de retenção de coliformes
selecionado (ver 9222C.2). Remova o filtro de membrana da unidade de filtração
com uma pinça estéril e role-o, com a grade voltada para cima, sobre a superfície
da almofada saturada com meio. Proteja a membrana da perda de umidade
fechando bem a placa de Petri de plástico. Sele pratos soltos com uma fita de
vedação apropriada† para evitar a desidratação da membrana durante o
transporte. Coloque a placa de cultura contendo a membrana em um recipiente
apropriado e envie ao laboratório para conclusão do teste. A amostra pode ser
mantida sem crescimento visível durante um máximo de 72 horas à temperatura
ambiente no meio de retenção/conservante. Ocasionalmente, o crescimento
visível começa no meio de transporte quando altas temperaturas são
encontradas durante o transporte.
† Parafilm, Sigma-Aldrich Co. LLC ou equivalente.
9222 D. Procedimento de filtro de membrana de coliformes termotolerantes (fecais)
As densidades bacterianas coliformes termotolerantes (anteriormente fecais)
podem ser determinadas por procedimento de tubos múltiplos ou pela técnica
de MF. (Consulte a Seção 9225 para diferenciação de Escherichia coli.) O
procedimento termotolerante de coliformes MF utiliza um meio enriquecido com
lactose e uma temperatura de incubação de 44,5 ± 0,2°C para seletividade.
Como a temperatura de incubação é crítica, mergulhe as culturas MF
impermeabilizadas (invólucros de saco plástico) em banho-maria para incubação
em temperatura elevada ou use um dissipador de calor sólido apropriado ou
outra incubadora que esteja documentada para manter a temperatura em 44,5°C
0,2°C por toda a câmara durante um período de 24 horas. O melhor tipo de
incubadora é um banho-maria circulante coberto por empena. Em geral, este
método é aplicável nas mesmas circunstâncias que os procedimentos de
coliformes termotolerantes de tubos múltiplos (ver Seção 9221E).
Existem limitações para a interpretação de coliformes termotolerantes
resultantes de águas termais (por exemplo, dos trópicos) e de amostras de
efluentes de fábricas de papel e celulose onde predominaram Klebsiella
termotolerantes e não foram indicativas de uma fonte de esgoto.
Tal como acontece com todos os resultados de coliformes, uma pesquisa
sanitária deve ser realizada para identificar a fonte mais plausível e a
interpretação do risco à saúde pública.
1. Aparelho de Laboratório
para. Frascos de amostra: Consulte a Seção
9030B.19. b. Frascos de diluição: Consulte a Seção
9030B.13. c. Pipetas e cilindros graduados: Consulte a Seção 9030B.9.
d. Recipientes para meio de cultura: Ver 9222B.1d.
https://doi.org/10.2105/SMWW.2882.193
b. Transferência e incubação: No laboratório, transfira o filtro do meio de
retenção no qual foi enviado para uma segunda placa de Petri estéril contendo
meio m-Endo ou Endo LES e incube a 35 ± 0,5°C por 20 a 22 horas.
4. Estimativa da Densidade de Coliformes
Proceda conforme descrito em 9222B.5. Registre os tempos de coleta,
filtração e exame laboratorial e calcule o tempo decorrido. Relate o tempo
decorrido com resultados de coliformes.
5. Bibliografia
GELDREICH, EE, PW KABLER, HL JETER e HF CLARK. 1955. Um teste de filtro
de membrana de incubação retardada para bactérias coliformes em água.
Amer. J Pub Saúde 45:1462.
PANEZAI, AK, TJ MACKLIN & HG COLES. 1965. Coli-aerogenes e Escherichia coli
contam com amostras de água por meio de membranas transportadas.
Processo. Soc. Tratamento de água. Exame 14:179.
BREZENSKI, FT & JA WINTER. 1969. Uso do teste de filtro de membrana de
incubação retardada para determinação de bactérias coliformes na água do mar.
Água Res. 3:583.
CHEN, M. & PJ HICKEY. 1986. Eliminação do crescimento excessivo em teste de
filtro de membrana de incubação retardada para coliformes totais por meio de
retenção M-ST. Apl. Meio Ambiente. Microbiol. 52:778.
e. Pratos de cultura: Pratos de plástico bem ajustados (ver 9222B.1e) são
preferidos quando as placas de cultura MF serão submersas em banho-maria
durante a incubação. Coloque placas de cultura de coliformes termotolerantes
em sacos plásticos (remova o máximo de ar possível) ou sele os pratos
individuais com fita impermeável (congelador) para evitar vazamentos durante
a submersão. F. Unidades de
filtragem: Consulte 9222B.1f. g. Filtros de
membrana: Consulte 9222B.1g. h. Almofadas
absorventes: Consulte 9222B.1h. Ei.
Fórceps: Consulte 9222B.1i. j.
Banho-maria ou incubadora: A especificidade do teste termotolerante de
coliformes está diretamente relacionada à temperatura de incubação.
Para atender à necessidade de maior controle de temperatura, use um banho-
maria coberto por duas águas, uma incubadora com dissipador de calor ou
qualquer incubadora devidamente sinalizada e construída que possa manter
uma tolerância de temperatura de 0,2°C. A maioria dos banhos-maria circulantes
equipados com topo de empena para reduzir a perda de água e calor podem
manter uma temperatura de 44,5-0,2°C. No entanto, a incubação de ar estático
pode ser um problema em alguns tipos de incubadoras devido à potencial
camada de calor na câmara, à transferência mais lenta de calor do ar para o
meio e à recuperação lenta da temperatura cada vez que a incubadora é aberta
durante as operações diárias.
2. Materiais e Meio de Cultura
Meio mFC: A necessidade de uniformidade determina o uso de meio
desidratado. Nunca prepare meios a partir de ingredientes básicos quando
meios desidratados adequados estiverem disponíveis. Siga as instruções do
fabricante para reidratação. Meio líquido comercial
9
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TÉCNICA DE FILTRO DE MEMBRANA (9222)/Procedimento de filtro de membrana de coliformes termotolerantes (fecais)
(ampola estéril, etc.) pode ser usada se for conhecida por fornecer equivalente
resultados. Consulte a Seção 9020 para especificações de CQ. Se comercialmente
o meio preparado não estiver disponível, prepare a partir de componentes
individuais conforme descrito abaixo.
meio mFC:
Triptose ou biosato................................ 10,0 g
Peptona proteose nº 3 ou polipeptona. . . . . . . . . . . . . . . . 5,0g
Extracto de levedura. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3,0g
Cloreto de sódio (NaCl). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5,0g
Lactose ........................................... 12,5 g
Sais biliares nº 3 ou mistura de sais biliares. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1,5g
Azul anilina. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,1g
Ágar (opcional) ................................... 15,0 g
Água de grau reagente................................ 1 L
Reidratar o produto ou componentes individuais em 1 L de água
contendo 10 mL de ácido rosólico a 1% em NaOH 0,2N.* Aquecer até próximo
fervendo, retire imediatamente do fogo e deixe esfriar a 50°C. Não
esterilizar em autoclave. Se for usado ágar, distribua 4 a 6 mL
quantidades para placas de Petri de 9 a 50 mm (aproximadamente 4 a 5 mm
profundo) e deixe solidificar. O pH final deve ser 7,4 0,2. Refrigerar
meio acabado (de preferência em sacos plásticos selados ou outros
recipientes para reduzir a perda de umidade) e descarte o caldo não utilizado
após 96 horas ou ágar não utilizado após 2 semanas. NOTA: Para amostras de
fontes conhecidas por terem crescimento mínimo de fundo (por exemplo, água
potável), a adição de 1% de ácido rosólico pode ser omitida do mFC
médio, mas deve ser usado para todas as fontes desconhecidas, águas
pluviais e fontes de água ambiente.
Antes de usar, teste cada lote de meio MF preparado em laboratório
para desempenho com controles de cultura positivos e negativos (ver
Tabela 9020:VI). Verifique a contaminação por coliformes no início e no final
de cada série de filtração, filtrando 20 a 30 mL de
diluição ou enxágue a água através do filtro. Se os controles indicarem
contaminação, rejeite todos os dados das amostras afetadas e solicite novos
amostras. Teste cada novo lote médio para confirmar se seu desempenho é
satisfatório (ver Seção 9020B.5j). O uso do controle
Os gráficos são úteis para identificar tendências e garantir consistência a longo prazo no
desempenho dos meios de comunicação.
3. Procedimento
para. Selecione o tamanho da amostra: Selecione o volume da amostra de água a ser
examinados de acordo com as informações da Tabela 9222:IV.
Use volumes de amostra que produzirão contagens entre 20 e 60
colônias de coliformes termotolerantes por membrana.
Quando a densidade bacteriana da amostra for desconhecida, filtre vários
volumes ou diluições para obter uma placa contável. Estime o
volume e/ou diluição esperado para produzir uma membrana contável,
e selecione duas quantidades adicionais representando um décimo e
dez vezes (ou um terço e três vezes) este volume, respectivamente.
b. Filtrar amostra: Siga o mesmo procedimento e precauções
fornecido em 9222B.4c.
c. Prepare o prato de cultura: Usando técnica asséptica, coloque um
absorvente estéril em cada placa de cultura e pipetar pelo menos
2,0 mL de meio mFC (preparado conforme indicado acima) para saturar
* O reagente ácido rosólico se decomporá se for esterilizado em autoclave. Refrigerar
solução estoque no escuro e descarte após 2 semanas, ou antes se sua cor mudar
do vermelho escuro ao marrom turvo.
https://doi.org/10.2105/SMWW.2882.193
TABELA 9222:IV. VOLUMES DE AMOSTRA SUGERIDOS PARA FILTRO DE MEMBRANA
COLIFORM TERMOTOLERANTE OU TESTE DE E. COLI
Volume (X) a ser filtrado
mL
Fonte de água 100 50 10 1 0,1 0,01 0,001 0,0001
água potável x
Lagos, reservatórios XX
Poços, nascentes XX
XXX
Entrada de abastecimento de água
XXX
Águas balneares naturais
Estação de tratamento de esgoto XXX
Lagoas agrícolas, rios XXX
Escoamento de água de tempestade XXX
Esgoto municipal bruto XXX
Escoamento de confinamento XXX
Lodo de esgoto XXX
almofada. Remova cuidadosamente qualquer excesso de líquido do prato de cultura
prato de decantação. Após a filtração, coloque assepticamente o filtro de amostra
almofada impregnada com meio [ver 9222B.2b2)].
Como substituto do substrato para o absorvente saturado de nutrientes
almofada, adicione 1,5% de ágar ao caldo mFC [ver 9222B.2b1)].
d. Incubar: Coloque os pratos preparados em sacos plásticos impermeáveis,
remova o máximo de ar possível, sele, inverta e submerja Petri
pratos em banho-maria; incubar por 24 horas a 44,5 0,2°C.
Ancorar pratos abaixo da superfície da água; se dispositivos de ancoragem (por exemplo, “O”
anéis, tijolos ou garrafas de água) também ficarão submersos, certifique-se
Eles são pré-aquecidos antes do uso da amostra, pequenos o suficiente para manter
requisitos críticos de temperatura e não interferem na mesma incubação.
Coloque todas as culturas preparadas em banho-maria dentro
30 minutos após a filtração. Como alternativa, use um método apropriado e preciso
dissipador de calor sólido ou incubadora equivalente. Não mergulhe as placas
em recipientes de plástico rígidos e impermeáveis; o espaço de ar extra
não permite que as placas atinjam a temperatura por muitas horas.
e. Contagem: As colônias produzidas por bactérias coliformes
termotolerantes em meio mFC apresentam vários tons de azul. Não-thermotol
As colônias de coliformes Erant são de cor cinza a creme. Normalmente, poucos
colônias de coliformes não termotolerantes serão observadas no mFC
meio porque a temperatura elevada e a adição de rosólico
o reagente de sal ácido seleciona contra eles. Contar colônias com dissecação
binocular de campo amplo de baixa potência (ampliação de 10 a 15)
microscópio ou outro dispositivo óptico, se necessário.
F. Verificação: Verifique na frequência estabelecida pelo laboratório.
Verifique colônias azuis típicas e qualquer cinza atípico para
colônias verdes (ver Seção 9020B.10) para análise de forma de coli
termotolerante. Inoculação simultânea em lauril triptose de concentração única
e caldo EC (ou caldo EC-MUG) incubados a 35
e 44,5°C, respectivamente, são aceitáveis durante a verificação.
4. Cálculo da Densidade de Coliformes Termotolerantes
para. Geral: Calcule a densidade a partir das quantidades de amostra
que produziu contagens de MF dentro da faixa desejada de 20 a 60
colônias de coliformes termotolerantes. Esta faixa de densidade de colônias é
mais restritiva do que a faixa de 20 a 80 coliformes totais devido
o tamanho maior da colônia no meio mFC. Calcular termotolerante
densidade de coliformes conforme indicado em 9222B.5. Registro termotolerante
densidades de coliformes como UFC por l00 mL.
10
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TÉCNICA DE FILTRO DE MEMBRANA (9222)/Procedimento de Coliformes Termotolerantes (Fecal) de Incubação Retardada
b. Amostras de sedimentos e biossólidos: Para sólidos totais (com base no peso
seco), consulte a Seção 2540G. Calcule coliformes termotolerantes por grama de peso
seco para análise de biossólidos da seguinte forma:
Coliformes termotolerantes, UFC/g peso seco
colônias contadas
diluição escolhida) (% de sólidos secos)
onde a diluição e a % de sólidos secos são expressas em forma decimal.
Exemplo 1: O analista observou 22 colônias na placa de diluição 1:10.000 de um
biossólido com 4% de sólidos secos.
22
5,5 106 UFC/g de peso seco
0,0001 0,04
Se nenhum filtro tiver uma contagem de coliformes termotolerantes na faixa ideal
(20 a 60), totalize as contagens de coliformes termotolerantes em todos os filtros
contáveis e relate como coliformes termotolerantes por grama de peso seco:
Exemplo 2: O analista observou 18 colônias na placa de diluição 1:10.000 e 2
colônias na placa de diluição 1:100.000 de uma amostra de biossólidos com 4% de
sólidos secos.
18 2
4,5 106
0,0001 0,00001 0,04
Para calcular uma média geométrica de amostras, converta as densidades de
coliformes termotolerantes de cada amostra para valores log10.
Determine a média geométrica para um determinado número de amostras† calculando
a média dos valores log10 das densidades de coliformes termotolerantes e tomando o
antilog desse valor.
†Geralmente sete se for coletado de acordo com a Regra de Redução de Patógenos da EPA, 40 CFR
Parte 503.1
9222 E. Procedimento de Coliformes Termotolerantes (Fecal) de Incubação Retardada
Este procedimento de incubação retardada é semelhante ao procedimento de
incubação retardada para coliformes totais (9222C). Use este teste somente quando
o teste padrão de coliformes termotolerantes imediatos puder
não ser realizada (por exemplo, se a incubadora de campo apropriada não estiver
disponível ou as circunstâncias indicarem que é aconselhável um serviço laboratorial
especializado para examinar, confirmar ou especiar as colônias suspeitas).
Os resultados obtidos por este método retardado foram consistentes com os
resultados do teste MF de coliformes termotolerantes (fecais) padrão sob diversas
condições de uso em laboratório e em campo. No entanto, determine a aplicabilidade
do teste para uma fonte de água específica em comparação com o teste MF padrão,
especialmente para águas salinas, águas residuais cloradas e águas contendo
substâncias tóxicas.
Para realizar o teste de incubação retardada, filtre a amostra no campo
imediatamente após a coleta, coloque o filtro no meio de retenção m-ST (ver 9222C.2b)
e envie-a para o laboratório. Completo
https://doi.org/10.2105/SMWW.2882.193
5. Referência
1. AGÊNCIA DE PROTEÇÃO AMBIENTAL DOS EUA. 1993. Normas para Uso ou
Disposição de Lodo de Esgoto: Regra Final. 40 CFR Parte 503; Reg. Fed 58:9248.
6. Bibliografia
GELDREICH, EE, HF CLARK, CB HUFF e LC BEST. 1965. Meio de coliformes fecais
para a técnica de filtro de membrana.
J. Amer. Associação de Obras de Água. 57:208.
ROSE, RE, EE GELDREICH & W. LITSKY. 1975. Método de filtro de membrana
aprimorado para análise de coliformes fecais. Apl. Microbiol. 29:532.
LIN, SD 1976. Método de filtro de membrana para recuperação de formas de coli
fecais em efluentes de esgoto clorados. Apl. Meio Ambiente. Microbiol. 32:547.
PRESSWOOD, WG & DK FORTE. 1978. Modificação do meio MFC eliminando o
ácido rosólico. Apl. Meio Ambiente. Microbiol. 36:90.
VERDE, BL, W. LITSKY & KJ SLADEK. 1980. Avaliação de métodos de filtro de
membrana para contagem de coliformes fecais de águas marinhas. Março Meio
Ambiente. Res. 67:267.
SARTORY, DP 1980. Determinações de coliformes fecais por filtração por membrana com
meio MFC não modificado e modificado. Água SA 6:113.
GRABOW, WOK, CA HILNER & P. COUBROUGH. 1981. Avaliação de meios MFC,
MacConkey e Teepol padrão e modificados para contagem de coliformes fecais
em filtros de membrana em água. Apl. Meio Ambiente.
Microbiol. 42:192.
RYCHERT, RC e GR STEPHENSON. 1981. Escherichia coli atípica em
fluxos. Apl. Meio Ambiente. Microbiol. 41:1276.
PAGEL, JE, AA QURESHI, DM YOUNG e LT VLASSOFF. 1982. Comparação de
quatro métodos de filtro de membrana para enumeração de coliformes fecais.
Apl. Meio Ambiente. Microbiol. 43:787.
AGÊNCIA DE PROTEÇÃO AMBIENTAL DOS EUA. 1992. Regulamentação e
Tecnologia Ambiental. Controle de Patógenos e Atração de Vetores em Lodo
de Esgoto; EPA-626/R-92-013. Washington D. C
teste de coliformes termotolerantes transferindo o filtro para meio mFC, incubando a
44,5°C por 24 2 h e contando colônias de coliformes termotolerantes.
O meio m-ST mantém viáveis os organismos coliformes termotolerantes, mas evita
o crescimento visível durante o trânsito. Os filtros de membrana podem ser mantidos
por até 3 dias no meio de retenção m-ST, com pouco efeito nas contagens de
coliformes termotolerantes.
1. Aparelho de Laboratório
para. Pratos de cultura: Ver 9222B.1e.
b. Unidades de filtragem de campo: Consulte
9222B.1f. c. Almofadas absorventes: Consulte
9222B.1h. d. Fórceps: Consulte 9222B.1i.
2. Materiais e Meio de Transporte
para. Meio m-ST: Prepare conforme descrito em 9222C.2b. b. Meio
mFC: Prepare conforme descrito em 9222D.2.
onze
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TÉCNICA DE FILTRO DE MEMBRANA (9222)/ Procedimento de filtro de membrana Klebsiella
3. Procedimento
para. Transporte do filtro de membrana: Usando técnica asséptica, coloque
uma almofada absorvente em uma placa de Petri de plástico com tampa hermética
e sature com meio de retenção m-ST. Após filtrar a amostra, remova o filtro de
membrana da unidade de filtração e coloque-o em uma almofada com saturação
média. Use apenas pratos bem tampados para evitar a perda de umidade, mas
evite o excesso de líquido no prato. Coloque a placa de cultura contendo o filtro
em uma embalagem apropriada e envie ao laboratório. As membranas podem ser
mantidas no meio de transporte à temperatura ambiente por um máximo de 72
horas, com pouco efeito nas contagens de coliformes termotolerantes.
b. Transferência: No laboratório, remova assepticamente a membrana do meio
de retenção e coloque-a em outro prato contendo meio mFC.
c. Incubação: Depois de transferir o filtro para o meio mFC, coloque os pratos
com tampas herméticas em sacos plásticos impermeáveis, inverta e mergulhe
em banho-maria a 44,5 0,2°C por 24 2 h, ou use um dissipador de calor sólido ou
incubadora equivalente. d. Contagem: As
colônias produzidas por bactérias coliformes termotolerantes apresentam
vários tons de azul. Coliformes não termotolerantes
Procedimento de filtro de membrana 9222 F. Klebsiella
A bactéria Klebsiella pertence à família Enterobacteriaceae e está incluída no
grupo dos coliformes totais. Klebsiella spp. são excretados nas fezes de muitos
humanos e animais saudáveis e são facilmente detectados em águas poluídas
por esgoto.
Aproximadamente 60 a 80% de todas as Klebsiella provenientes de fezes e de
amostras clínicas são positivas no teste de coliformes termotolerantes e são
Klebsiella pneumoniae.
A bactéria Klebsiella também está amplamente distribuída na natureza,
ocorrendo no solo, água, grãos, vegetação, etc. Celulose, fábricas de papel,
fábricas de acabamento têxtil e operações de processamento de cana-de-açúcar
contêm grandes números de Klebsiella spp. em seus efluentes (104 a 106 por
100 mL) e Klebsiella spp. são frequentemente os coliformes predominantes
nesses efluentes.
A quantificação rápida pode ser alcançada no procedimento MF modificando a
base do ágar mFC através da substituição de lactose por inositol e adição de
carbenicilina ou usando ágar mKleb.
Estes métodos reduzem a necessidade de testes bioquímicos de cepas puras.
Recomenda-se a verificação preliminar de cores diferenciadas.
1. Aparelho de Laboratório
para. Frascos de amostra: Consulte a Seção
9030B.19. b. Frascos de diluição: Consulte a Seção 9030B.13.
c. Pipetas e provetas graduadas: Consulte 9222B.1c. d.
Recipientes para meio de cultura: Ver 9222B.1d. e. Pratos de
cultura: Ver 9222B.1e. F. Unidades de
filtragem: Consulte 9222B.1f. g. Filtros de
membrana: Consulte 9222B.1g. h. Almofadas
absorventes: Consulte 9222B.1h. Ei.
Fórceps: Consulte 9222B.1i. j.
Incubadoras: Consulte 9222B.1j.
https://doi.org/10.2105/SMWW.2882.193
as colônias são de cor cinza a creme. Conte as colônias com um microscópio
bin ocular de dissecção de campo amplo com ampliação de 10 a 15.
e. Verificação: Verifique as colônias na frequência estabelecida pelo laboratório.
Verifique as colônias azuis típicas e quaisquer colônias atípicas (cinza a verde),
conforme descrito na Seção 9020B.10 para análise de coliformes termotolerantes.
4. Estimativa da Densidade de Coliformes Termotolerantes
Conte conforme indicado em 9222D.3e e calcule a densidade de coliformes
termotolerantes conforme descrito em 9222D.4. Registre o tempo de coleta,
filtração e exame laboratorial e calcule e relate o tempo decorrido.
5. Bibliografia
CHEN, M. & PJ HICKEY. 1983. Modificação do procedimento de incubação
retardada para detecção de coliformes fecais na água. Apl. Meio Ambiente.
Microbiol. 46:889.
2. Materiais e Meios Culturais
para. Ágar mFCIC: Este meio pode não estar disponível na forma desidratada
e pode exigir preparação a partir dos ingredientes básicos:
Triptose ou biosato................................. 10,0 g de peptona de proteose No.
3 ou polipeptona. . . . . . . . . . . . . . . . 5,0 g de extrato de
levedura. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3,0 g de cloreto de
sódio (NaCl). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5,0 g
Inositol ........................................... 10,0 g Sais biliares Nº 3 ou mistura de
sais biliares. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1,5 g de azul de
anilina. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,1 g
Ágar ........................................... 15,0 g Reagente- água de
qualidade................................ 1 L
Aqueça em temperatura média até a ebulição e adicione 10 mL de ácido
rosólico a 1%* dissolvido em NaOH 0,2 N. Resfrie a 45°C e adicione 50 mg de
carbenicilina.† Distribua assepticamente em quantidades de 4 a 6 mL em placas
de Petri plásticas de 9 a 50 mm (profundidade aproximada de 4 a 5 mm). Leve à
geladeira até que seja necessário. Descarte o meio ágar não utilizado após 2
semanas. Não esterilize em autoclave. O pH final deve ser 7,4 b. Ágar mKleb:
0,2.
Ágar fenol vermelho................................... 31,0 g
Adonitol. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Azul anilina 5,0g. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,1 g de
laurilsulfato de sódio. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,1 g de água de
grau reagente................................ 1 L
* O reagente ácido rosólico se decomporá se for esterilizado em autoclave. Refrigerar
a solução estoque no escuro e descartar após 2 semanas, ou antes, se a cor mudar
de vermelho escuro para marrom
turvo. †Disponível na Geopen, Roerig-Pfizer, Inc., Nova York, NY.
12
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TÉCNICA DE FILTRO DE MEMBRANA (9222)/Separação de coliformes termotolerantes de coliformes totais MF usando caldo EC
Esterilize em autoclave por 15 minutos a 121–124°C. Após a autoclavagem,
resfriar a 50°C em banho-maria; adicionar 20 mL de álcool etílico a 95% (não
desnaturado) e 0,05 g de carbenicilina esterilizada por filtro/L. Agite bem e
distribua assepticamente em placas de cultura plásticas de 9-50 mm. O pH
final deve ser 7,4 0,2.
O meio refrigerado pode ser mantido por 20 dias entre 4 e 8°C.
3. Procedimento
para. Seleção e filtração do tamanho da amostra: Consulte 9222B.4 para
seleção do tamanho da amostra e procedimento de filtração. Selecione volumes
de amostra que produzirão contagens entre 20 e 60 colônias de Klebsiella por
membrana. Coloque o filtro de membrana na superfície do ágar; incubar por 24 2
horas a 35 0,5°C. As colônias de Klebsiella no ágar mFCIC são azuis ou cinza-
azuladas. A maioria das colônias atípicas são marrons ou acastanhadas.
Ocorrências ocasionais de falsos positivos são causadas por espécies de
Enterobacter . As colônias de Klebsiella no ágar mKleb variam de azul profundo a
cinza azulado; outras colônias geralmente são rosa ou ocasionalmente amarelo
pálido. Conte as colônias com um microscópio binocular de dissecação de campo
amplo de baixa potência (ampliação de 10 a 15) ou outro dispositivo óptico. b.
Verificação: Verifique as colônias de Klebsiella
do primeiro conjunto de amostras de águas ambientais e efluentes, e quando
houver suspeita de Klebsiella em sistemas de distribuição de abastecimento de
água. Verifique um mínimo de cinco colônias típicas transferindo o crescimento
de uma colônia ou cultura pura para um sistema comercial de múltiplos testes para
especiação de Gram-negativos. Os principais testes para Klebsiella são citrato
(positivo), motilidade (negativo), lisina descarboxilase (positivo),
9222 G. Particionamento de coliformes termotolerantes de coliformes totais MF usando caldo EC
Em uma amostra de água potável, a determinação de coliformes termotolerantes
pode ser realizada a partir de um filtro MF positivo para coliformes totais dentro de
24 horas. Esta técnica pode ser aplicável a outras águas, se necessário.
1. Aparelho de Laboratório
Consulte 9222B.1a–j.
2. Materiais e Meio de Cultura
Caldo CE: Consulte a Seção 9221E.1a.
3. Procedimento
para. Seleção do tamanho da amostra e procedimento de filtração: Consulte
9222B.4.
b. Verificação de coliformes totais: Verifique os coliformes totais antes de usar
o método de partição de coliformes termotolerantes. Limpe o crescimento da
superfície no filtro positivo para coliformes totais ou, se a quantificação for desejada,
transfira pequenas porções de cada colônia alvo no filtro para o meio de verificação
de coliformes totais apropriado usando uma agulha estéril. Consulte 9222B.4g
para procedimentos de verificação de coliformes totais.
https://doi.org/10.2105/SMWW.2882.193
ornitina descarboxilase (negativa) e urease (positiva). Uma cepa de Klebsiella que
é positiva para indol, liquefaz a pectina e demonstra uma resposta coliforme
termotolerante negativa é provavelmente de origem não fecal.
4. Bibliografia
DUNCAN, DW & WE RAZELL. 1972. Biótipos de Klebsiella entre formas de coli
isoladas de ambientes florestais e produtos agrícolas. Apl.
Microbiol. 24:933.
STRAMER, SL 1976. Identificação presuntiva de Klebsiella pneu moniae em meio M-
FC. Cachorro. J. Microbiol. 22:1774.
BAGLEY, ST & RJ SEIDLER. 1977. Significado de Klebsiella positiva para coliformes
fecais. Apl. Meio Ambiente. Microbiol. 33:1141.
KNITTEL, MD, RJ SEIDLER, C. EBY & LM CABE. 1977. Colonização do ambiente
botânico por isolados de Klebsiella de origem patogênica. Apl. Meio Ambiente.
Microbiol. 34:557.
EDMONSON, AS, EM COOK, APD WILCOCK & R. SHINEBAUM. 1980. Uma
comparação das propriedades de Klebsiella isolada de diferentes fontes. J. Med.
Microbiol. (Reino Unido) 13:541.
SMITH, RB 1981. Uma avaliação crítica da mídia para a identificação seletiva e
enumeração de Klebsiella. Tese de mestrado, Dep.
Engenharia Civil e Ambiental, Universidade de Cincinnati, Ohio.
NIEMELA, SI & P. VAATANEN. 1982. Sobrevivência na água do lago de Klebsiella
pneumoniae descarregada por uma fábrica de papel. Apl. Meio Ambiente.
Microbiol. 44:264.
GELDREICH, EE & EW ARROZ. 1987. Ocorrência, significado e detecção de
Klebsiella em sistemas de água. J. Amer. Associação de Obras de Água. 79:74.
DUNCAN, IBR 1988. Klebsiella transmitida pela água e doenças humanas. Avaliação
de toxicidade. 3:581.
c. Método de partição para determinação de coliformes termotolerantes:
Usando técnica asséptica, transfira colônias positivas para coliformes totais do filtro
de membrana para um tubo contendo meio EC por um dos seguintes métodos: •
remova a membrana contendo colônias de coliformes
totais do substrato com uma pinça estéril e cuidadosamente enrole e insira a
membrana no tubo de meio de CE (não agite o tubo no vórtice para evitar a
introdução de bolhas de ar no frasco invertido, • limpe toda a superfície do
filtro da membrana com um cotonete estéril e transfira o inóculo para
o meio de CE (não deixe o cotonete no médio), ou
• se for desejada a quantificação, inocular colónias totais positivas para a forma
de coli individuais em tubos de EC separados. A inoculação simultânea de
testes de verificação de coliformes totais e caldo CE é aceitável (a ordem de
inoculação deve sempre ser primeiro o caldo CE e depois outros meios mais
inibitórios).
Incubar os tubos em uma incubadora de banho-maria a 44,5 0,2°C dentro de 30
minutos após a inoculação. Mantenha uma profundidade de água suficiente na
incubadora para imergir os tubos até o nível superior do meio. A produção de gás
em cultura em caldo EC (9221E.1a) em 24 h é considerada uma resposta positiva
para bactérias coliformes termotolerantes.
13
Machine Translated by Google
TÉCNICA DE FILTRO DE MEMBRANA (9222)/Separação de E. coli de MF Total Coliform usando caldo EC-MUG
4. Bibliografia
MATES, A. & M. SHAFFER. 1989. Diferenciação de filtração por membrana de E. coli
de coliformes no exame da água. J. Appl. Bacteriol. 67:343.
AGÊNCIA DE PROTEÇÃO AMBIENTAL DOS EUA. 1989. Água Potável;
Regulamentos Nacionais de Água Potável Primária; Coliformes Totais
(Incluindo Coliformes Fecais e E. coli); Regra final. 40 Peças CFR 141
e 142; Reg. Fed 54:27544.
AGÊNCIA DE PROTEÇÃO AMBIENTAL DOS EUA. 1991. Primária Nacional
Regulamentos sobre Água Potável; Técnicas Analíticas; Bactérias Coliformes.
40 CFR Parte 141; Reg. Fed 56:636.
9222 H. Particionamento de E. coli de MF Total Coliform usando caldo EC-MUG
Escherichia coli é um membro da família coliformes termotolerantes
grupo de bactérias; sua presença é indicativa de contaminação fecal. A quantificação
e verificação rápidas de E. coli podem ser
alcançado para uma amostra de MF positiva para coliformes totais ou termotolerantes
usando meio contendo 4-metilumbel liferil--D-glicuronídeo (MUG). Neste método, E.
coli é definida
como qualquer coliforme que produza a enzima -D-glucuronidase e
hidrolisa o substrato MUG para produzir uma fluorescência azul.
Ao examinar amostras de água potável, use um dos dois
métodos de partição para determinar a presença de E. coli de um
amostra de MF positiva para coliformes totais em meio tipo Endo: nutriente
ágar contendo MUG (9222I) ou EC contendo MUG. Quando
examinar águas residuais e outras amostras de água não potável, use
um dos métodos de partição para determinar a presença de E. coli
de amostras de MF termotolerantes (fecais)-coliformes positivas em
média de mFC.
1. Aparelho de Laboratório
para. Consulte 9222B.1a–k.
b. Lâmpada ultravioleta, onda longa (365–366 nm), 6 W. Consulte
Seção 9030B.23.
2. Materiais e Meio de Cultura
Caldo EC com MUG (EC-MUG): Consulte a Seção 9221F.1.
3. Procedimento
para. Seleção do tamanho da amostra e procedimento de filtração: Consulte
9222B.4.
b. Verificação de coliformes totais: Verifique os coliformes totais antes
usando o método de partição de E. coli. Limpe o crescimento da superfície do
filtro positivo para coliformes totais ou, se a quantificação for desejada, transferir
pequenas porções de cada colônia alvo no filtro para o
meio apropriado de verificação de coliformes totais usando um meio estéril
agulha. Consulte 9222B.4g para procedimentos de verificação de coliformes totais.
c. Método de partição para determinação de E. coli: Use asséptico
técnica para transferir colônias positivas para coliformes totais no
filtro de membrana para um tubo contendo meio EC-MUG por um
dos seguintes métodos:
• remover a membrana contendo colônias de coliformes totais de
o substrato com uma pinça estéril e cuidadosamente enrole e
insira a membrana no tubo de meio EC-MUG,
https://doi.org/10.2105/SMWW.2882.193
MATES, A. & M. SHAFFER. 1992. Determinação quantitativa de Esche richia coli a
partir de coliformes e coliformes fecais na água do mar. Micro
Bíos 71:27.
SARTORY, D. & L. HOWARD. 1992. Um meio de detecção de beta-glucuroni dase
para a enumeração simultânea por filtração por membrana de Esch erichia coli
e coliformes da água potável. Vamos. Apl. Microbiol. 15:273.
AGÊNCIA DE PROTEÇÃO AMBIENTAL DOS EUA. 2013. Primária Nacional
Regulamentos sobre Água Potável; Revisões do Coliforme Total
regra; Regra final. 40 CFR Partes 141 e 142; Reg. Fed 78:10270.
• limpe toda a superfície do filtro de membrana com um algodão estéril
cotonete e transfira o inóculo para meio EC-MUG (faça
não deixe o cotonete no meio EC-MUG), ou
• se a quantificação for desejada, inocular colónias totais positivas para a forma
de coli individuais em tubos EC-MUG separados.
Incubar a mídia EC-MUG a 44,5 0,2°C por 24 2 h. lugar
todos os tubos EC-MUG na incubadora de banho-maria dentro de 30 minutos após
inoculação. Mantenha uma profundidade de água suficiente na incubadora para
Mergulhe os tubos no nível superior do meio.
Observe os tubos EC-MUG usando um comprimento de onda longo (365–
366 nm) Fonte de luz UV, preferencialmente contendo uma lâmpada de 6 W.
CUIDADO: A lâmpada UV nunca deve ser vista diretamente. De preferência,
visualize os tubos em uma caixa de visualização ou segure a luz UV por alguns centímetros
na frente dos tubos (por exemplo, 3 a 4 pol.), de costas para o observador.
Além disso, é desejável usar uma lâmpada UV equipada com um filtro específico
para eliminar a maior parte da interferência da luz visível e irá
facilitar a determinação da fluorescência. A presença de um brilho
a fluorescência azul no tubo é uma resposta positiva para E. coli.
Registre a presença ou ausência de fluorescência. Para não potável
amostras de água, este método de partição pode ser usado para determinar
E. coli do procedimento MF de coliformes termotolerantes usando
Meio mFC para isolamento inicial antes da transferência para EC-MUG
médio. O procedimento é igual ao anterior, exceto pelo
processo de verificação de coliformes totais.
Um controle positivo que consiste em uma E. coli conhecida (positiva para MUG)
cultura, um controle negativo consistindo de uma Klebsiella termotolerante
cultura de pneumoniae (MUG-negativo) e um meio não inoculado
controle pode ser necessário para interpretar os resultados da amostra e evitar
identificar erroneamente a fraca autofluorescência amarelo-azul do meio como
uma resposta positiva. (Consulte a Seção 9221F.)
4. Bibliografia
MATES, A. & M. SHAFFER. 1989. Diferenciação de filtração por membrana de
E. coli de coliformes no exame de água. J. Appl. Bacteriol. 67:343.
AGÊNCIA DE PROTEÇÃO AMBIENTAL DOS EUA. 1989. Água Potável;
Regulamentos Nacionais de Água Potável Primária; Coliformes Totais
(Incluindo Coliformes Fecais e E. coli); Regra final. 40 Peças CFR 141
e 142; Reg. Fed 54:27544.
AGÊNCIA DE PROTEÇÃO AMBIENTAL DOS EUA. 1991. Primária Nacional
Regulamentos sobre Água Potável; Técnicas Analíticas; Bactérias Coliformes.
40 CFR Parte 141; Reg. Fed 56:636.
MATES, A. & M. SHAFFER. 1992. Determinação quantitativa de Esche richia coli a
partir de coliformes e coliformes fecais na água do mar. MicroBios 71:27.
14
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TÉCNICA DE FILTRO DE MEMBRANA (9222)/Separação de E. coli de Coliformes Totais MF usando Ágar NA-MUG
SARTORY, D. & L. HOWARD. 1992. Um meio que detecta a dose de beta-
glucuroni para a contagem simultânea de filtração por membrana de
9222 I. Particionamento de E. coli de MF Total Coliforms usando NA-MUG Agar
Escherichia coli é um membro da família coliformes termotolerantes
grupo de bactérias; sua presença é indicativa de contaminação fecal. A quantificação
e verificação rápidas de E. coli podem ser
alcançado para uma amostra de MF positiva para coliformes totais ou termotolerantes
usando meio contendo 4-metilumbel liferil--D-glicuronídeo (MUG). Neste método, E.
coli é definida
como qualquer coliforme que produz a enzima -glucuronidase e
hidrolisa o substrato MUG para produzir uma fluorescência azul.
Ao examinar amostras de água potável, use um dos dois
métodos de partição para determinar a presença de E. coli de um
amostra de MF positiva para coliformes totais em meio tipo Endo; usar
ágar nutriente contendo MUG ou caldo EC contendo MUG
(9222H). Ao examinar águas residuais e outros materiais não potáveis
amostras de água, use um dos métodos de partição para determinar o
presença de E. coli de coliformes termotolerantes (fecais) positivos
Amostras MF na média mFC.
1. Aparelho de Laboratório
para. Pratos de cultura: Ver 9222B.1e.
b. Unidades de filtragem: Consulte 9222B.1f.
c. Fórceps: Consulte 9222B.1i.
d. Incubadora: Consulte 9222B.1j.
e. Lâmpada ultravioleta, onda longa (365–366 nm), 6 W: Consulte a Seção
9030B.23.
F. Microscópio e fonte de luz: Consulte 9222B.1k.
2. Materiais e Meio de Cultura
Ágar nutriente com MUG (NA-MUG):
Peptona. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5,0g
Extrato de carne bovina. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3,0g
Ágar ........................................... 15,0 g
4-metilumbeliferil--D-glicuronídeo. . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,1g
Água de grau reagente................................ 1 L
Adicione ingredientes desidratados à água de grau reagente, misture bem e
aqueça para dissolver. Esterilize em autoclave por 15 minutos
entre 121 e 124°C. Dispense quantidades de 4 a 6 mL assepticamente em
Placas de cultura plásticas de 50 mm (profundidade aproximada de 4 a 5 mm)
e deixe solidificar. O pH final deve ser 6,8 0,2. refrigerado
o meio preparado pode ser mantido por 2 semanas.
3. Procedimento
para. Seleção do tamanho da amostra e procedimento de filtração: Consulte
9222B.4.
b. Verificação de coliformes totais: Para amostras de água potável
usando meio tipo Endo, procedimentos de verificação de coliformes totais
pode ser executado antes ou depois do método de partição. cotonete
crescimento superficial no filtro ou, se a quantificação for desejada,
transferir pequenas porções de cada colônia alvo no filtro para o
https://doi.org/10.2105/SMWW.2882.193
Escherichia coli e coliformes da água potável. Vamos. Apl.
Microbiol. 15:273.
meio apropriado de verificação de coliformes totais usando um meio estéril
agulha. Alternativamente, depois de transferir o filtro para a mídia NA-MUG,
incubando-o e lendo os resultados neste meio, transfira colônias individuais,
esfregue o crescimento da superfície no filtro ou coloque
todo o filtro em meio de verificação de coliformes totais apropriado.
(Ver 9222B.4g para procedimentos de verificação de coliformes totais.)
c. Método de partição para determinação de E. coli: Assepticamente
transferir filtro de membrana com pelo menos uma colônia positiva para coliformes
para placa NA-MUG. Se a quantificação for desejada, marque cada
colônia de brilho (por exemplo, use uma caneta de ponta fina para marcar a colônia de brilho
localização na tampa e orientação do filtro/tampa) e transfira a tampa para
placa NA-MUG ou use uma agulha estéril para fazer um furo
filtro de membrana próximo à colônia de brilho após transferir a membrana para o
meio NA-MUG. Incubar NA-MUG imediatamente
após transferência a 35 0,5°C durante 4 h.
Observe colônias individuais (em placas NA-MUG) usando um
fonte de luz UV de comprimento de onda longo (365–366 nm), de preferência com
coloração de lâmpada de 6 W. CUIDADO: A lâmpada UV nunca deve ser
visualizado diretamente. De preferência, visualize as placas em uma caixa de visualização ou segure
a luz UV alguns centímetros acima das placas (por exemplo, 3 a 4 pol.),
de costas para o observador. A presença de um azul brilhante
fluorescência na periferia (borda externa) de uma colônia, ou observada na parte
de trás da placa é uma resposta positiva para
E.coli. Registre a presença ou ausência de fluorescência, ou se a quantificação for
desejada, conte e registre o número de alvos
colônias. Para amostras de água não potável, este método de partição
pode ser usado para determinar E. coli da coli termotolerante
formar procedimento MF usando meio mFC para isolamento inicial
antes da transferência para o meio NA-MUG. O procedimento é o mesmo
como acima, exceto para o processo de verificação de coliformes totais.
4. Bibliografia
MATES, A. & M. SHAFFER. 1989. Diferenciação de filtração por membrana de
E. coli de coliformes no exame de água. J. Appl. Bacteriol. 67:343.
AGÊNCIA DE PROTEÇÃO AMBIENTAL DOS EUA . 1989. Água Potável;
Regulamentos Nacionais de Água Potável Primária; Coliformes Totais
(Incluindo Coliformes Fecais e E. coli); Regra final. 40 Peças CFR 141
e 142; Reg. Fed 54:27544.
AGÊNCIA DE PROTEÇÃO AMBIENTAL DOS EUA . 1991. Primária Nacional
Regulamentos sobre Água Potável; Técnicas Analíticas; Bactérias Coliformes.
40 CFR Parte 141; Reg. Fed 56:636.
MATES, A. & M. SHAFFER. 1992. Determinação quantitativa de Esche richia coli
a partir de coliformes e coliformes fecais na água do mar. MicroBios 71:27.
SARTORY, D. & L. HOWARD. 1992. Um meio que detecta a dose de beta-
glucuroni para a contagem simultânea de filtração por membrana de
Escherichia coli e coliformes da água potável. Vamos. Apl.
Microbiol. 15:273.
SHADIX, LC, ME DUNNIGAN & EW RICE. 1993. Detecção de Esche richia coli
pelo método de filtro de membrana de ágar nutriente mais 4-metilumbeliferil--
D glucuronídeo (MUG). Cachorro. J. Microbiol.
39:1066.
quinze
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TÉCNICA DE FILTRO DE MEMBRANA (9222)/Detecção Simultânea de Coliformes Totais e E. coli por Procedimento de Filtro de Membrana de Cromogênio Duplo

9222 J. Detecção simultânea de coliformes totais e E. coli por procedimento de filtro de

membrana com cromogênio duplo

1. Aparelho de Laboratório CUIDADO: A azida de sódio é altamente tóxica e mutagênica.

Siga as instruções do fabricante e da FDS para o armazenamento e manuseio
Para análises de MF, utilize vidrarias e outros aparelhos compostos adequados deste meio.
de material livre de agentes que possam afetar o crescimento bacteriano. Misture o caldo suavemente invertendo as ampolas duas ou três vezes antes de
para. Frascos de amostra: Consulte a Seção 9030B.19. dispensar. Despeje o meio líquido (aproximadamente 2 mL por placa) uniformemente
b. Frascos de diluição: Consulte a Seção 9030B.13. em almofadas absorventes estéreis e coloque a tampa na placa de Petri. O pH final
c. Pipetas, recipientes de amostras e cilindros graduados: Consulte a Seção deve ser 7,0 0,2.
9030B.9.
d. Pratos de cultura: Ver 9222B.1e. e. 3. Procedimento
Unidades de filtragem: Consulte 9222B.1f.
F. Filtros de membrana: Consulte 9222B.1g. g. para. Seleção do tamanho da amostra: Ver 9222B.4a.

Almofadas absorventes: Consulte 9222B.1h. b. Unidades de filtração estéreis: Consulte 9222B.4b.

h. Fórceps: Consulte 9222B.1i. Ei. c. Filtração da amostra: Consulte 9222B.4c, com a seguinte exceção: incubar

Incubadoras: Consulte 9222B.1j. placas de caldo m-ColiBlue24® a 35 0,5°C

por 24 horas.

d. Contagem: Para contar colônias em filtros de membrana, use um microscópio

2. Materiais e Meio de Cultura binocular de dissecação de campo amplo de baixa potência (ampliação de 10 a 15)
ou outro dispositivo óptico com uma fonte de luz fluorescente branca fria direcionada

Compre esta mídia de um fornecedor comercial; não pode ser preparado a partir para fornecer visualização ideal.
Conte todas as colônias vermelhas e azuis a roxas sob luz normal/ambiente e
de ingredientes básicos. Consulte a Seção 9020B.5j para especificações de controle
registre como o resultado de coliformes totais. Conte apenas colônias azuis a roxas
de qualidade de mídia.
e registre como resultado de E. coli . Colônias claras ou brancas são consideradas
Antes da utilização, teste cada lote com controlos de cultura positivos e negativos
colônias não coliformes. Uma contagem elevada de não coliformes pode interferir
(Ver Tabela 9020:VI). Verifique se há contaminação por coliformes no início e no
no desenvolvimento de colônias de coliformes.
final de cada série de filtração, filtrando 20 a 30 mL de diluição ou enxaguando a
água através do filtro. Se os controles indicarem contaminação, rejeite todos os
e. Verificação de coliformes: Para água potável, a verificação de coliformes totais
dados das amostras afetadas e solicite novas amostras. Teste cada novo lote médio
não é necessária para este meio. Para águas que não sejam água potável, verifique
para confirmar se seu desempenho é satisfatório (ver Seção 9020B.5j). O uso de
com uma frequência estabelecida pelo laboratório (ver Seção 9020B.10). Com base
gráficos de controle é útil para identificar tendências e garantir consistência de longo
na necessidade e no mesmo tipo, os laboratórios podem incorporar medidas de
prazo no desempenho da mídia. Caldo m-ColiBlue24® *
CQ mais rigorosas (por exemplo, verificar pelo menos uma colônia de cada tipo de
colônia típica ou atípica de uma determinada cultura de filtro de membrana, verificar
10% de amostras positivas) (ver Seção 9020B. 10) . Ajuste as contagens com base
L-metionina. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,1 g Azul de nos resultados da verificação. Os testes de verificação estão listados em

metileno ......................... 0,016 g

Casitone . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8,0 g de extrato de 9222B.4g.

levedura. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Lactose 0,5g. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,6 g de 4. Cálculo da Densidade de Coliformes
cloreto de sódio (NaCl). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3,0 g de
Consulte 9222B.5. Calcule os valores finais usando a fórmula:
hidrogenofosfato dipotássico (K2HPO4) .......... 1,75 g de dihidrogenofosfato
de potássio (KH2PO4). . . . . . . . . . . 1,25 g Cloreto de trifenil tetrazólio.................
0,07 g Piruvato de sódio. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1,0 g de número de colônias azul-violeta
E. coli/100 mL 100
eritromicina. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3,0 g de etoxilato de
volume de amostra filtrada (mL)
octifenol† . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,5 g de sulfato de magnésio
(MgSO4) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,3 g de ácido 5-bromo-4-cloro-3-
número de colônias vermelhas e azuis a roxas
indolil--D-glucurônico .............................. .. ...... .(proprietário) ................................... CT/100 mL 100
volume de amostra filtrada (mL)
0,02 g Ciclohexilamônio
sal. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,2 g de água de grau 5. Bibliografia
Azida de sódio reagente......................... 1 L

GRANT, MA 1997. Um novo meio de filtração por membrana para detecção e

enumeração simultânea de Escherichia coli e formas de coli totais. Apl. Meio
Ambiente. Microbiol. 63:3526.
AGÊNCIA DE PROTEÇÃO AMBIENTAL DOS EUA . 1999. Regulamentações
Nacionais de Água Potável Primária e Secundária: Métodos Analíticos para
*m-Coliblue24®, HACH Company, Loveland, CO; EMD Millipore Sigma Contaminantes Químicos e Microbiológicos e Revisões da Regra Final dos
Corp., Billerica, MA; ou equivalente. Requisitos de Certificação de Bibliotecas. 40 CFR Partes 141 e 143; Reg. Fed
† Triton X-114 ou equivalente. 64(230):67449.

https://doi.org/10.2105/SMWW.2882.193 16
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TÉCNICA DE FILTRO DE MEMBRANA (9222)/Procedimento de filtro de membrana de fluorógeno/cromogênio
FRANCY, DS & RA DARNER. 2000. Comparação de métodos para determinar
concentrações de Escherichia coli mineiras em águas recreativas. Água Res
34:2770.
9222 K. Detecção Simultânea de Coliformes Totais e E. coli por Procedimento de Filtro de
Membrana de Fluorógeno/Cromógeno
1. Aparelho de Laboratório
Para análises de MF, utilize vidrarias e outros aparelhos compostos
de material livre de agentes que possam afetar o crescimento bacteriano.
para. Frascos de amostra: Consulte a Seção 9030B.19. b.
Frascos de diluição: Consulte a Seção 9030B.13. c. Pipetas,
recipientes de amostras e cilindros graduados: Consulte a Seção 9030B.9.
d. Pratos de cultura: Ver 9222B.1e. e. Unidades
de filtragem: Consulte 9222B.1f. F. Filtros de
membrana: Consulte 9222B.1g. g. Almofadas
absorventes: Consulte 9222B.1h. h. Fórceps:
Consulte 9222B.1i. Ei. Incubadoras:
Consulte 9222B.1j.
2. Materiais e Meio de Cultura
Utilize meios comerciais desidratados sempre que possível para uniformidade entre
lotes; nunca prepare meios a partir de ingredientes básicos quando meios desidratados
adequados estiverem disponíveis.
Siga as instruções do fabricante para reidratação. Armazene suprimentos abertos de
mídia desidratada em um dessecador (se necessário).
Meios líquidos comerciais (ampolas estéreis, etc.) podem ser usados se forem conhecidos
por fornecerem resultados equivalentes. Consulte a Seção 9020B.5j para especificações
de controle de qualidade de mídia.
Antes da utilização, teste cada lote com controlos de cultura positivos e negativos (Ver
Tabela 9020:VI). Verifique se há contaminação por coliformes no início e no final de cada
série de filtração, filtrando 20 a 30 mL de diluição ou enxaguando a água através do filtro.
Se os controles indicarem contaminação, rejeite todos os dados das amostras afetadas e
solicite novas amostras. Teste cada novo lote médio para confirmar se seu desempenho
é satisfatório (ver Seção 9020B.5j). O uso de gráficos de controle é útil para identificar
tendências e garantir consistência de longo prazo no desempenho da mídia. Se o meio
preparado comercialmente não estiver disponível, prepare conforme descrito nos
parágrafos a–c abaixo. para. Solução de cefsulodina, 1 mg/1 mL: Adicione 0,02 g de
cefsulodina a 20 mL de água destilada de grau reagente, esterilize usando um filtro de
seringa de 0,22 m e armazene em um tubo estéril a 4°C até ser necessário.
Prepare uma solução nova cada vez que o meio MI for preparado. Não guarde a parte
não utilizada. b. MEU ágar:*
Peptona proteose nº 3. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5,0 g de extrato de
levedura. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3,0 g -D-
lactose. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1,0g
4-Metilumbeliferil--D-galactopiranosídeo (MUGal)
(concentração final 100 g/mL). . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,1g
* Placas preparadas BBLTM MI (nº 214986) ou equivalente.
https://doi.org/10.2105/SMWW.2882.193
OLSTADT, J., JJ SCHAUER, J. STANDRIDGE & S. KLUENDER. 2007. Uma
comparação entre coliformes totais/E. aprovados pela USEPA. testes de coli .
J Água e Saúde 05:267.
Indoxil-D-glicuronídeo (IBDG)
(concentração final 320 g/mL)................... 0,32 g
NaCl. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7,5g de
K2HPO4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3,3g de KH2PO4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1,0 g de laurilsulfato de sódio. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,2 g de
desoxicolato de sódio. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,1 g
Ágar ........................................... 15,0 g Reagente- água destilada de
qualidade......................... 1 L
Autoclave o meio por 15 min a 121–124°C e adicione 5 mL de solução de cefsulodina
recém-preparada (¶ a acima) (concentração final de 5 g/mL) por litro de meio de ágar
temperado. O pH final deve ser 6,95 0,2. Pipetar meio em placas de Petri de 9-50 mm (5
mL/placa). Armazene as placas a 4°C por até 2 semanas.
c. Caldo MI:† Use os mesmos ingredientes do ágar MI, mas omita o ágar.
Prepare e esterilize e adicione cefsulodina pelos métodos descritos para ágar MI.
Alternativamente, o caldo pode ser esterilizado por filtro.
O pH final deve ser 7,1 em placas 0,2. Coloque almofadas absorventes em 9-
de Petri de 50 mm e saturar com 2,0 a 3,0 mL de caldo MI contendo 5 g/mL de
concentração final de cefsulodina. Guarde os pratos na geladeira e descarte após 96
horas. Retire o excesso de caldo antes de usar os pratos.
3. Procedimento
para. Seleção do tamanho da amostra: Ver 9222B.4a. b.
Unidades de filtração estéreis: Consulte 9222B.4b. c.
Filtração da amostra: Consulte 9222B.4c. d. Contagem:
Para contar colônias em filtros de membrana, use um microscópio binocular de
dissecação de campo amplo de baixa potência (ampliação de 10 a 15) ou outro dispositivo
óptico com uma fonte de luz fluorescente branca fria direcionada para fornecer
visualização ideal.
Conte todas as colônias azuis em cada placa MI sob luz normal/ambiente e registre como
resultados de E. coli . Os resultados positivos que ocorrem em 24 horas são válidos, mas
os resultados não podem ser registados como negativos até que o período de
incubação de 24 horas esteja completo. Exponha cada placa MI à luz UV de ondas longas
(366 nm) e conte todas as colônias fluorescentes [ E. coli fluorescente azul/ verde, TC
fluorescente azul/branco diferente de E. coli e azul/verde com bordas fluorescentes
(também E. . coli)] para obter a contagem de TC. Registre os dados. Se forem encontradas
colônias azuis não fluorescentes na mesma placa, adicione o total à contagem de CT.
Calcule os valores finais usando a seguinte fórmula:
número de colônias azuis
E. coli/100 mL 100
volume de amostra filtrada (mL)
† Caldo DifcoTM MI desidratado (nº 214882) ou equivalente.
17
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TÉCNICA DE FILTRO DE MEMBRANA (9222)/Procedimento de filtro de membrana de fluorógeno/cromogênio

número de colônias fluorescentes 5. Bibliografia

número de colônias azuis não fluorescentes (se houver)
CT/100 mL 100
volume de amostra filtrada (mL)
BRENNER, KP, CC RANKIN, YR ROYBAL, GN STELMA, JR., PV
SCARPINO & AP DUFOUR. 1993. Novo meio para detecção simultânea de
e. Verificação de coliformes: Para água potável, a verificação de coliformes totais
coliformes totais e Escherichia coli em água. Apl.
não é necessária. Para águas que não sejam água potável, verifique com uma frequência
Meio Ambiente. Microbiol. 59:3534.
estabelecida pelo laboratório (ver Seção 9020B.10).
BRENNER, KP, CC RANKIN, N. SIVAGANESAN & PV SCARPINO. mil novecentos e noventa e seis.
Os laboratórios podem incorporar medidas de CQ mais rigorosas (por exemplo, verificar
Comparação das recuperações de Escherichia coli e formas totais de coli da
pelo menos uma colônia de cada tipo de colônia típica ou atípica de uma determinada
água potável pelo método de ágar MI e pelo método de filtro de membrana
cultura de filtro de membrana, verificar 10% de amostras positivas) com base na
aprovado pela Agência de Proteção Ambiental dos EUA. Apl. Microbiol Ambiental.
necessidade e no tipo de amostra (ver Seção 9020B.10). Ajuste as contagens com base
62:204.
nos resultados da verificação. Os testes de verificação estão listados em 9222B.4g. AGÊNCIA DE PROTEÇÃO AMBIENTAL DOS EUA . 2002. Método 1604: Coliformes
totais e Escherichia coli em água por filtração por membrana usando uma técnica
4. Cálculo da Densidade de Coliformes
de detecção simultânea (meio MI); EPA 821-R-02-024. Desligado. Água,
Consulte 9222B.5. Washington, DC

https://doi.org/10.2105/SMWW.2882.193 18
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9223 TESTE DE COLIFORMES DE SUBSTRATO ENZIMÁTICO*
9223 A. Introdução
Os testes de substrato enzimático utilizam cromogênicos hidrolisáveis e
substratos fluorogênicos para detectar simultaneamente enzimas produzidas por
coliformes totais e Escherichia coli (E. coli). Nisso
método, as bactérias coliformes totais produzem a enzima -D-galac tosidase, que
cliva o substrato cromogênico no meio
para liberar cromogênio. A maioria das cepas de E. coli produz a enzima
-glucuronidase, que cliva um substrato fluorogênico no
meio para liberar flúor. A liberação de cromogênio indica
que bactérias coliformes estão presentes e a liberação de flúor
indica que E. coli está presente.
Tubo múltiplo, poço múltiplo ou presença-ausência (único 100 mL
amostra) estão disponíveis para uso com esses testes de substrato enzimático.
1.Princípio
para. Bactérias coliformes totais: Colilert, Colilert-18 e
Os meios de colisure usam os substratos cromogênicos orto-nitrofen nil--D-
galactopiranosídeo (ONPG) e vermelho de clorofenol--D galactopiranosídeo
(CPRG), respectivamente, para detectar a enzima
-D-galactosidase, que é produzida por bactérias coliformes totais.
A enzima -D-galactosidase hidrolisa o substrato cromogênico que produz uma
mudança de cor, indicando a presença de coliformes totais sem procedimentos
adicionais.
Embora bactérias não coliformes (por exemplo, espécies Aeromonas, Flavobac
terium e Pseudomonas) possam produzir pequenas quantidades
da enzima -D-galactosidase, o crescimento desses organismos
é suprimido para que geralmente não produza um falso positivo
resultado, a menos que 106 UFC/100 mL estejam presentes.
b. Escherichia coli: O substrato fluorogênico 4-metil-umbel liferil--D-glicuronídeo
(MUG) é usado para detectar a enzima -D glucuronidase, que é produzida pela
maioria das cepas de E. coli. O
*Aprovado pelo Comitê de Métodos Padrão, 2016.
Grupo de Trabalho Conjunto: Jennifer Best (presidente), Bennie L. Cockerel, Jr., Gil Dichter,
Nancy H. Hall, William W. Northeimer, Viola Reynolds, Helena Solo-Gabriele.
9223 B. Teste de substrato enzimático
1. Amostras
Colete amostras conforme indicado na Seção 9060A, usando amostra
contêineres especificados na Seção 9030B.19. Ao coletar amostras de água
clorada, use tiossulfato de sódio conforme descrito em
Seção 9060A.2. Siga as diretrizes de controle de qualidade (CQ) para
frascos de amostra descritos na Seção 9020B.5d. Siga a amostra
tempos e condições de retenção conforme descrito na Seção 9060B ou
exigido pelos regulamentos. Tome cuidado para garantir que as amostras sejam
mantida à temperatura apropriada e analisada assim que
possível após a coleta da amostra porque não fazê-lo pode
comprometer resultados. Certifique-se de que as amostras atendam aos critérios de aceitação
do laboratório no momento do recebimento.
https://doi.org/10.2105/SMWW.2882.194
A enzima -D-glucuronidase hidrolisa o substrato fluorogênico que
produz fluorescência azulada quando vista sob comprimento de onda longo
(365–366 nm) luz ultravioleta (UV). Juntos, a cor muda
(devido à -D-galactosidase) e a fluorescência (devido à -D-glucuronidase) indicam
que uma amostra contém E. coli.
Um grande número de algumas bactérias ou cepas de bactérias (por exemplo,
algumas cepas de Shigella e Salmonella spp.) podem causar
amostra ficará fluorescente, mas não mudará sua cor porque eles
falta de -D-galactosidase. Essas amostras seriam consideradas negativas para E.
coli.
2. Aplicações
Esses testes de coliformes com substrato enzimático são recomendados para
análise de amostras de água potável, água de nascente, águas subterrâneas e
águas residuais. Se um laboratório não tiver utilizado este método antes, é
desejável realizar testes paralelos (incluindo variações sazonais)
com o método existente para avaliar a eficácia específica do local e para
comparar resultados. Os resultados de muitos estudos de desempenho de métodos
estão disponíveis na literatura e as taxas de falso-positivos e
-os resultados negativos diferem entre vários meios de comunicação. Os usuários devem
selecionar cuidadosamente o meio e o procedimento que melhor atendem às suas necessidades. Ver
Seção 9020B.11 para orientação sobre validação de novos métodos.
Amostras de água contendo materiais húmicos ou outros podem ser
colori. Se houver uma cor de fundo natural, observe qual é. Se
a água é amarela o suficiente para ser mal interpretada como fraca
positivo após a incubação, use um meio que não fique amarelo
(por exemplo, colisura). O alto teor de sal de cálcio de algumas águas pode
causar precipitação, mas isso não deve afetar a reação. em
amostras com cloro excessivo, um flash azul pode ser visto enquanto
adicionando mídia Colilert ou Colilert-18. Se isso ocorrer, considere
amostra inválida e interrompa o teste.
Não use o teste de substrato enzimático para verificar presumíveis
culturas de coliformes ou colônias com filtro de membrana, porque o substrato
pode ser sobrecarregado pelo pesado inóculo de não coliformes produtores de
dose fraca de -D-galactosi, causando resultados falso-positivos.
2. Controle de qualidade
Os usuários do método devem aderir à garantia de qualidade (GQ)/CQ
diretrizes na Seção 9020, incluindo, mas não limitado a, CQ analítico (Seção
9020B.9), instrumentação/equipamento (Seções
9020B.4 e 9030B) e suprimentos (Seção 9020B.5). Referir-se
Tabela 9020:I para os principais procedimentos de CQ.
Antes de usar cada lote de meio novo, verifique seu desempenho
através de organismos de controle positivo e negativo. Para conduzir cultura
controles, inocular o meio com três bactérias de controle: E. coli, uma
cepa de coliformes totais que não seja E. coli (por exemplo, Enterobacter cloa cae)
e uma não coliforme (ver Tabela 9020:VI). Um não inoculado
o controle negativo também deve ser analisado. Além disso, teste-me
1
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TESTE DE COLIFORME DE SUBSTRATO ENZIMÁTICO (9223)/Teste de substrato enzimático
dium e recipientes (frascos, bandejas multipoços, tubos) para confirmar a esterilidade
e a falta de autofluorescência.
3. Mídia de substrato
Os meios Colilert, Colilert-18 e Colisure estão disponíveis comercialmente* em
pacotes pré-medidos para testes de presença-ausência ou em tubos descartáveis
para uso em formato de tubos múltiplos. O Quanti-Tray e o Quanti-Tray/2000* são
formatos de múltiplos poços que podem ser usados com os pacotes pré-medidos
para quantificar as bactérias coliformes presentes em uma amostra.
Armazene a mídia de acordo com as instruções e use-a antes da data de
validade. Evite a exposição prolongada da mídia à luz solar direta.
Descarte a mídia que mudou de cor, aparência e/ou textura (a mídia é higroscópica
e irá aglomerar-se e escurecer se exposta à umidade).
4. Procedimento
Comece a análise misturando a amostra adequadamente para promover uma
distribuição uniforme das bactérias. Para que ocorra uma mistura adequada, as
amostras devem ter 1 pol. headspace e ser agitado vigorosamente por 7 s (para
frente e para trás 1 pé aproximadamente 25 vezes).
A não mistura adequada da amostra pode levar a resultados errados, pois sabe-
se que as bactérias se aglomeram e, portanto, não são distribuídas de maneira
homogênea pela amostra. Por exemplo, os resultados do número mais provável
(MPN) baseiam-se numa distribuição Poisson (aleatória) de células na amostra; A
não mistura adequada da amostra antes da análise resultará num valor MPN que
subestima a densidade bacteriana atual. A remoção de uma porção da amostra sem
a mistura adequada – como ao realizar análises de presença-ausência com um único
frasco (um frasco usado para coletar e analisar a amostra) – pode resultar em
resultados falsos negativos se os organismos-alvo forem agrupados e removidos.
da garrafa sem ser homogeneizado.
Se o frasco não tiver espaço suficiente para uma mistura adequada, despeje a
amostra em um recipiente estéril maior para que possa ser misturada adequadamente.
Meça o volume de amostra desejado e prossiga com a análise.
Para cada meio ou formato utilizado, os testes devem ser colocados na incubadora
dentro de 30 minutos após a adição do meio à amostra. Independentemente do
formato utilizado, todos os meios devem ser incubados a 35 0,5°C. O meio Colilert
deve ser incubado por 24 horas, o meio Colilert-18 deve ser incubado por 18 horas
e o meio Colisure deve ser incubado por 24 horas.
Os testes de coliformes aqui descritos foram desenvolvidos para obter um
crescimento bacteriano ideal nas temperaturas de incubação indicadas. A não
manutenção desta temperatura durante a incubação pode resultar em resultados
falsos negativos, especialmente com os tempos de incubação mais curtos do
Colilert-18. Para garantir que as amostras estejam na temperatura adequada durante
todo o período de incubação, os laboratórios devem pré-aquecer as amostras após
adicionar o meio, mas antes de colocá-las na incubadora.
Para pré-aquecer uma amostra de teste, coloque-a em banho-maria a 35 0,5°C
por 20 minutos ou em banho-maria a 44,5 0,2°C por 7 a 10 minutos para trazê-la à
temperatura de incubação. O laboratório pode precisar realizar estudos de carga
para determinar quanto tempo as amostras precisam ser incubadas para um pré-
aquecimento eficaz (depende do número de
*Disponível na IDEXX Laboratories, Inc., Westbrook, ME.
https://doi.org/10.2105/SMWW.2882.194
amostras sendo incubadas). O pré-aquecimento é desnecessário se for utilizado o
formato Quanti-Tray.
para. Procedimento de presença-ausência (P/A): Adicionar assepticamente com
tendas de pacote contendo meio pré-medido a uma amostra de 100 mL em um vidro
de borosilicato estéril, transparente e não fluorescente ou frasco ou recipiente
equivalente. Tampe assepticamente e agite vigorosamente para dissolver o meio.
Algum meio pode permanecer dissolvido, mas isso não afetará o desempenho do
teste.
b. Procedimento de múltiplos tubos:
1) Procedimento de múltiplos tubos usando um teste MPN de 5 ou 10 tubos –
Uma série de 5 tubos (20 mL de amostra por tubo) ou uma série de 10 tubos (10 mL
de amostra por tubo) pode ser usada quando prevê-se que os níveis de bactérias
sejam bastante baixos ou um volume fixo de amostra de 100 mL deve ser analisado
(por exemplo, para conformidade regulatória).
Adicione um pacote pré-medido de meio a uma amostra de água bem misturada
de 100 mL em um recipiente e agite vigorosamente para dissolver o meio. Organize
os tubos em fileiras de 5 ou 10 em um suporte para tubos de ensaio e rotule cada
conjunto de tubos. Distribua assepticamente 20 mL de amostra em cada um dos 5
tubos estéreis ou 10 mL em cada um dos 10 tubos estéreis, tampe bem e misture
vigorosamente para dissolver o meio.
Se utilizar 10 tubos que já contenham meio pré-medido (disponível no fabricante),
distribua assepticamente 10 mL de amostra em cada tubo.
Algumas partículas médias podem permanecer não dissolvidas; isso não afetará
o desempenho do teste.
Após a incubação, consulte as Tabelas 9221:II e III para determinar o NMP de
coliformes totais e E. coli presentes.
2) Procedimento de múltiplos tubos usando teste MPN de 15 tubos – Um teste
de 15 tubos normalmente envolve três diluições em série de uma amostra, com cada
diluição inoculada em 5 tubos. Normalmente, 5 tubos contêm amostra não diluída, 5
contêm uma diluição de 1:10 e 5 contêm uma diluição de 1:100.
Use esta técnica quando uma amostra de água puder conter níveis mais elevados
de bactérias e não houver necessidade de analisar um volume fixo (por exemplo, ao
analisar águas não potáveis). O número de tubos e os volumes de amostra
selecionados dependem da qualidade e das características da água a ser examinada.
Para evitar qualquer interação indesejada com o meio, utilize apenas água estéril,
não tamponada e isenta de oxidantes (por exemplo, água desionizada ou destilada)
para preparar diluições.
Ao trabalhar com amostras diluídas, a melhor prática laboratorial é garantir que
todos os tubos estejam no lugar e rotulados antes do início da análise. Além disso,
utilize pipetas limpas e estéreis para pipetar cada diluição, pois o transporte
bacteriano de pipetas sujas tornará os resultados dos testes imprecisos.
a) Usando tubos descartáveis contendo meio pré-medido
(disponível no fabricante)
i) Preparação da amostra para a série não diluída – Pipetar assepticamente 10
mL de amostra bem misturada em cada um dos 5 tubos contendo meio pré-
dispensado. Tampe os tubos e misture vigorosamente para dissolver o meio.
ii) Preparação da diluição 1:10 – Pipete assepticamente 10 mL de amostra bem
misturada para um recipiente estéril contendo 90 mL de água estéril, não tamponada
e livre de oxidantes (por exemplo, água desionizada ou destilada). Misture bem.
Pipetar assepticamente 10 mL desta diluição em cada um dos 5 tubos contendo
meio pré-dispensado. Tampe os tubos e misture vigorosamente para dissolver o
meio. iii) Preparação da diluição 1:100 - Pipete
assepticamente 10 mL de amostra bem misturada da diluição 1:10 para um
recipiente estéril contendo 90 mL de água estéril, não tamponada e livre de oxidantes.
2
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TESTE DE COLIFORME DE SUBSTRATO ENZIMÁTICO (9223)/Teste de substrato enzimático
(por exemplo, água deionizada ou destilada). Misture bem. Pipete assepticamente
10 mL desta diluição em cada um dos 5 tubos contendo meio pré-distribuído.
Tampe os tubos e misture vigorosamente para dissolver o meio.
b) Usando pacotes de meio pré-medido i) Preparando
a amostra para a série não diluída — Adicione um pacote de meio pré-medido
a um recipiente estéril contendo 100 mL de amostra bem misturada e misture
vigorosamente para dissolver o meio.
Pipete assepticamente 10 mL da mistura amostra/meio em cada um dos 5 tubos
estéreis e não fluorescentes.
ii) Preparação de diluições 1:10 e 1:100 – Adicione um pacote de meio pré-
medido a 100 mL de água estéril, não tamponada e sem oxidantes (por exemplo,
água desionizada ou destilada) em um recipiente estéril e misture vigorosamente
para dissolver o meio. Pipete assepticamente 9 mL do meio preparado em 10 tubos
estéreis e não fluorescentes.
Esta preparação do meio substrato enzimático deve ser concluída 1 h após a
adição da amostra ao meio preparado.
iii) Tubos de inoculação para diluição 1:10 – Pipete assepticamente 1 mL de
amostra bem misturada em cada um dos 5 tubos contendo 9 mL de meio
preparado. Tampe e misture bem.
iv) Tubos de inoculação para diluição de 1:100 – Pipete 10 mL de amostra bem
misturada para um recipiente contendo 90 mL de água estéril, não tamponada e
livre de oxidantes (por exemplo, água deionizada ou destilada).
Feche e misture bem para dissolver o meio. Pipete assepticamente 1,0 mL desta
amostra diluída em 5 tubos contendo 9 mL de meio preparado. Tampe e misture
bem.
Para quaisquer diluições adicionais necessárias, continue com a diluição
processo conforme descrito acima.
Após a incubação, utilize a Tabela 9221:IV para determinar o NMP para
coliformes totais e E.coli. Se forem realizadas diluições adicionais, o valor MPN
deve ser multiplicado pelo fator de diluição para obter resultados quantitativos
adequados.
c. Procedimento de múltiplos poços: Este procedimento é realizado com
bandejas de múltiplos poços descartáveis esterilizadas [o Quanti-Tray (51 poços)
ou o Quanti-Tray/2000]. Adicione assepticamente o meio pré-medido do pacote a
uma amostra de água de 100 mL em um recipiente e agite vigorosamente para
dissolver o meio. Para abrir o Quanti-Tray, use uma mão para segurar a unidade
na posição vertical (com o lado do poço voltado para a palma) e aperte a parte
superior da bandeja para que ela se dobre em direção à palma. Puxe com cuidado
a aba do papel alumínio para separá-lo da bandeja, tomando cuidado para não
tocar no interior do papel alumínio ou da bandeja. Adicione a mistura reagente-
amostra de água diretamente na bandeja, evitando o contato com a aba metálica.
Bata suavemente nos pequenos poços (Quanti-Tray/2000) 2 a 3 vezes para liberar
quaisquer bolhas de ar que possam estar presas. Deixe a espuma assentar,
embora um pouco de espuma seja aceitável. Coloque a bandeja no inserto de
borracha apropriado com o lado do poço (plástico) voltado para baixo e insira-a no
selador Quanti-Tray. O selador desloca a amostra para os poços e sela a
embalagem.
5. Interpretação
para. Bactérias coliformes totais: A enzima bacteriana -D-galac tosidase
hidrolisa ONPG (Colilert e Colilert-18) para produzir uma cor amarela e hidrolisa
CPRG (Colisure) para produzir uma cor vermelha ou magenta. Após o período
mínimo de incubação, examine a mudança de cor apropriada (Tabela 9223:I). Se
a resposta da cor não for uniforme em toda a amostra, misture por inversão antes
da leitura.
Use um comparador de cores não vencido (disponível no fabricante) para
garantir que os resultados dos testes Colilert e Colilert-18 sejam lidos
https://doi.org/10.2105/SMWW.2882.194
TABELA 9223:I. MUDANÇAS DE COR PARA VÁRIAS MÍDIAS
Total
Coliformes
Substrato Positivo E. coli Positiva Resultado Negativo
Colilert Amarelo Incolor ou com cor mais clara
Colilert-18 Fluorescência azul que o comparador/sem
fluorescência
Coliseu Vermelho Amarelo, rosa ou laranja/sem
ou magenta Fluorescência azul fluorescência
com precisão. O comparador utilizado deve ter o mesmo volume no mesmo tipo de
recipiente da amostra.
1) Colilert – Se a cor da amostra for tão amarela ou mais escura que a do
comparador, então ela é positiva para coliformes totais. Caso contrário, a amostra
é negativa para coliformes totais.
No entanto, se a resposta cromogénica for ambígua (a cor não pode ser
discernida) após 24 horas, incubar a amostra durante mais 4 horas para permitir
que a cor do teste se intensifique. Se a cor ficar tão amarela ou mais escura que a
do comparador dentro deste período, então a amostra é positiva para coliformes
totais. Caso contrário, a amostra é negativa para coliformes totais.
Colilert pode ser incubado por 28 horas. Após 28 horas, teste negativo
os resultados ainda são considerados válidos, mas os resultados positivos não.
2) Colilert-18 – Se a cor da amostra for tão amarela ou mais escura que a do
comparador, então ela é positiva para coliformes totais.
Caso contrário, é negativo para coliformes totais.
No entanto, se a resposta cromogénica for ambígua (a cor não pode ser
discernida) após 18 horas, incubar a amostra durante mais 4 horas para permitir
que a cor do teste se intensifique. Se a cor ficar tão amarela ou mais escura que a
do comparador dentro deste período, então a amostra é positiva para coliformes
totais. Caso contrário, a amostra é negativa para coliformes totais.
Colilert-18 pode ser incubado por 22 horas. Após 22 horas, os resultados
negativos dos testes ainda são considerados válidos, mas os resultados positivos não.
3) Colisura – Se a amostra apresentar cor vermelha ou magenta, é positiva para
coliformes totais. Se a resposta cromogénica for questionável (a cor pode ser
laranja ou rosa) após 24 horas, incubar a amostra durante mais 24 horas para
permitir que a cor do teste se intensifique. Se a cor ficar vermelha ou magenta
nesse período, a amostra é positiva para coliformes totais.
Os testes de colisure ficam amarelos após a adição do meio; se a cor não
mudar para vermelho ou magenta após a incubação, a amostra será negativa para
coliformes totais.
Colisure pode ser incubado por 48 horas. Após 48 horas, os resultados não são
válidos.
Às vezes, o alto teor de sal de cálcio de uma amostra pode causar precipitação,
mas isso não afetará a reação. Contudo, se o meio de teste adquirir uma cor
inadequada (por exemplo, verde ou preto) que interfira na leitura do resultado do
teste, outro método deverá ser utilizado. b. Escherichia coli: O substrato
fluorogênico MUG é hidrolisado pela enzima bacteriana ß-D-glucuronidase
para produzir uma fluorescência azulada quando visualizado sob comprimento de
onda longo (365–366 nm)
Luz UV. A mudança de cor (indicando que a -D-galactosidase está ativa) e a
fluorescência (indicando que a -D-glucuronidase está ativa) juntas mostram que E.
coli está presente.
Após o período mínimo de incubação, examinar testes de coliformes totais
positivos para fluorescência azulada; use uma lâmpada UV de comprimento de
onda longo (365–366 nm) com uma lâmpada de 6 W e mantenha-a a uma distância
de 5 pol. de amostra em um ambiente escuro. Use um comparador de cores (disponível
3
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TESTE DE COLIFORME DE SUBSTRATO ENZIMÁTICO (9223)/Teste de substrato enzimático
do fabricante) antes da data de validade para garantir que os resultados do
teste sejam lidos com precisão. O comparador utilizado deve ter o mesmo
volume no mesmo tipo de recipiente da amostra.
1) Colilert – Se a amostra tiver uma fluorescência azulada igual ou superior
à de um comparador positivo para coliformes totais, então é positiva para E.
coli. Se a fluorescência for ambígua (não puder ser discernida) após 24 horas,
a amostra poderá ser incubada por até mais 4 horas para permitir que a
fluorescência se intensifique. Se a fluorescência da amostra se intensificar para
um valor igual ou superior ao do comparador dentro deste período, então a
amostra é positiva para E. coli.
Se a fluorescência da amostra permanecer inferior à do comparador após 28
horas de incubação, então é negativa para E. coli. As amostras negativas para
bactérias coliformes totais também são negativas para E. coli.
2) Colilert-18 – Se a amostra tiver uma fluorescência azulada igual ou
superior à de um comparador positivo para coliformes totais, então é positiva
para E. coli. Se a fluorescência for ambígua (não puder ser discernida), a
amostra poderá ser incubada por mais 4 horas para permitir que a fluorescência
se intensifique. Se a fluoresceína da amostra se intensificar para um valor
igual ou superior ao do comparador dentro deste período, então a amostra é
positiva para E. coli.
Se a fluorescência da amostra permanecer inferior à do comparador após 22
horas de incubação, então é negativa para E. coli. As amostras negativas para
bactérias coliformes totais também são negativas para E. coli.
3) Colisura – Se uma amostra positiva para coliformes totais apresentar
fluorescência, então ela é positiva para E. coli. Se a fluorescência for ambígua
(não puder ser discernida), a amostra deverá ser incubada por mais 24 horas
para permitir que a fluorescência se intensifique. Se a amostra apresentar
fluorescência clara dentro deste período, então é positiva para E. coli.
Se a amostra não apresentar fluorescência após 48 horas de incubação,
então é negativa para E. coli. As amostras negativas para bactérias coliformes
totais também são negativas para E. coli.
6. Relatórios
Para o procedimento de presença-ausência, reporte os resultados como total
coliformes e E. coli presentes ou ausentes em uma amostra de 100 mL.
Para o procedimento de tubos múltiplos, calcule o valor NMP para coliformes
totais e E. coli a partir do número de tubos positivos, conforme descrito na
Seção 9221C.
Para o procedimento de múltiplos poços, determine o MPN a partir do
tabelas MPN apropriadas obtidas do fabricante da bandeja.
7. Bibliografia
EDBERG, SC, MJ ALLEN, DB SMITH & O ESTUDO COLABORATIVO
NACIONAL . 1988. Avaliação nacional de campo de um método de
substrato definido para a enumeração simultânea de coliformes totais e
Escherichia coli de água potável: Comparação com o método padrão de
fermentação em tubos múltiplos. Apl. Meio Ambiente. Microbiol. 54:1595.
https://doi.org/10.2105/SMWW.2882.194
EDBERG, SC e MM EDBERG. 1988. Uma tecnologia de substrato definida para a
enumeração de indicadores microbianos de poluição ambiental.
Yale J Biol Med 61:389.
COVERT, TC, LC SHADIX, EW RICE, JR HAINES & RW FREYBERG.
1989. Avaliação do teste Autoanálise Colilert para detecção e enumeração de
coliformes totais. Apl. Meio Ambiente. Microbiol. 55:2443.
EDBERG, SC, MJ ALLEN, DB SMITH & O ESTUDO COLABORATIVO NACIONAL .
1989. Avaliação de campo nacional de um método de substrato definido para
a detecção simultânea de coliformes totais e Esch erichia coli em água
potável: comparação com técnicas de presença-ausência. Apl. Meio
Ambiente. Microbiol. 55:1003.
EDBERG, SC e DB SMITH. 1989. Ausência de associação entre bactérias
heterotróficas totais e coliformes totais de abastecimento público de água.
Apl. Meio Ambiente. Microbiol. 55:380.
AGÊNCIA DE PROTEÇÃO AMBIENTAL DOS EUA . 1989. Regulamentos Nacionais
de Água Potável Primária: Técnicas analíticas; Bactérias Coliformes; Regra
final. 40 CFR Parte 141; Reg. Fed 54:29998.
EDBERG, SC, MJ ALLEN, DB SMITH e NJ KRIZ. 1990. Enumeração de coliformes
totais e Escherichia coli de fontes de água pela tecnologia de substrato
definida. Apl. Meio Ambiente. Microbiol. 56:366.
ARROZ, EW, MJ ALLEN & SC EDBERG. 1990. Eficácia do ensaio de -glucuron
idase para identificação de Escherichia coli pela tecnologia de substrato
definida. Apl. Meio Ambiente. Microbiol. 56:1203.
EDBERG, SC, MJ ALLEN e DB SMITH. 1991. Método de tecnologia de substrato
definido para enumeração rápida e simultânea de coliformes totais e
Escherichia coli da água: Estudo colaborativo.
J.Assoc. Oficial. Anal. Química 74:526.
EDBERG, SC, F. LUDWIG & DB SMITH. 1991. O Sistema Colilert para Coliformes
Totais e Escherichia coli. Amer. Associação de Obras de Água.
Res. Encontrado., Denver, Colorado.
ARROZ, EW, MJ ALLEN, DJ BRENNER & SC EDBERG. 1991. Ensaio para
-glucuronidase em espécies do gênero Escherichia e sua aplicação para
análise de água potável. Apl. Meio Ambiente. Microbiol. 57:592.
ARROZ SHADIX, LC & EW . 1991. Avaliação do ensaio de -glucuronidase para a
detecção de Escherichia coli em águas ambientais.
Cachorro. J. Microbiol. 37:908.
COVERT, TC, EW RICE, SA JOHNSON, D. BERMAN, CH JOHNSON & PM
MASON. 1992. Comparação de testes de coliformes com substrato definido
para detecção de Escherichia coli em água. J. Amer. Associação de Obras de
Água. 84(5):98.
MCCARTY, SC, JH STANDRIDGE e MC STASIAK. 1992. Avaliação de um teste
de substrato definido disponível comercialmente para recuperação de
Escherichia coli tratada com cloro . J. Amer. Associação de Obras de Água.
84(5):91.
AGÊNCIA DE PROTEÇÃO AMBIENTAL DOS EUA . 1992. Regulamentos Nacionais
de Água Potável Primária: Técnicas analíticas; Bactérias Coliformes; Regra
final. 40 CFR Parte 141; Reg. Fed 57:24744.
CLARK, JA e AH SHAARAWI. 1993. Avaliação de kits comerciais de teste de
presença-ausência para detecção de coliformes totais, Esch erichia coli e
outras bactérias indicadoras. Apl. Meio Ambiente. Microbiol. 59:380.
AGÊNCIA DE PROTEÇÃO AMBIENTAL DOS EUA . 1994. Regulamentação
Nacional de Água Potável Primária e Secundária: Métodos analíticos para
regular contaminantes de água potável; Regra final. 40 CFR Partes 141 e
143; Reg. Fed 59:62456.
MCFETERS, GA, SC BROADWAY, BH PYLE, M. PICKETT & Y. EGOZY.
1995. Desempenho comparativo do Colisure™ e métodos aceitos na
detecção de coliformes totais e E. coli lesionados por cloro.
Ciência da Água Technol. 31:259.
4
Machine Translated by Google
9224 DETECÇÃO DE COLIFAGOS*
9224 A. Introdução
1. Discussão Geral
Colifagos são vírus bacterianos que infectam e se replicam em Escherichia
coli. Eles são eliminados nas fezes humanas e animais.
Embora os colifagos não sejam conhecidos por serem perigosos para os seres
humanos, são microrganismos potencialmente importantes para monitorizar
a qualidade microbiana da água e das águas residuais.1
A detecção de colífagos tem sido de interesse crescente, uma vez que se
tornou claro que a monitorização bacteriana de águas e águas residuais pode
não indicar adequadamente a presença de vírus nessas águas.2 A presença
de vírus humanos patogénicos nas águas é uma preocupação de saúde
pública. Surtos de doenças virais transmitidos pela água, como gastroenterite
e hepatite A, ocorrem nos Estados Unidos e em outros lugares.3,4 A detecção
de infecções por vírus entéricos humanos na água e em águas residuais,
entretanto, está além das capacidades da maioria dos laboratórios de água.
Essa detecção tem exigido tradicionalmente o uso de técnicas de cultura
celular.5 Essas técnicas são caras, exigem pessoal qualificado e exigem muito
tempo e trabalho. Os ensaios de colifagos, por outro lado, são relativamente
baratos, são mais fáceis de realizar com pessoal treinado e produzem
resultados durante a noite. Os ensaios de colifagos foram propostos como
uma alternativa aos ensaios de vírus humanos como um indicador da qualidade
viral das águas.6,7 Progressos recentes foram feitos no desenvolvimento de
métodos específicos de colifagos para
avaliar águas e águas residuais. Grande parte deste trabalho concentrou-
se na detecção do grupo de colífagos conhecidos como colífagos de RNA
específicos para homens (também chamados de colífagos de RNA específicos
para F ou fagos FRNA coli).8 Esses colífagos têm tamanho de 20 a 30 nm ,
contêm um genoma de RNA de fita simples e têm uma morfologia isométrica.
Eles infectam exclusivamente células bacterianas que possuem um pilus F,
um apêndice usado para conjugação bacteriana. A sua importância reside no
facto de estes colífagos serem estruturalmente semelhantes a muitos vírus de
ARN humanos encontrados em águas contaminadas com fezes. Em particular,
assemelham-se aos vírus das famílias pico navírus e calicivírus, que incluem
o poliovírus; vírus coxsackie; Norwalk e outros norovírus; vírus da hepatite A;
e vírus da hepatite E. Os vírus humanos não podem se replicar no meio
ambiente. Da mesma forma, os colífagos de RNA específicos para machos
têm apenas replicação limitada no ambiente em temperaturas abaixo de
30°C.9 Os colifagos de RNA específicos para machos também se assemelham
a muitos vírus entéricos humanos por serem relativamente resistentes às
práticas de tratamento de desinfecção. Devido a essas características, os
colífagos de RNA específicos do sexo masculino são candidatos promissores
a indicadores de vírus humanos em águas ambientais.
Nos procedimentos aqui apresentados, foram incluídos métodos para a
detecção dos colífagos de RNA específicos do sexo masculino usando hospedeiro
* Aprovado pelo Comitê de Métodos Padrão de 2004.
Grupo de Tarefa Conjunta: 22ª Edição — Fred P. Williams, Jr. e Ronald E. Stetler
(copresidentes), Samuel R. Farrah, Pierre Payment, Mark D. Sobsey, William A.
Yanko.
https://doi.org/10.2105/SMWW.2882.195
E. coli Famp e para a detecção de colifagos somáticos usando E. coli C.10 Os
colifagos somáticos, ao contrário dos colifagos específicos do macho, são
colifagos que não requerem a presença de um pilus F para infectar as células
hospedeiras. Eles representam uma ampla variedade de tipos de colifagos e
têm sido frequentemente incluídos em estudos ambientais. Também é
apresentado aqui um procedimento que utiliza uma bactéria hospedeira
alternativa, Salmonella typhimurium WG49. Esse hospedeiro tem sido usado
por muitos laboratórios para detectar colífagos de RNA específicos do sexo
masculino e já foi usado anteriormente em um protocolo de método padrão.11
Embora um ensaio de placa de camada dupla de ágar tenha sido especificado
nesses procedimentos, um ensaio de placa de camada única de ágar método
também é apresentado e pode ser usado como um ensaio de placa alternativa.
Esse ensaio de camada única de ágar foi incorporado a um método
desenvolvido para o exame de águas subterrâneas.12 Um procedimento
adicional, um método de filtro de membrana para analisar volumes de amostra
de 100 mL (e maiores), também é apresentado aqui.
Outros métodos estão disponíveis em outros lugares. Um, um enriquecimento
método, tem utilidade particular como um ensaio de presença-ausência.13 A
menos que indicado de outra forma nos procedimentos descritos aqui, consulte
as Seções 9060A e B para obter orientação sobre coleta, preservação e
armazenamento de amostras.
2. Referências
1. ARMON, R. & Y. KOTT. 1996. Bacteriófagos como indicadores de
poluição. Crítico. Rev. Meio Ambiente. Ciência. Tecnologia. 26:299.
2. GOYAL, SM 1983. Indicadores de vírus. Em G. Berg, ed. Poluição viral do meio ambiente.
CRC Press, Boca Raton, Flórida.
3. CRAUN, GF 1986. Doenças Transmitidas pela Água nos Estados Unidos. CDC
Imprensa, Boca Raton, Flórida.
4. WILLIAMS, FP, JR. & EA AKIN. 1986. Gastroen viral transmitido pela água
terite. J. Amer. Associação de Obras de Água. 78:34.
5. BERG, G., RS SAFFERMAN, DR DAHLING, D. BERMAN & CJ HURST.
1984. Manual de Métodos para Virologia da USEPA; EPA-600/4-84-13.
Laboratório de Monitoramento e Apoio Ambiental, Off. Pesquisa e Desenvolvimento,
Agência de Proteção Ambiental dos EUA, Cincinnati, Ohio.
6. KOTT, Y., R. NETTA, S. SHOSHANA & N. BETZER. 1974. Fagos bacterianos como
indicadores de poluição viral. Água Res. 8:165.
7. GRABOW, WOK, P. COUBROUGH, EM NUPEN & BW BATEMAN.
1984. Avaliação de colifagos como indicadores da qualidade virológica de água poluída
por esgoto. Água CS 10:7.
8. HAVELAAR, AH, WM HOGEBOOM & R. POT. 1984. Bacteriófagos de RNA específicos
para F em esgoto: metodologia e ocorrência. Ciências da Água.
Tecnologia. 17:645.
9. WOODY, MA E DO CLIVER. 1995. Efeitos da temperatura e da fase de crescimento da
célula hospedeira na replicação do colifago de RNA específico para F. Apl.
Meio Ambiente. Microbiol. 61:1520.
10. FOUT, GS, FW SCHAEFER, III, JW MESSER, DR DAHLING & RE
STETLER. 1996. Manual do Laboratório Microbiano ICR; EPA-600/R-95/ 178.
Laboratório Nacional de Pesquisa de Exposição., Off. Pesquisa e Desenvolvimento,
Agência de Proteção Ambiental dos EUA, Cincinnati, Ohio.
1
Machine Translated by Google
DETECÇÃO DE COLÍFAGOS (9224)/Ensaio de Colífagos Somáticos
11. COMITÊ TÉCNICO ISO/TC 147, QUALIDADE DA ÁGUA, SUBCOMITÊ SC 4,
MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS. 1995. Qualidade da Água – Detecção e
Enumeração de Bacteriófagos. Parte 1: Enumeração de bacteriófagos de
RNA específicos para F; ISO 1075-1:1995E. ISO, Genebra, Suíça.
12. AGÊNCIA DE PROTEÇÃO AMBIENTAL DOS EUA. 2001. Método 1602:
Colífago específico de macho (F) e somático em água por solteiro
9224 B. Ensaio de Colifago Somático
1. Discussão Geral
Este procedimento de ensaio de placas para detecção de colifagos somáticos é
uma variante do método amplamente utilizado de camada dupla de ágar;1 é
baseado no procedimento de ensaio de colifagos somáticos desenvolvido para fins
regulatórios.2,3 O procedimento pode ser usado, sem métodos suplementares,
para analisar diretamente pequenos volumes de amostras de água e águas
residuais. Em conjunto com métodos de concentração em larga escala usados para
detectar vírus entéricos (Seção 9510), o procedimento também pode ser usado
para analisar amostras de volume muito maior (100 L). Entretanto, o uso de filtros
eletronegativos em pH 3,5 não é recomendado, pois pode ocorrer perda substancial
da viabilidade do colifago. É aconselhável predeterminar a adequação de qualquer
método de grande volume em ensaios medidos de recuperação de colifagos. Este
procedimento de ensaio de placa utiliza E. coli C, uma das bactérias hospedeiras
mais eficazes para a detecção de fagos coli somáticos.4 As placas produzidas com
este hospedeiro são facilmente distinguidas, tornando a quantificação da placa
relativamente simples. A principal vantagem na detecção de colífagos somáticos
é que eles são frequentemente encontrados em águas e águas residuais em maior
abundância do que os colífagos de RNA específicos do sexo masculino. Esta pode
ser uma consideração importante, especialmente para a análise de águas onde
se espera que os índices de poluição sejam baixos. O grupo de colifagos somáticos,
entretanto, é composto por diferentes tipos de fagos (incluindo fagos com e sem
cauda) que exibem características amplamente variadas. Os colifagos somáticos
podem replicar-se no ambiente se um hospedeiro adequado estiver presente.
Devido a estes factores, o grupo de colifagos somáticos pode ser menos
representativo dos enterovírus humanos do que os fagos de ARN mais uniformes
do grupo de colifagos específicos do sexo masculino. O grupo de colifagos
somáticos pode, portanto, não ser o melhor grupo para servir como indicador
específico para vírus humanos em águas e águas residuais. No entanto, a
detecção de fagos somáticos utilizando E. coli C pode ser útil como um indicador
geral da qualidade da água.5
2. Aparelho
para. Criotubos, 2 mL. b.
Frascos Erlenmeyer de 125 e 250 mL e 2 L. c. Cilindros
graduados de 100 e 500 mL. d. Loop de inoculação. e.
Balança laboratorial. F.
Pipetas de 1, 5 e 10 mL. g.
Placas de Petri, 100-15 mm. h. Filtros,
0,22 m. Ao passar material contendo
fago, sempre passe cerca de 10 mL de extrato de carne bovina a 1,5% pelo
filtro antes de usar para minimizar a adsorção de fago ao filtro. Use pré
https://doi.org/10.2105/SMWW.2882.195
Procedimento de Camada de Ágar (SAL); EPA 821-R-01-029. Agência de
Proteção Ambiental dos EUA, Off. Água, Washington, DC
13. AGÊNCIA DE PROTEÇÃO AMBIENTAL DOS EUA. 2001. Método 1601:
Colífago Somático e Específico de Macho (F) em Água por Procedimento de
Enriquecimento em Duas Etapas; EPA 821-R-01-030. Agência de Proteção
Ambiental dos EUA, Off. Água, Washington, DC
Filtros esterilizados ou esterilize os filtros antes do uso em autoclave a 121°C por
15 min. No momento da utilização, utilize uma técnica estéril para colocar filtros em
aparelhos de filtração de amostras estéreis.
Ei. Tubos de ensaio de 16 a 150 mm, com tampa de rosca e fechos. j. Banho-
maria regulado a 44,5 1°C.
3. Mídia e Reagentes
Ajuste a quantidade de mídia preparada proporcionalmente ao número de
amostras. Utilize água de grau reagente (ver Tabela 9020:II) na preparação de
meios e reagentes.
para. Extrato de carne bovina, 1,5%: Dissolva 1,5 g de extrato de carne bovina
em pó e 0,375 g de glicina (concentração final de glicina 0,05 M) em 90 mL de
água. Ajustar o pH para 7,0 a 7,5, se necessário, e levar o volume final para 100
mL com água. Autoclave a 121°C por 15 minutos e use em temperatura ambiente.
Armazenar a 4°C. b. Solução de glicerol, 50%: Adicione
volumes iguais de água e glicerol não diluído. Autoclave a 121°C por 15 min.
Armazenar a 4°C. c. Ágar triptona inclinado:
Triptona.................................................. .. 1,0 g Extrato de levedura 0,1 g
..................................................
Glicose ......................................... .. ........... 0,1 g de
NaCl .................................. . ................... 0,8g
CaCl2 ........................... . ........................... 0,022 g de
ágar ................... .................................... 1,2 g de água grau
reagente ........ ............................ 100ml
Com mistura suave, adicione os ingredientes à água em um frasco de 250 mL.
Dissolver e esterilizar em autoclave a 121°C por 15 min e dispensar porções de 8
mL em tubos de ensaio de 16-150 mm com tampas de tubo. Prepare as inclinações
deixando o ágar solidificar com os tubos mantidos em um ângulo de cerca de 20°.
As inclinações podem ser armazenadas a 4°C por até 3 meses.
d. Ágar triptona de fundo: Prepare antes da análise da amostra, usando
ingredientes e concentrações listados para ágar triptona inclinado, mas use 1,5 g
de ágar. Após autoclavagem a 121°C por 15 min, pipetar assepticamente porções
de 15 mL em placas de Petri estéreis de 100-15 mm e deixar o ágar endurecer.
Armazene os pratos em sacos de manga a 4°C por até 2 semanas e aqueça à
temperatura ambiente por 1 hora antes de usar. e. Caldo triptona: Prepare como
para ágar triptona inclinado, excluindo ágar. Autoclave a 121°C por 15 minutos
e deixe esfriar antes de usar. O caldo pode ser armazenado a 4°C por até 3 meses
em recipientes estéreis e tampados.
F. Tubos de diluição de triptona: Assepticamente, distribua porções de 9 mL de
caldo de triptona estéril em tubos de ensaio de 16-150 mm com tampa de rosca pré-
esterilizados em autoclave a 121°C por 15 min.
2
Machine Translated by Google
DETECÇÃO DE COLÍFAGOS (9224)/Ensaio de Colífagos Somáticos
g. Ágar triptona superior: Use ingredientes e concentrações listados para ágar
triptona inclinado, mas use 0,7 g de ágar. Autoclave a 121°C por 15 min e
coloque em banho-maria a 44,5 1°C. O ágar pode ser armazenado a 4°C por até
3 meses em recipientes estéreis e tampados. Antes de usar o ágar armazenado,
derreta o ágar solidificado e coloque-o em banho-maria a 44,5 1°C.
4. Procedimento
para. Armazenamento da cultura hospedeira de E. coli C: Para armazenamento
de curto prazo, inocular uma cultura hospedeira de Escherichia coli C* em ágar
triptona inclinado com uma alça de inoculação estéril, espalhando o inóculo
uniformemente por toda a superfície inclinada. Incubar a cultura durante a noite
a 36,5 2°C. Armazenar a 4°C por até 2 semanas. Para armazenamento a longo
prazo, inocular um tubo de 5 a 10 mL de caldo de triptona com cultura hospedeira.
Incubar durante a noite a 36,5 2°C. Adicione 1/5 do volume de solução de glicerol
a 50%. Distribua em porções de 1 mL em frascos criogênicos de 2 mL e
armazene a 70°C ou menos.
b. Preparação do hospedeiro: Inocular 5 mL de caldo de triptona com E. coli
C a partir de uma inclinação com uma alça de inoculação e incubar durante a
noite (16 – 20 h) a 36,5 2°C. Transfira 1,5 mL da cultura durante a noite para 30
mL de caldo de triptona em um frasco de 125 mL e incubar por 4 h a 36,5 2°C
com agitação suave. A quantidade de inóculo e caldo utilizado pode ser alterada
proporcionalmente conforme a necessidade.
c. Preparação do controlo positivo do colifago X174: Reidratar uma cultura
stock de colifago somático X174† de acordo com as instruções do fornecedor e
armazenar a 4°C. Prepare uma cultura de 30 mL de E. coli C conforme descrito
acima. Incubar durante 2 h a 36,5 2°C com agitação. Adicione 1 mL de estoque
de fago reidratado e incubar por mais 4 h a 36,5 2°C. Filtrar através de um filtro
de 0,22 m tratado com extrato de carne (ver e 109 diluições do filtrado 9224B.2h).
de triptona. Estas diluições , 108 , Prepare 107 usando tubos de diluição
devem ser suficientes para a maioria dos stocks X174. Alguns estoques podem
exigir diluições maiores ou menores. Adicione 3 mL de ágar triptona derretido
mantido em banho-maria a 44,5 1°C a quinze tubos de ensaio de 16 a 150
mm. Mantenha estes tubos de ensaio em banho-maria aquecido para evitar a
solidificação prematura do ágar.
Adicione 0,1 mL de cultura hospedeira a cada tubo de ensaio. Adicione 1 mL de diluição 109 a
cada um dos cinco tubos de ensaio.
Adicione 1 mL de diluição 108 a cinco tubos adicionais e 1 mL de diluição 107
aos cinco tubos restantes. Rotule os tubos com a diluição apropriada. Para cada
tubo, misture e despeje imediatamente o conteúdo sobre o ágar inferior de uma
placa de Petri rotulada com a diluição testada. Gire o prato para espalhar a
suspensão uniformemente e coloque-o sobre uma superfície nivelada para deixar
o ágar solidificar. Incubar a 36,5°C durante a noite e examinar a presença de
placas no dia seguinte. Conte o número de placas em cada prato. Para determinar
o título do caldo filtrado, utilize a diluição com placas exibindo 20 a 100 placas.
Calcule a média da contagem de placas nesses cinco pratos e multiplique o
resultado pelo inverso da diluição para obter esse título. Para uso como controle
positivo no ensaio de colifagos, dilua o filtrado de estoque para 30 a 80 UFP/mL
em caldo de triptona. Armazene o filtrado original e a preparação diluída do
controle positivo a 4°C. Antes de usar a preparação de controle positivo pela
primeira vez, ensaie 10 mL adicionando volumes de 1 mL da preparação a dez
tubos de ensaio contendo ágar e cultura hospedeira, despejando seu conteúdo
em dez placas de Petri e incubando durante a noite a 36,5 2°C.
* Produto da American Type Culture Collection nº 13706.
† Produto da American Type Culture Collection nº 13706-B1.
https://doi.org/10.2105/SMWW.2882.195
Conte as placas em todas as placas e divida por 10. Se o resultado não for 30 a
80, ajuste a diluição da amostra de controle positivo e reensaie. d. Procedimento
de ensaio: Adicione 3 mL de ágar triptona derretido mantido a 44,5 1°C a cada
um dos dez tubos de ensaio de 16 a 150 mm para ensaio de amostra e a cada
um dos dois tubos de ensaio adicionais para servir como controles negativo e
positivo. Mantenha os tubos de ensaio em banho-maria para evitar a solidificação
do ágar antes do amadurecimento. Adicione 0,1 mL de cultura hospedeira a cada
um dos 12 tubos de ensaio. Adicione 1 mL de caldo de triptona ao tubo de ensaio
servindo como controle negativo. Adicione 1 mL da preparação X174 (30 a 80
PFU/mL) ao tubo de ensaio que serve como controle positivo. A cada um dos 10
tubos restantes, adicione 1 mL de amostra. Para cada tubo, misture e despeje
imediatamente o conteúdo sobre o ágar inferior de uma placa de Petri
devidamente rotulada. Incline e gire o prato para espalhar a suspensão
uniformemente e coloque-o sobre uma superfície nivelada para deixar o ágar
solidificar. Incubar a 36,5°C durante a noite e examinar a presença de placas no
dia seguinte. Conte o número total de pratos nos dez pratos que receberam a
amostra. Calcule a concentração de colifagos somáticos de acordo com a fórmula:
Ca(P10)D
onde:
Concentração de colifagos somáticos de Ca, PFU/mL,
P número total de pratos dos 10 pratos, e
D recíproco da diluição feita no inóculo antes do plaqueamento
(D 1 para amostras não diluídas).
Se as placas de amostra estiverem completamente lisadas ou produzirem
placas demasiado numerosas para serem contadas, dilua a amostra e analise
novamente. No cálculo para amostras diluídas, D será 1 (ex.: D 10, para amostra
diluída 1:10 ou D 100, para amostra diluída 1:100).
Se a amostra analisada for o produto de um procedimento de concentração,
como um eluato de uma amostragem de filtro de grande volume de água ou
águas residuais, calcule a concentração de colifagos da água amostrada de
acordo com a fórmula:
Cava
Cb
vb
onde:
Cb concentração de colifagos somáticos da água amostrada, PFU/L,
concentração de colifagos Ca do material concentrado, PFU/mL,
volume Va desse material, mL, e Vb volume
de água processada no procedimento de amostragem, L.
A concentração resultante geralmente é relatada como PFU/L ou PFU/100 L.
Se as placas de amostra estiverem completamente lisadas ou produzirem placas
muito numerosas para serem contadas, dilua a amostra e analise novamente.
Conte as placas na placa de controle positivo. Mantenha um registro da contagem
de placas como verificação da sensibilidade ao vírus do hospedeiro E. coli C.
Analise novamente quaisquer amostras de eluato de água onde as contagens de
controle positivo estiverem mais de um log abaixo de sua média normal. Caso
sejam detectadas placas na placa de controle negativo, descarte os resultados
do ensaio e repita o ensaio.
5. Referências
1. ADAMS, MH 1959. Bacteriófagos. Editores Interscience, Novo
Iorque, Nova Iorque
2. FOUT, GS, FW SCHAEFER, III, JW MESSER, DR DAHLING & RE
STETLER. 1996. Manual do Laboratório Microbiano ICR; EPA-600/R-95/178.
Laboratório Nacional de Pesquisa de Exposição., Off. Pesquisa e Desenvolvimento, EUA
Agência de Proteção Ambiental, Cincinnati, Ohio.
3
Machine Translated by Google
DETECÇÃO DE COLIFAGOS (9224)/Ensaio de colifagos específico para homens usando Escherichia coli Famp
3. AGÊNCIA DE PROTEÇÃO AMBIENTAL DOS EUA . 1996. Regra de requisitos
de recolha de informações - Regulamentações nacionais de água potável
primária: Requisitos de monitorização para abastecimento público de água
potável: Cryptosporidium, Giardia, vírus, subprodutos de desinfecção, dados de
estações de tratamento de água e outros requisitos de informação. Fed.
Reg. 61(94):24354.
9224 C. Ensaio de colifago específico para homens usando Escherichia coli Famp
1. Discussão Geral
Tal como o ensaio de colifagos somáticos, este ensaio específico para machos é
uma variante do método de dupla camada de ágar1 e baseia-se em procedimentos
desenvolvidos para fins regulamentares.2 Da mesma forma, este ensaio específico para
machos pode ser utilizado, sem métodos suplementares, para analisar pequenos
volumes de amostras de água e águas residuais diretamente. Em conjunto com métodos
de concentração em larga escala usados para detectar vírus entéricos (Seção 9510), o
procedimento também pode ser usado para analisar amostras de volumes maiores
(100 L). Contudo, o uso de filtros eletronegativos em pH 3,5 não é recomendado porque
pode ocorrer perda substancial da viabilidade do colifago. Determine a adequação de
qualquer método de grande volume em ensaios medidos de recuperação de colifagos,
antes de usá-lo. Este procedimento utiliza E. coli Famp como bactéria hospedeira.3 Esta
cepa é resistente aos antibióticos ampicilina e estreptomicina. É uma das duas cepas
bacterianas que foram desenvolvidas para detectar seletivamente colifagos específicos
do sexo masculino.
Para um procedimento utilizando a outra cepa bacteriana, Salmonella typhimurium
WG49, consulte 9224D. Não foi universalmente estabelecido que uma cepa tenha um
desempenho melhor que a outra. Laboratórios individuais podem avaliar ambas as
cepas antes de selecionar uma para uso rotineiro. As placas específicas do sexo
masculino podem ser difíceis de reconhecer em comparação com as placas somáticas.
Geralmente são menos bem definidas que as placas somáticas. Use diligência ao
examinar os pratos em busca de placas específicas para homens. Como os colífagos de
ADN específicos do sexo masculino e alguns colífagos somáticos também podem
produzir placas no hospedeiro E. coli Famp, de preferência confirme que as placas
quantificadas pelo ensaio são causadas por fagos de ARN. Um procedimento RNase
que permite a quantificação diferencial dos colífagos de RNA também é apresentado
abaixo. A vantagem na detecção de colífagos de RNA específicos para homens é que
esses colífagos se assemelham mais aos enterovírus humanos do que os vários tipos
de fagos do grupo somático. Estes colífagos de ARN específicos para machos parecem
ser úteis como modelo para vírus humanos.4,5 Como indicador da presença de vírus
humanos em águas e águas residuais, o seu papel continua por ser totalmente
estabelecido.
2. Aparelho
Consulte 9224B.2.
3. Mídia e Reagentes
Ajuste a quantidade de mídia preparada proporcionalmente ao número de amostras.
Use água de grau reagente (ver Tabela 9020:II) na preparação de meios e reagentes.
https://doi.org/10.2105/SMWW.2882.195
4. HAVELAAR, AH & WM HOGEBOOM. 1983. Fatores que afetam a enumeração
de colifagos em esgotos e águas poluídas por esgoto.
Antonie van Leeuwenhoek 49:387.
5. WENTSEL, RS, PE O'NEILL & JR COZINHAS. 1982. Avaliação da detecção de
colifagos como um indicador rápido da qualidade da água. Apl.
Meio Ambiente. Microbiol. 43:430.
para. Solução de ampicilina: Dissolver 0,15 g de ampicilina em 100 mL de água e
filtrar com filtro de 0,22 m (não é necessário pré-tratamento com extrato de carne bovina).
Armazenar a 4°C. b. Extrato de carne
bovina, 1,5%: Ver 9224B.3a. c. Solução de glicerol,
50%: Ver 9224B.3b. d. Solução de ribonuclease (RNase):
Dissolva 100 mg de RNase contendo 50 a 100 unidades Kunitz/mg em 100 mL de
água aquecendo a 100°C por 10 min. Armazenar a 20°C em porções de 0,5 mL. e.
Solução de estreptomicina: Dissolver 0,15 g de sulfato de estreptomicina em 100 mL de
água e filtrar-esterilizar com filtro de 0,22 m (não é necessário pré-tratamento com
extrato de carne bovina). Armazenar a 4°C. F. Inclinações de ágar triptona: Misture os
ingredientes, dissolva e esterilize conforme indicado em 9224B.3c.
Deixe o ágar autoclavado equilibrar em banho-maria regulado para 44,5 1°C e, em
seguida, adicione 1,0 mL de solução de ampicilina filtrada e 1,0 mL de solução de
estreptomicina filtrada/100 mL de volume de ágar quente. Distribua porções, prepare e
armazene conforme indicado em 9224B.3c.
g. Ágar triptona de fundo: Ver 9224B.3d. Depois de autoclavar em
121°C por 15 min, deixe o ágar equilibrar em banho-maria ajustado a 44,5 1°C e,
em seguida, adicione 1,0 mL de solução de ampicilina filtrada e 1,0 mL de solução de
estreptomicina filtrada/volume de 100 mL de ágar quente.
Distribua porções e armazene conforme indicado em 9224B.3d.
h. Caldo de triptona: Use ingredientes listados em 9224B.3c, excluindo ágar.
Esterilize em autoclave a 121°C por 15 min. Esfrie e adicione 1,0 mL de solução de
ampicilina filtrada e 1,0 mL de solução de estreptomicina filtrada/100 mL de caldo.
Armazenar a 4°C. Use como meio de crescimento. Armazene conforme indicado em
9224B.3c. Ei. Tubos de diluição de triptona: Consulte 9224B.3f. j.
Ágar triptona superior: Use os ingredientes listados em
9224B.3c, mas use 0,7 g de ágar. Após autoclavagem a 121°C por 15 min, deixe o
ágar equilibrar em banho-maria a 44,5 1°C e, em seguida, adicione 1,0 mL de solução
de ampicilina filtrada e 1,0 mL de solução de estreptomicina filtrada/volume de 100 mL
de ágar quente. Armazene conforme indicado em 9224B.3g.
4. Procedimento
para. Armazenamento da cultura hospedeira de E. coli Famp: Siga os procedimentos
de 9224B.4a, utilizando Escherichia coli Famp.* Para esta estirpe, utilize meio contendo
ampicilina e estreptomicina conforme descrito acima.
b. Preparação do host: Siga os procedimentos de 9224B.4b. Coloque no gelo até ser
usado para ensaio para evitar a perda de F pili (use dentro de 3 h).
*Produto American Type Culture Collection nº 700891.
4
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DETECÇÃO DE COLIFAGOS (9224)/Ensaio de colifagos específico para homens usando Salmonella typhimurium WG49
c. Preparação do controle positivo do colifago MS2: Reidratar uma cultura estoque
de colifago MS2 de RNA específico para homens de acordo com as instruções do
fornecedor e armazenar a 4°C. Prepare uma cultura de 30 mL de E. coli Famp conforme
descrito em 9224B.4b. Incubar e proceder conforme indicado em 9224B.4c, utilizando o
MS2 e E. coli Famp.
d. Procedimento de ensaio: Proceder como em 9224B.4d, utilizando MS2 como
controlo positivo. Calcule Ca conforme indicado. Se as placas de amostra estiverem
completamente lisadas ou produzirem placas demasiado numerosas para serem
contadas, dilua a amostra e analise novamente.
Se a amostra analisada for o produto de um procedimento de concentração, calcule
Cb conforme indicado em 9224B.4d. e. Procedimento de
ensaio com confirmação adicional: Proceda como em 9224B.4d, usando MS2 como
controle positivo, mas teste mais 10 mL de amostra. Para os 10 mL adicionais de
amostra, adicione solução de RNase ao ágar triptona derretido até uma concentração
de 40 g/mL. Antes de despejar o conteúdo do tubo em placas de Petri, rotule as placas
de modo que as 10 placas contendo RNase sejam facilmente distinguidas das 10 placas
sem RNase. Calcule a concentração específica masculina de colifagos de RNA (Ca)
em PFU/mL de acordo com a fórmula:
Ca [(P 10) (PRNase 10)] D
onde:
†Produto American Type Culture Collection Nº 15597-B1.
9224 D. Ensaio de colifago específico para homens usando Salmonella typhimurium WG49
1. Discussão Geral
Este ensaio específico para homens utiliza Salmonella typhimurium WG49 como
bactéria hospedeira. É uma variante do método de camada dupla de ágar1 e foi adaptado
de vários procedimentos publicados.2,3 O ensaio pode ser usado com métodos de
concentração em larga escala (ver 9224C.1).
A utilização de S. typhimurium WG49 neste ensaio elimina eficazmente a produção de
placas por colífagos somáticos. Esta é uma vantagem sobre o ensaio baseado em E.
coli Famp. No entanto, os fagos de salmonela somática formam placas com S.
typhimurium WG49 e estes fagos de salmonela somática também podem estar presentes
nas águas sob investigação. Como não foi estabelecido que S. ty phimurium WG49 ou
E. coli Famp sejam universalmente superiores como bactérias hospedeiras para fagos
específicos de machos, laboratórios individuais podem achar útil avaliar ambos os
ensaios antes de fazer uma seleção.
Com qualquer ensaio, tome cuidado ao examinar as placas em busca de placas
específicas do sexo masculino e confirme que as placas detectadas são de fato causadas
por colífagos de RNA e não por outros fagos. Um procedimento RNase para este
propósito é apresentado abaixo. Também é apresentado abaixo um tratamento para
neutralizar o conteúdo de fagos de salmonela somática das amostras antes do ensaio.
Este tratamento pode ser necessário se for encontrada interferência no ensaio por fagos
de salmonela somática.4–6 Tal interferência pode ser esperada porque os fagos de
salmonela somática superam o número de fagos específicos de machos em algumas
águas.7 A vantagem do ensaio baseado em S. typhimurium WG49 , como acontece com
o ensaio baseado em E. coli Famp, é que os fagos de RNA específicos do sexo
masculino possuem uma semelhança com enterovírus humanos não encontrados com o
https://doi.org/10.2105/SMWW.2882.195
Concentração de colifagos de RNA específicos de Ca masculino, PFU/mL,
P número total de pratos dos 10 pratos sem RNase,
Número total de placas PRNase das 10 placas com RNase,
e
D recíproco da diluição feita no inóculo antes
chapeamento.
Se a amostra analisada for o produto de um procedimento de concentração, calcule
a concentração de colifagos conforme descrito anteriormente no parágrafo d acima.
5. Referências
1. ADAMS, MH 1959. Bacteriófagos. Editores Interscience, Novo
Iorque, Nova Iorque
2. FOUT, GS, FW SCHAEFER, III, JW MESSER, DR DAHLING & RE
STETLER. 1996. Manual do Laboratório Microbiano ICR; EPA-600/R-95/
178. Laboratório Nacional de Pesquisa de Exposição., Off. Pesquisa e
Desenvolvimento, Agência de Proteção Ambiental dos EUA, Cincinnati, Ohio.
3. DEBARTOLOMEIS, J. & VJ CABELLI. 1991. Avaliação de uma cepa hospedeira
de Esche richia coli para enumeração de fagos bacterianos F específicos para
machos. Apl. Meio Ambiente. Microbiol. 57:1301.
4. GRUPO DE ESTUDO DA IAWPRC SOBRE MICROBIOLOGIA DA ÁGUA RELACIONADA COM A SAÚDE .
1991. Bacteriófagos como vírus modelo no controle da qualidade da água.
Água Res 25:529.
5. SOBSEY, MD, DA BATTIGELLI, TR HANDZEL & KJ SCHWAB. novecentos e noventa e cinco.
Colífagos específicos de machos como indicadores de contaminação viral
de água potável. Fundação de Pesquisa da American Water Works
Association, Denver, Colorado.
grupo de colifagos somáticos. O ensaio destes fagos específicos do sexo masculino
pode ser útil na avaliação de processos de tratamento de água e águas residuais, mas
como um indicador específico da presença de vírus humanos, o seu papel continua por
ser claramente estabelecido.
2. Aparelho
Consulte 9224B.2.
3. Mídia e Reagentes
Ajuste a quantidade de mídia preparada proporcionalmente ao número de amostras.
Utilize água de grau reagente (ver Tabela 9020:II) na preparação de meios e reagentes.
para. Extrato de carne bovina: Ver
9224B.3a. b. Soluções de glicerol, 50%: Ver 9224B.3b. c.
Solução de canamicina: Dissolva 1 g de monossulfato de canamicina em 100 mL de
água e filtre com o filtro de 0,22 m (não é necessário pré-tratamento com extrato de
carne bovina). Armazenar a 4°C.
d. Solução de lipopolissacarídeo (LPS): Prepare a solução estoque de S. typhimurium
LPS* extraído com fenol dissolvendo o LPS liofilizado em solução salina tamponada
com fosfato estéril para produzir uma concentração de LPS de 2 mg/mL. Armazenar a
4°C.
* Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, item nº L6511 ou equivalente.
5
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DETECÇÃO DE COLIFAGOS (9224)/Método de camada única de ágar
e. Solução de ácido nalidíxico: Dissolver 1 g de ácido nalidíxico em 100 mL de água e
filtrar com filtro de 0,22 m (não é necessário pré-tratamento com extrato de carne bovina).
Armazenar a 4°C. F. Solução salina tamponada com fosfato:
Dissolva 0,8 g de NaCl, 20 mg de KCl, 12 mg de KH2PO4 e 91 mg de Na2HPO4 em 100
mL de água. Esterilize em autoclave a 121°C por 15 min. g. Solução de ribonuclease
(RNase): Consulte 9224C.3d. h. Inclinações de ágar
triptona: Misture os ingredientes, dissolva e esterilize conforme indicado
em 9224B.3c. Deixe o ágar autoclavado equilibrar em banho-maria a 44,5 1°C e, em
seguida, adicione 1 mL de solução de ácido nalidíxico filtrado e 0,2 mL de solução de
canamicina filtrada/100 mL de volume de ágar quente. Distribua porções e armazene
conforme indicado em 9224B.3c.
Ei. Ágar triptona de fundo: Ver 9224B.3d. Depois de autoclavar em
121°C por 15 min, deixar o ágar equilibrar em banho-maria a 44,5 1°C, depois adicionar
1 mL de solução filtrada de ácido nalidíxico e 0,2 mL de solução filtrada de canamicina/100
mL de volume de ágar quente. Distribua porções e armazene conforme indicado em
9224B.3d.
j. Caldo de triptona: Use ingredientes listados em 9224B.3c, excluindo ágar. Esterilize
em autoclave a 121°C por 15 min. Resfrie e adicione 1 mL de solução de ácido nalidíxico
filtrado e 0,2 mL de solução filtrada de ácido nalidíxico.
solução de canamicina/100 mL de caldo. Use como meio de crescimento.
Armazene conforme indicado em 9224B.3c.
k. Tubos de diluição de triptona: Consulte 9224B.3f. eu.
Ágar triptona superior: Use os ingredientes listados em 9224B.3c, mas use 0,7g de ágar.
Após autoclavagem a 121°C por 15 min, deixe o ágar equilibrar em banho-maria a 44,5 1°C
e, em seguida, adicione 1 mL de solução de ácido nalidíxico filtrado e 0,2 mL de solução de
canamicina filtrada/ volume de 100 mL de ágar quente. Armazene conforme indicado em
9224B.3g.
4. Procedimento
para. Armazenamento da cultura hospedeira de S. typhimurium WG49: Siga os
procedimentos de 9224B.4a, utilizando a cultura hospedeira de S. typhimurium WG49†. S.
typhimurium WG49 é resistente ao ácido nalidíxico e à canamicina. Consequentemente,
utilize meios contendo ácido nalidíxico e canamicina conforme descrito acima. b. Preparação
do host: Siga os procedimentos de 9224B.4b.
Coloque em
gelo até ser usado no ensaio para evitar a perda de F pili (usar dentro de 3 h).
c. Preparação do controle positivo do colifago MS2: Reidratar uma cultura estoque de
colifago MS2‡ de RNA específico para homens de acordo com
† Produto da American Type Culture Collection Nº 700730.
‡ Produto da American Type Culture Collection Nº 15597-B1.
9224 E. Método de camada única de ágar
1. Discussão Geral
Este método pode ser utilizado como alternativa aos procedimentos de dupla camada
de ágar descritos acima. Ele usa um formato de camada única de ágar e placas de Petri
maiores. O método permite que mais material de amostra seja analisado por placa e pode
ser usado para analisar diretamente volumes de 100 mL de água e águas residuais.1
Embora originalmente descrito para uso com E. coli C, o procedimento é adequado para
uso com E. coli Famp e S. typhi
https://doi.org/10.2105/SMWW.2882.195
instruções do fornecedor e armazenar a 4°C. Prepare uma cultura de 30 mL de S.
typhimurium WG49 como em 9224B.4b. Incubar e proceder conforme indicado em 9224B.4c,
utilizando o MS2 e S. typhimurium WG49. d. Procedimento de ensaio: Proceder como em
9224B.4d, utilizando MS2 como controlo positivo. Calcule Ca conforme indicado. Se as
placas de amostra estiverem completamente lisadas ou produzirem placas demasiado
numerosas para serem contadas, dilua a amostra e analise novamente.
Se a amostra analisada for o produto de um procedimento de concentração, calcule Cb
conforme indicado em 9224B.4d. e. Procedimento de ensaio
com confirmação adicional: Consulte 9224C.4e. F. Procedimento de tratamento de
amostras para reduzir fagos de salmonela somática: Os resultados do procedimento de
confirmação podem revelar interferência no ensaio por fagos de salmonela somática
presentes em algumas amostras de água ou águas residuais. Para neutralizar esses fagos
somáticos de salmonela antes do ensaio, adicione solução estoque de LPS suficiente à
amostra para produzir uma concentração final de LPS de 20 g/mL. Misture bem e mantenha
em temperatura ambiente por 15 a 30 min.
Em seguida, teste conforme descrito acima.
5. Referências
1. ADAMS, MH 1959. Bacteriófagos. Editores Interscience, Novo
Iorque, Nova Iorque
2. HAVELAAR, AH & WM HOGEBOOM. 1984. Um método para a enumeração
de bacteriófagos específicos de homens em esgotos. J. Appl.
Bacteriol. 56:439.
3. COMITÊ TÉCNICO ISO/TC 147, SUBCOMITÊ DE QUALIDADE DA ÁGUA SC
4, MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS . 1995. Qualidade da Água – Detecção
e Enumeração de Bacteriófagos. Parte 1: Enumeração de bacteriófagos de
RNA específicos para F; ISO 1075-1:1995E. ISO, Genebra, Suíça.
4. RODES, MW E OI KATOR. 1991. Uso de Salmonella typhimurium WG49 para
enumerar colífagos específicos de machos em um estuário e bacia hidrográfica
sujeitos a poluição difusa. Água Res. 251315.
5. HANDZEL, TR, RM GREEN, C. SANCHEZ, H. CHUNG & MD SOBSEY.
1993. Especificidade melhorada na detecção de colifagos específicos de F
em amostras ambientais por supressão de fagos somáticos. Ciência da Água
Technol. 27:123.
6. WILLIAMS, FP & RE STETLER. 1994. Detecção de fagos FRNA coli em águas
subterrâneas: interferência com o ensaio por bacteriófagos somáticos de
salmonela. Vamos. Apl. Microbiol. 19:79.
7. STETLER, RE & FP WILLIAMS. 1996. Pré-tratamento para reduzir a
interferência de fagos de salmonela somática com ensaios de colifagos FRNA:
uso bem-sucedido em uma pesquisa de um ano de águas subterrâneas vulneráveis.
Vamos. Apl. Microbiol. 23:49.
bactéria hospedeira murium WG49. O procedimento geral é descrito abaixo. Para detalhes
específicos relacionados a cada um dos três hospedeiros bacterianos, consulte 9224B, C e
D.
2. Aparelho
Consulte 9224B.2. Use placas de Petri de 150-15 mm para ensaio de amostras.
6
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DETECÇÃO DE COLIFAGOS (9224)/Método de camada única de ágar
3. Mídia e Reagentes
A quantidade de meio preparado pode ser aumentada proporcionalmente ao número
de amostras a serem analisadas. Utilize água de grau reagente (ver Tabela 9020:II) na
preparação de meios e reagentes. Para todas as culturas hospedeiras:
para. Extrato de carne bovina: Ver
9224B.3a. b. Solução de cloreto de cálcio: Adicionar 22 g de CaCl2 a 50 mL de água
e esterilizar em autoclave a 121°C por 15 min. Use em temperatura ambiente. c. Solução
de glicerol, 50%:
Ver 9224B.3b. d. Ágar triptona inclinado: Ver 9224B.3c.
e. Ágar triptona:
Triptona.................................................. ... 2,0 g de extrato de
levedura ........................................... .... 0,2 g de
glicose ........................................... .......... 0,2 g de
NaCl .................................... ................... 1,6g
CaCl2 ............................ ........................... 0,022 g de
ágar ................... . ................................... 1,2 g de água grau
reagente ........ . ........................... 100ml
Esterilize em autoclave a 121°C por 15 min. Coloque no banho-maria a 44,5 1°C.
F. Caldo triptona: Ver 9224B.3d, excluindo o ágar. g. Tubos de diluição de
triptona: Consulte 9224B.3f.
Somente para hospedeiro E. coli
Famp: h. Solução de ampicilina: Consulte 9224C.3a.
Ei. Solução de estreptomicina: Ver 9224C.3e.
Apenas para hospedeiro S. typhimurium WG49: j.
Solução de canamicina: Consulte 9224D.3c. k.
Solução de lipopolissacarídeo (LPS): Consulte 9224D.3d. eu. Solução de
ácido nalidíxico: Ver 9224D.3e.
Para hospedeiros E. coli Famp e S. typhimurium WG49: m. Solução de
ribonuclease (RNase): Consulte 9224C.3d.
4. Procedimento
para. Armazenamento de culturas hospedeiras: Siga os procedimentos de 9224B.4a,
usando cultura hospedeira apropriada. b.
Preparação do host: Siga os procedimentos de 9224B.4b. c. Preparação de
controles positivos de colifagos: Reidratar uma cultura estoque de controle positivo
apropriado de acordo com as instruções do fornecedor e proceder conforme indicado
em 9224B.4c.
d. Filtração da amostra (somente ensaio de colifagos somáticos): As bactérias
presentes nas amostras para análise podem interferir no ensaio de placa. Para eliminar
tal interferência, filtre a amostra antes do ensaio.
Use unidade de filtro estéril de 0,22 m. Para minimizar a adsorção de fagos ao filtro,
passe cerca de 10 mL de extrato de carne bovina a 1,5% através do filtro antes de
passar a amostra através do filtro. NOTA: Como alternativa à filtração da amostra, utilize
a estirpe de E. coli CN-13* em vez de E. coli C no ensaio de colifagos somáticos. E. coli
CN-13 é uma variante resistente ao ácido nalidíxico de E. coli C; usá-lo permite a
adição de
*Produto American Type Culture Collection nº 700609.
https://doi.org/10.2105/SMWW.2882.195
ácido nalidíxico ao meio de ensaio (ver 9224D) para impedir o crescimento de bactérias
indígenas. E. coli CN-13 parece equivalente a E. coli C na detecção de colifagos
somáticos.2
e. Procedimento de ensaio: Colocar 100 mL de amostra em banho-maria a 44,5 1°C
por 3 min. Adicione 5 mL de solução de CaCl2 e 5 mL de preparação de bactéria
hospedeira apropriada à amostra aquecida.
Misture a amostra inoculada com 100 mL de ágar triptona derretido a 44,5 1°C e
distribua em oito placas de Petri de 150-15 mm.
Para um controle positivo, misture 1 mL da preparação de controle positivo apropriada
(30 a 80 PFU/mL) e 1 mL da bactéria hospedeira com 12,5 mL de ágar aquecido que foi
diluído com um volume igual de água morna estéril. Despeje em uma única placa de
Petri de 150-15 mm.
Repita para um controle negativo, mas omita 1 mL de preparação de fagos. Incubar as
placas inoculadas a 36,5 2°C durante a noite e examinar a presença de placas no dia
seguinte. Contar o número total de placas dos oito pratos que receberam a amostra; o
total é a concentração de colifagos/amostra de 100 mL. No entanto, ao testar colifagos
de ARN específicos de machos utilizando E. coli Famp e S. typhimurium WG49, esta
contagem pode incluir alguns colífagos de ADN somáticos e específicos de machos ou
alguns fagos de salmonela somáticos presentes na amostra. Para procedimentos
apropriados para tratar a presença de fagos indesejados, consulte os parágrafos f e g
abaixo.
F. Procedimento de ensaio com confirmação adicional (somente ensaios específicos
para homens): Analise uma porção adicional de amostra de 100 mL conforme descrito
acima, mas adicione solução de RNase ao ágar triptona derretido. Para o material
adicional, o ágar triptona derretido deve conter RNase a uma concentração de 60 g/mL
(antes da adição da amostra). Rotule adequadamente os pratos para que os oito pratos
contendo RNase sejam facilmente distinguidos dos oito pratos sem RNase. Calcule a
concentração específica de colifagos masculinos de acordo com a fórmula:
CaP PRNase_ _
onde:
Concentração de colifagos específicos de Ca masculino, PFU/100 mL,
número total de plaquetas P de placas sem RNase e número total
de plaquetas de PRNase de placas com RNase.
g. Procedimento de tratamento de amostra para reduzir fagos de salmonela somática
(somente ensaio do hospedeiro WG49): Para neutralizar esses fagos de salmonela
somática antes do ensaio, adicione solução estoque de LPS suficiente à amostra para
produzir uma concentração final de LPS de 20 g/mL.
(NOTA: Adicione LPS após adicionar CaCl2 à amostra e antes de adicionar o hospedeiro
WG49.) Misture bem e mantenha à temperatura ambiente por 15 a 30 min. Em seguida,
adicione o host WG49 e teste conforme descrito acima.
5. Referências
1. GRABOW, WOK 1986. Ensaio prático de placa direta para colifagos em
amostras de 100 mL de água potável. Apl. Meio Ambiente. Microbiol. 52:430.
2. SOBSEY, MD, A. AMANTI & TR HANDZEL. 1996. Detecção e ocorrência de
vírus indicadores de colifagos na água. Em Proc. Amer. Associação de Obras
de Água. Tecnologia de Qualidade da Água. Conf., Nova Orleans, Louisiana, nov.
12–16, 1995. American Water Works Assoc., Denver, Colorado.
7
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DETECÇÃO DE COLIFAGOS (9224)/Método de Filtro de Membrana
9224 F. Método de filtro de membrana
1. Discussão Geral
Este método utiliza uma técnica de adsorção de filtro para recuperar colifagos de
amostras de água. Com este método, amostras de 100 mL e volumes maiores podem
ser analisadas de forma eficaz por meio de um procedimento simples no qual a amostra
é primeiro passada através de um filtro de membrana. Os colifagos presentes na
amostra são adsorvidos no filtro e o filtro adsorvido por fagos é então analisado
diretamente em placas.1,2 A vantagem deste método é que, ao contrário do 9224B-E,
ele não requer múltiplas placas de ensaio para cada amostra. Uma única placa de
ensaio é usada para cada filtro adsorvido por fago. Isto reduz significativamente o tempo
e os materiais necessários. A desvantagem é que materiais estranhos, que podem
interferir no ensaio de placa subsequente, podem acumular-se nos filtros à medida que
a água passa através deles. A quantidade de acumulação depende da qualidade da
água que está sendo amostrada e aumenta proporcionalmente ao volume da amostra.
Mantenha os volumes de amostra tão pequenos quanto possível para evitar a
acumulação observável de material descolorante no filtro.
No entanto, com águas de má qualidade, pode ser observada uma acumulação rápida,
mesmo com pequenos volumes de amostra. Com essas águas, utilize filtros de maior
diâmetro para aumentar o volume da amostra.
No procedimento abaixo, é descrito o uso de filtros de membrana de 47 mm, mas filtros
de membrana de 90 mm podem ser usados se os volumes de amostra se mostrarem
inadequados com os filtros menores. Embora originalmente descrito para uso com S.
typhimurium WG49, o procedimento é adequado para uso com bactérias hospedeiras
E. coli C e E. coli Famp. O procedimento geral é descrito abaixo. Para obter detalhes
específicos relacionados a cada um dos três hospedeiros bacterianos, consulte as
seções anteriores (Seções 9224B, C e D).
Embora um método de filtro de membrana seja apresentado aqui, outras abordagens
também podem ser eficazes para o ensaio de amostras de 100 mL e volumes maiores.
Métodos como o método do número mais provável poderiam ser adaptados a volumes
maiores,3 e esses métodos não baseados em filtros seriam provavelmente menos
suscetíveis à má qualidade da água. Considere seu uso se forem encontradas condições
de água que tornem a membrana filtrada
método impraticável.
2. Aparelho
Consulte 9224B.2a–f e h–j e, adicionalmente: a. Placas
de Petri, 60 15 mm. b. Aparelho de
filtração a vácuo de amostra, incluindo um suporte de filtro de membrana de 47 mm
e recipiente receptor de filtro. Esterilize o aparelho antes de usar em autoclave a 121°C
por 15 min.
c. Filtros de membrana de amostra, tamanho de poro de 0,45 m com diâmetro de 47
mm e composição de nitrato e acetato de celulose. Esterilize os filtros antes de usar em
autoclave a 121°C por 15 min (ou use filtros pré-esterilizados). No momento da utilização,
utilize uma técnica estéril para colocar o filtro estéril num aparelho de filtração de
amostras estéreis.
3. Mídia e Reagentes
A quantidade de meio preparado pode ser aumentada proporcionalmente ao número
de amostras a serem analisadas. Utilize água de grau reagente (ver Tabela 9020:II) na
preparação de meios e reagentes.
https://doi.org/10.2105/SMWW.2882.195
Para todas as culturas hospedeiras:
para. Extrato de carne bovina: Ver
9224B.3a. b. Solução de cloreto de magnésio, 2M: Dissolver 19,04 g de MgCl2 em
100 mL de água e esterilizar em autoclave a 121°C por 15 min. Use em temperatura
ambiente. c. Solução de glicerol, 50%: Ver
9224B.3b. d. Solução salina tamponada com fosfato:
Dissolva 0,8 g de NaCl, 20 mg de KCl, 12 mg de KH2PO4 e 91 mg de Na2HPO4 em
100 mL de água.
Esterilize em autoclave a 121°C por 15 min. e. Solução de
violeta de tetrazólio: Adicione 3 g de violeta de tetrazólio a 100 mL de água e
esterilize por filtração com filtro de 0,45 m. Use 1 mL de solução de violeta de tetrazólio/
100 mL de ágar. F. Ágar triptona inclinado: Ver
9224B.3c. g. Ágar triptona: Use os ingredientes e
concentrações listados para o caldo triptona e adicione 0,9 g de ágar e 15 mg
MgSO4/100 mL de caldo. Esterilize em autoclave a 121°C por 15 min. Coloque o ágar
pregado automaticamente no banho-maria a 44,5 1°C. Depois que o ágar esfriar,
adicione 1 mL de solução filtrada de polissorbato e 1 mL de solução filtrada de violeta
tetrazólio/100 mL de volume de ágar quente. Em seguida, adicione 2 mL de preparação
apropriada de bactérias hospedeiras por 100 mL de ágar.
Distribua o ágar por pipeta em porções de 5 mL em placas de Petri estéreis de 60-15
mm e deixe o ágar endurecer. Se as placas forem utilizadas no dia seguinte, armazene
a 4°C durante a noite e aqueça à temperatura ambiente durante 1 h antes de usar. h.
Caldo triptona: Ver 9224B.3e. Ei.
Tubos de diluição de triptona: Consulte
9224B.3f. j. Solução de polissorbato: Adicione 30 g de
polissorbato* a 100 mL
água e filtrar com filtro de 0,22 m. Use 1 mL/100 mL de ágar.
Somente para hospedeiro E. coli
Famp: k. Solução de ampicilina: Consulte 9224C.3a.
eu. Solução de estreptomicina: Ver 9224C.3e.
Apenas para hospedeiro S. typhimurium :
m. Solução de canamicina: Consulte 9224D.3c. n.
Solução de lipopolissacarídeo (LPS): Consulte 9224D.3d. qualquer.
Solução de ácido nalidíxico: Ver 9224D.3e.
Para hospedeiros E. coli Famp e S. typhimurium WG49: p. Solução de
ribonuclease (RNase): Consulte 9224C.3d.
4. Procedimento
para. Armazenamento de culturas hospedeiras: Siga os procedimentos de 9224B.4a,
usando cultura hospedeira apropriada. b.
Preparação do host: Siga os procedimentos de 9224B.4b. c. Preparação de
controles positivos de colifagos: Reidratar uma cultura estoque de controle positivo
apropriado de acordo com as instruções do fornecedor e proceder conforme indicado
em 9224B.4c.
d. Procedimento de ensaio: Para cada amostra de 100 mL, utilize um único ensaio
em placa de Petri. Após a preparação das placas, adicione 2,5 mL de solução de MgCl2
à amostra para produzir uma concentração final de 0,05M.
Passe a amostra suplementada com cloreto de magnésio através do filtro de amostra
estéril a uma taxa suficiente para limpar 102,5 mL inteiros dentro de 1 a 3 min. Utilizando
técnica estéril, remova o filtro do aparelho de filtro de amostra. Tomando cuidado para
evitar a formação de bolhas,
* Entre 80 ou equivalente.
8
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DETECÇÃO DE COLIFAGOS (9224)/Método de Filtro de Membrana
aplique o filtro, voltado para baixo, na superfície de uma das placas de ágar
Petri pré-despejadas. Incubar a 36,5°C durante a noite e examinar a
presença de placas no dia seguinte. Conte o número total de placas. Esse
total é a concentração de colifagos/100 mL de amostra. No entanto, em
ensaios para os colífagos de ARN específicos de machos utilizando E. coli
Famp e S. typhimurium WG49, esta contagem pode incluir alguns colífagos
de ADN somáticos e específicos de machos ou alguns fagos de salmonela
somáticos presentes na amostra. Para procedimentos apropriados para
tratar a presença de fagos indesejados, consulte os parágrafos e e f abaixo.
e. Procedimento de ensaio com confirmação adicional (somente ensaio
de colifago específico para homens): Ensaie uma porção adicional de
amostra de 100 mL. Proceda conforme descrito acima, mas adicione
solução de RNase ao ágar triptona derretido para obter uma concentração
de RNase de 40 g/mL. Rotule a placa de ensaio contendo RNase para que
seja facilmente distinguida da placa de ensaio correspondente sem RNase.
Após incubação durante a noite a 36,5 2°C, determine a concentração
específica de colifagos de RNA masculino/100 mL de amostra subtraindo o
número total de placas contadas no prato contendo RNase do número
total contado no prato sem RNase.
https://doi.org/10.2105/SMWW.2882.195
F. Procedimento de tratamento de amostras para reduzir fagos de
salmonela somática (somente ensaio de hospedeiro WG49): Para
neutralizar fagos de salmonela somática antes do ensaio, trate os filtros de
amostra com uma solução de LPS feita em PBS que contém CaCl2 50 mM
e tem uma concentração de LPS de 20 g/mL. Depois de passar 100 mL de
amostra pelo filtro, passe 5 mL de solução LPS pelo filtro. Manuseie o filtro
tratado com LPS conforme descrito no procedimento de ensaio acima com
filtros não tratados.
5. Referências
1. SOBSEY, MD, KJ SCHWAB & TR HANDZEL. 1990. Um método simples de
filtro de membrana para concentrar e enumerar colífagos de RNA específicos
de homens. J. Amer. Associação de Obras de Água. 82(9):52.
2. SOBSEY, MD, DA BATTIGELLI, TR HANDZEL & KJ SCHWAB. novecentos e noventa e cinco.
Colífagos específicos de machos como indicadores de contaminação viral de
água potável. Fundação de Pesquisa da American Water Works Association,
Denver, Colorado.
3. KOTT, Y. 1966. Estimativa de números baixos de bacteriófagos Escherichia coli
pelo uso do método do número mais provável. Apl.
Microbiol. 14:141.
9
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9225 DIFERENCIAÇÃO DE BACTÉRIAS COLIFORMES*

9225 A. Introdução

A importância de vários organismos coliformes na água tem
tem sido objeto de considerável estudo. Coletivamente, coliformes
bactérias (também chamadas coliformes totais) são consideradas indicadores
de possível saneamento inadequado, contaminação fecal e/ou
bactérias patogênicas e patogênicas oportunistas. No entanto,
A diferenciação completa e precisa de bactérias coliformes continua sendo um
desafio.
Até recentemente, a definição de bactérias coliformes não
incluem os gêneros e espécies de Enterobacteriaceae. A definição tradicional de
bactérias coliformes, baseada na fermentação da lactose com produção de gás,
excluía algumas cepas de
Escherichia coli e incluiu algumas cepas de patógenos entéricos
(por exemplo, Salmonella e Shigella).1 No entanto, como resultado do DNA
testes de hibridização e outros métodos moleculares, pesquisadores
agora classificam muitas espécies de Enterobacteriaceae como coliformes
bactérias.1–4 Existem 18 gêneros de Enterobacteriaceae com espécies ou
biogrupos distintos que fermentam lactose e produzem gás
durante a fermentação. Sessenta e oito das 134 Enterobactere riaceae nomeadas
Uma nova definição de bactérias coliformes – baseada em testes de substrato
enzimático – inclui aquelas que produzem a enzima -D galactopiranosidase para
hidrolisar substratos cromogênicos, como
como orto-nitrofenil-D-galactopiranosídeo (ONPG) ou vermelho de clorofenol--D-
galactopiranosídeo (CPRG). Esta reação geralmente ocorre dentro de 24 2 horas
ou menos a 35°C. Ao usar
meio cromogênico, E. coli são definidas como bactérias coliformes com
a enzima -glucuronidase, que hidrolisa 4-metil-umbel liferil--D-glucuronídeo (MUG)
em 4-metilum-beliferona, um
composto fluorescente.‡
Algumas bactérias coliformes podem crescer sob condições de temperatura
elevada (por exemplo, 44,5°C), mas até 10% das E. coli
não pode crescer em temperaturas elevadas.5 No entanto, muitos
métodos de microfiltração comerciais e tradicionais incubam
culturas a 35°C com diversas enzimas/substratos para diferenciar E. coli de outros
coliformes. Então, um requisito para
a incubação termofílica seria problemática e careceria da especificidade desses

(59%) são coliformes.2 Estes devem ser considerados juntamente com métodos, muitos dos quais têm

com coliformes tradicionais (por exemplo, Citrobacter, Enterobacter, Esch erichia e
Klebsiella) durante a diferenciação de coliformes. Informações sobre nomenclatura,
classificações, citações da literatura original,
e informações detalhadas para gêneros e espécies da família
Enterobacteriaceae e espécies recentemente identificadas, com data de publicação,
estão disponíveis.†
Os usuários devem decidir se uma cultura de coliformes requer uma identificação
taxonômica precisa por questões de segurança, saúde pública ou
exigência regulatória. Esta não é uma prática normal no
laboratório padrão de testes de água.
Uma história de identificação e diferenciação de bactérias coliformes
podem ser encontrados na literatura.3,4 Outras revisões recentes1,2,4 detalham
diferenciação e identificação de coliformes, e discutir os muitos
variáveis envolvidas.
Identificar de forma completa e precisa as bactérias coliformes é uma tarefa
tarefa difícil; um laboratório de referência de Enterobacteriaceae pode
ser necessário. Uma solução prática para um laboratório de água é
considerar vários métodos de diferenciação de coliformes, redigir os relatórios com
precisão e incluir comentários que qualifiquem os relatórios
resultados (veja 9225E para exemplos).
Nas seções seguintes, tanto as referências citadas quanto a bibliografia estão
foram submetidos a extensa validação.
2. Referências
1. AGRICULTOR, JJ, III, KD BOATWRIGHT & JM JANDA. 2007. Enterobac
teriaceae: Introdução e Identificação. No Manual de Clínica
Microbiologia, 9ª ed., Capítulo 42. Amer. Sociedade Microbiol. Imprensa,
Washington D. C
2. BRENNER, DJ & JJ FARMER, III. 2005. Família 1. Enterobacteriaceae. No
Manual de Bacteriologia Sistemática de Bergey, 2ª ed., Vol.
2: As Proteobactérias, Parte B: As Gammaproteobactérias. Springer,
Secaucus, Nova Jersey
3. FARMER, JJ, III, MK FARMER & B. HOLMES. 2005. Enterobac teriaceae:
características gerais. Em Microbiologia e Infecções Microbianas de Topley &
Wilson, 10ª ed., Vol. 2: Bacteriologia,
Capítulo 51. Hodder Arnold, Londres, Reino Unido
4. JANDA, JM & SL ABBOTT. 2006. As Enterobactérias, 2ª ed. Amer.
Sociedade Microbiol. Imprensa, Washington, DC
5. EDBERG, SC, MJ ALLEN & DB SMITH. 1994. Comparação do
Método Calilert® e Métodos Padrão de Coliformes Fecais; Relatório nº.
90647. Fundação de Pesquisa AWWA e American Water Works

disponíveis para maiores informações. Associação, Denver, Colorado.

1. Terminologia
3. Bibliografia

Os coliformes totais são historicamente definidos como bastonetes anaeróbios

facultativos, Gram-negativos e não formadores de esporos que fermentam a lactose. Microbiologia e infecções microbianas de Topley & Wilson. 2006. 10º
ed., Wiley-Blackwell, Nova York, NY
com formação de ácido e/ou gás dentro de 48 horas a 35°C. No entanto,
há também cepas de Escherichia coli e coliformes de crescimento lento e
anaerogênicas (não produtoras de gás).

*Aprovado pelo Comitê de Métodos Padrão, 2011.

Grupo de Tarefa Conjunta: 22ª Edição — Margo E. Hunt (presidente), Michael H. Brodsky,
Archie J. Degnan, Gil Dichter, JJ Farmer, III, Peter Feng. ‡ E. coli pode ser confirmada através de caldo (por exemplo, Seções 9221F e 9222G) ou
† Consulte http://www.bacterio.cict.fr/. Acessado em fevereiro de 2017. meios incubados em temperaturas elevadas.

https://doi.org/10.2105/SMWW.2882.196 1
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DIFERENCIAÇÃO DE BACTÉRIAS COLIFORMES (9225)/Identificação

9225 B. Purificação de Cultura

1. Procedimento Se a colónia produzir um resultado invulgar ou “não identificado”, um organismo

Uma cultura pura é essencial para uma identificação precisa. Testes
“presumivelmente positivos” para coliformes ocorrem em um tubo de cultura de
caldo (produção de ácido e/ou gás) ou em uma colônia positiva para lactose em um
filtro de membrana. Para testes de substrato enzimático, use um caldo de teste,
que é positivo. Tanto as culturas de caldo quanto as de filtro de membrana são
frequentemente culturas mistas – e não puras. Coloque uma alça cheia da amostra
líquida (ou uma colônia) em uma placa contendo um meio de crescimento adequado
(por exemplo, ágar MacConkey) para obter 50 a 100 colônias isoladas. Como
alternativa, produza uma placa de vazamento ou espalhamento com a cultura para
obter 50 a 100 isolados (para obter detalhes, revise as Seções 9215B e C). O ágar
Mac Conkey é ideal porque está disponível comercialmente e faz com que as
colônias que fermentam a lactose rapidamente fiquem rosa-avermelhadas, enquanto
as colônias negativas para lactose permanecem incolores. No entanto, colônias de
organismos Gram-positivos e até mesmo anaeróbicos podem ser misturadas com
ou sob a colônia fermentadora de lactose. Após um período de incubação
apropriado (geralmente 35 0,5°C por pelo menos 24 h), use uma agulha ou alça
estéril para pegar delicadamente uma colônia alvo bem isolada e espalhá-la em
outro meio (por exemplo, MacConkey, soja tríptica ou placa de ágar nutriente) para
garantir que a colônia isolada seja uma cultura pura.
Teste uma colônia bem isolada por meio de coloração de Gram para confirmar
que apenas bastonetes Gram-negativos e não formadores de esporos estão
presentes (Seção 9221B). Além disso, determine se a cultura é negativa para
oxidase, conforme observado na Seção 9222.
contaminante pode estar presente e o perfil bioquímico resultante não será útil.
2. Bibliografia
PTAK, DJ, W. GINSBURG & BF WILLEY. 1974. Aeromonas, o grande mascarado.
Em Proc. AWWA Water Quality Technology Conf., 2–3 de dezembro de 1974,
Dallas, Texas, p. V-1. American Water Works Assoc., Denver, Colorado.
VAN DER KOOJ, D. 1988. Propriedades das aeromonas e sua ocorrência
e significado higiênico na água potável. Zentralbl. Bacteriol.
Hig. B 187:1.
HARTMAN, PA, B. SWAMINATHAN, MS CURIALE, R. FIRSTENBERG-EDEN, AN
SHARPE, NA COX, DYC FUNG & MC GOLDSCHMIDT. 1992.
Métodos rápidos e automação. Em C. Vanderzant & DF
Splittstoesser, eds., Compêndio de Métodos para Exame Microbiológico de
Alimentos, 3º. ed., pág. 665. Associação Americana de Saúde Pública,
Washington, DC
STAGER, CE & JR DAVIS. 1992. Sistemas automatizados para identificação de
microrganismos. Clin. Microbiol. Apocalipse 5:302.
ARROZ, EW, MJ ALLEN, TC COVERT, J. LANGEWIS & J. STANDRIDGE.
1993. Identificação de espécies de Escherichia com kits de testes bioquímicos
e testes bacteriológicos padrão. J. Amer. Associação de Obras de Água.
85(2):74.

9225 C. Identificação

1. Abordagens
Existem muitas maneiras de identificar cepas de Enterobacteriaceae que são
coliformes.1–4 As opções mais práticas para laboratórios de água parecem ser
testes de triagem, “testes em tubo” bioquímicos, métodos de identificação comercial
validados (“kits de identificação”) e métodos moleculares. Cada um tem vantagens
e desvantagens.
Primeiro, confirme que a cultura presumível de coliformes é um membro da
família Enterobacteriaceae . Os corantes, sais biliares e outros ingredientes em
ágares e caldos são seletivos no isolamento de bactérias. Certifique-se de que a
cultura seja Gram-negativa, negativa para oxidase e anaeróbica facultativa. Isso
eliminará espécies que poderiam ser confundidas com Enterobacteriaceae, como
espécies de Bacillus, Aeromonas e Vibrio , que podem fermentar a lactose com
produção de gás. As abordagens a seguir garantem o controle de qualidade (CQ)
dos meios e das condições de teste (por exemplo, usar controles de cultura positivos
e negativos conhecidos).
2. Testes bioquímicos tradicionais, análise computacional e testes de
triagem
Embora alguns laboratórios preparem seus próprios meios a partir de pós
desidratados comerciais, a maioria dos meios comumente usados estão disponíveis
em tubos de vidro preparados comercialmente e prontos para inoculação. Esses
tubos são recomendados para fins de CQ. O teste normalmente envolve a
inoculação de cada tubo com o crescimento de uma colônia, incubando-o a 35°C e
lendo os resultados em 24 e 48 horas. Em muitos laboratórios de referência, os
analistas costumam manter os tubos por 7 dias para detectar reações retardadas.
Infelizmente, os meios e os testes não são completamente padronizados e poucos
laboratórios utilizam exatamente as mesmas formulações ou procedimentos. Os
resultados para 68 “bactérias coliformes potenciais” de Enterobacteriaceae em 47
testes podem ser encontrados na literatura.2 Os analistas então comparam os
resultados das reações bioquímicas da cultura com gráficos ou
tabelas 1–5 – como a Tabela 9260:I – para determinar quais espécies de
Enterobacteriaceae são compatível com os resultados.
O próximo passo poderia ser um software de computador e análises de banco
de dados do perfil bioquímico da cultura de coliformes. A análise computacional
pode ser um complemento útil à análise manual devido às “espécies coliformes
potenciais” na família Enterobacteriaceae . PIBWin* é um programa de identificação
gratuito que pode ser

Muitos dos testes bioquímicos mais comumente usados para diferenciar

coliformes são mostrados na Tabela 9225:I. Todos os laboratórios de microbiologia
costumavam realizar testes bioquímicos em tubos, e muitos laboratórios de
* Consulte http://www.som.soton.ac.uk/research/sites/pibwin/. Acessado em fevereiro de
referência e de saúde pública ainda o fazem.2 2017.

https://doi.org/10.2105/SMWW.2882.196 2
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DIFERENCIAÇÃO DE BACTÉRIAS COLIFORMES (9225)/Identificação

TABELA 9225:I. REAÇÕES BIOQUÍMICAS DE DIVERSAS ESPÉCIES DA FAMÍLIA ENTEROBACTERIACEAE*

Porcentagem de isolados positivos em 1 a 2 dias†

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Espécies

Citrobacter diversus 35 96 99 100 0 99 99 0 99 99 95 0

Citrobacter freundii 50 95 5 100 0 95 20 0 98 55 95 0

Enterobacter aerogenes 95 100 0 98 95 98 98 100 100 97 0

Enterobacter aglomerantes 40 90 20 5 70 50 0 0 30 55 85 75
Enterobacter cloacae 93 99 0 100 100 96 0 95 99 95 0
Escherichia coli 95 95 98 50 0 65 90 94 2 95 0
Escherichia coli, variante 25 45 80 5 0 20 40 75 2 0

Escherichia fergusonii 0 83 98 99 0 1 100 95 0 96 5 0

Escherichia hermannii 45 98 99 95 0 100 6 0 97 93 98
Escherichia vulneris 15 100 0 100 0 1 0 85 100 99 cinquenta

Hafnia alvei 90 0 85 17 98 100 1 15 0

Klebsiella oxytoca 5 100 99 95 1 0 99 0 100 1

Klebsiella ozaenae 80 0 0 0 40 99 92 0
Klebsiella pneumoniae 99 0 98 10 3 98 65 98 0
Klebsiella rhinoscleromatis 0 0 100 0 0 0 99 100 0

Serratia fonticola 100 0 100 9 95 0 100 100 6 0

Serratia marcescens 100 30 98 0 9795
2 1 40 20 98 10 100
98 100 20 30 98 0 91 98 97 99 99 100 99 5 0 97
100 85 0 0 0 0 91

* Modificado após FARMER, JJ, III, 1985. Identificação clínica de novas espécies e biogrupos de Enterobacteriaceae. J. Clin. Microbiol. 21:46. Esta lista não é completa.
†As reações que se tornam positivas após 2 dias não são consideradas.

baixado e usado com a “matriz de dados Colindale da Entero preter resultados (às vezes lidos via máquina com simultânea
bacteriaceae”6 (opção atual do programa). Apesar de análise computacional). Muitos desses bioquímicos miniaturizados
matriz agora está desatualizada, ela ainda contém os organismos coli mais comuns os testes são validados pela AOAC International. A maioria clínica e alimentar
encontrados na água. Os Centros de Controle de Doenças laboratórios de microbiologia agora usam identificação miniaturizada
e matriz de dados de Enterobacteriaceae do Prevention (CDC) , kits para identificar culturas comuns de Enterobacteriaceae , incluindo
que inclui as espécies descritas mais recentemente, será culturas de coliformes isoladas da água, mas esses ensaios podem ser
adicionado ao PIBWin no futuro. menos preciso para espécies recentemente descritas. Verifique as instruções
Os testes de triagem podem diferenciar coliformes ou confirmar uma manual para determinar quais organismos estão incluídos na base de dados e o
identificação feita através de um sistema de identificação comercial ou número de cepas usadas para definir cada organismo.
método molecular. Tabela 9225:I lista testes de triagem úteis, chave O principal problema com os kits de identificação é que os painéis de teste
reações e as propriedades de alguns dos mais comuns usados (geralmente cerca de 20) são insuficientes para diferenciar todos os
bactérias coliformes. Testes adicionais de triagem de Enterobacteriaceae espécies relevantes de Enterobacteriaceae . (Isso também está se tornando um
que podem ser úteis para diferenciar coliformes estão disponíveis e problema com testes em tubo convencionais, mesmo quando 40 a 50 testes
descrito em outro lugar.2 são feitos.) Resultados incomuns ou “não identificados” podem ser testados com
outro kit, que pode ter limitações semelhantes. Alternativamente,
3. Meios Comerciais, Reagentes e Kits de Teste a cultura poderá ser enviada a um laboratório de referência para identificação por
meio de testes moleculares ou sequenciamento de 16S rRNA.
Existem muitos produtos comerciais (por exemplo, meios desidratados, Ao utilizar kits de identificação para diferenciar coliformes, mantenha
mídia pronta para uso e reagentes) e identificação comercial tendo em mente que seus bancos de dados podem não incluir alguns coliformes
produtos (kits de identificação) para diferenciar Enterobacteriaceae e bactérias bactérias que provavelmente ocorrem na água. Esses kits e bancos de dados foram
semelhantes.7,8 Os kits de identificação normalmente consistem originalmente desenvolvido para uso em microbiologia clínica, portanto pode
de uma tira plástica que contém um conjunto de substâncias bioquímicas miniaturizadas não inclui todas as bactérias coliformes isoladas da água.8 Nota
testes, muitas vezes aqueles tradicionalmente usados para identificação (indole que alguns kits de identificação semiautomáticos e automatizados são
produção, Voges-Proskauer, utilização de citrato, fermentação de lactose, etc.). A agora sendo desenvolvido para amostras ambientais.†
abordagem é semelhante aos testes bioquímicos em
tubos de vidro, sendo as principais diferenças a miniaturização,
simplicidade, facilidade de uso, rapidez de análise, número de testes disponíveis, † Vitek, bioM´erieux Inc., Durham, NC; Estação MicroLog Micro, Biolog, Bremen,
meio de suspensão e método de leitura e inter Alemanha; ou equivalente.

https://doi.org/10.2105/SMWW.2882.196 3
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DIFERENCIAÇÃO DE BACTÉRIAS COLIFORMES (9225)/Meio, Reagentes e Procedimentos
4. Métodos Moleculares
Métodos moleculares podem ser usados para identificação taxonômica de
um coliforme, incluindo família, gênero, espécie, sorotipo, clone e
tensão e até virulência potencial. Esses métodos são impraticáveis para a
diferenciação rotineira de coliformes, mas podem ser extremamente
útil em projetos de pesquisa, estudos epidemiológicos ou quando um
é necessária uma identificação definitiva.
Um dos métodos mais precisos para identificar um coliforme
isolado é uma sequência completa ou parcial do gene 16S rRNA que pode
ser feito por laboratórios pagos por serviço, que fornecerão dados de sequência
estratégica.9 Esses laboratórios muitas vezes podem identificar um coliforme
espécie com base na sequência dos primeiros 500 pares de bases em seu
gene 16S rRNA. Uma sequência completa do gene 16S rRNA é mais
preciso, mas muito mais caro. Normalmente, o comercial
laboratório processará a cultura, sequenciará seus genes e reunirá
um relatório de identificação com detalhes técnicos e uma figura mostrando a
posição da cultura submetida em relação à referência
tensões no banco de dados. O custo por teste pode depender do total
número de cepas submetidas e o “tempo de resposta” necessário.
A vantagem do sequenciamento do gene 16S rRNA é que ele
considera todas as Enterobacteriaceae, não apenas aquelas encontradas em
espécie clínica humana. Quando uma identificação definitiva é
necessário (por exemplo, em um processo judicial), esta pode ser a melhor
opção.
5. Referências
1. BRENNER, DJ & JJ FARMER, III. 2005. Família 1. Enterobacteriaceae. No Manual de
Bacteriologia Sistemática de Bergey, 2ª ed., Vol.
2: As Proteobactérias, Parte B: As Gammaproteobactérias. Springer,
Secaucus, Nova Jersey
9225 D. Meios, Reagentes e Procedimentos
Em testes de rotina de águas potáveis e residuais, a identificação
até à espécie ou estirpe não é uma prática comum. No entanto,
muitos laboratórios estão preocupados com a identificação bacteriana.
Não existe um “método padrão” para identificar Enterobacteriaceae (diferenciação
de coliformes); toda a identificação existente
os métodos simplesmente evoluíram ao longo de 100 anos. Da mesma forma, os
meios comerciais e os reagentes disponíveis também estão mudando ou sendo
modificado, portanto, tenha em mente o seguinte ao escolher a mídia,
reagentes e procedimentos.
Se identificar culturas de coliformes através de testes bioquímicos em tubos,
lembre-se de que há muitas variáveis envolvidas. Quando possível, utilize os meios
e métodos que acompanham o escolhido
“matriz de dados bioquímicos” ou “esquema de identificação”. Por exemplo, uma
referência1 regista as reacções de mais de 10 000
cepas de Enterobacteriaceae testadas no CDC em meios específicos
usando condições de teste específicas descritas em uma segunda referência.2
Por outro lado, os dados bioquímicos de Enterobacteriaceae
matriz gerada pelos laboratórios nacionais de referência da Inglaterra em
Colindale3,4 é baseado em um conjunto diferente de meios e métodos (o
métodos de Colindale).
https://doi.org/10.2105/SMWW.2882.196
2. AGRICULTOR, JJ, III, KD BOATWRIGHT & JM JANDA. 2007. Enterobac teriaceae:
Introdução e Identificação. No Manual de Clínica
Microbiologia, 9ª ed., Capítulo 42. Amer. Sociedade Microbiol. Imprensa,
Washington D. C
3. FARMER, JJ, III, MK FARMER & B. HOLMES. 2005. Enterobac teriaceae:
características gerais. Em Microbiologia e Infecções Microbianas de Topley & Wilson,
10ª ed., Vol. 2: Bacteriologia,
Capítulo 51. Hodder Arnold, Londres, Reino Unido
4. JANDA, JM & SL ABBOTT. 2006. As Enterobactérias, 2ª ed. Amer.
Sociedade Microbiol. Imprensa, Washington, DC.
5. FARMER, JJ, III, MA ASBURY, EW HICKMAN, DJ BRENNER E O
GRUPO DE ESTUDO DE ENTEROBACTERIACEAE . 1980. Enterobacter sakazakii: UMA
novas espécies de “Enterobacteriaceae” isoladas de amostras clínicas. Int. J. Syst.
Bacteriol. 30:569.
6. HOLMES, B. & M. COSTAS. 1992. Identificação de Enterobacteriaceae
por métodos informatizados. Em Métodos de Identificação em Aplicados e
Microbiologia Ambiental. Publicação Científica Blackwell, Oxford,
Inglaterra.
7. O'HARA, CM 2005. Instrumentação manual e automatizada para
identificação de Enterobacteriaceae e outros bacilos Gram-negativos aeróbios. Clin.
Microbiol. Apocalipse 18:147.
8. CARROLL, KC & MP WEINSTEIN. 2007. Manual e automatizado
sistemas para detecção e identificação de microrganismos. em
Manual de Microbiologia Clínica, 9ª ed., Capítulo 15. Amer. Soc.
Microbiol., Washington, DC.
9. WOO, PC, KH NG, SK LAU, KT YIP, AM FUNG, KW LEUNG,
DM TAM, TL QUE & KY YUEN. 2003. Utilidade do MicroSeq
Sistema de identificação bacteriana baseado em DNA ribossômico 500 16S para
identificação de isolados bacterianos clinicamente significativos com perfis bioquímicos
ambíguos. J. Clin. Microbiol. 41:1996.
6. Bibliografia
IVERSEN, C., L. LANCASHIRE, M. WADDINGTON, S. FORSYTHE & G. BALL.
2006. Identificação de Enterobacter sakazakii de espécies intimamente relacionadas
espécies: o uso de redes neurais artificiais na análise de
dados bioquímicos e 16sDNA. Microbiol BMC. 6:28.
A seguir estão os meios e métodos tradicionalmente usados; no entanto, não
existe uma matriz de dados bioquímicos ou “esquema de identificação de coliformes”
que os acompanhe. Use mídia comercial
e reagentes para melhorar a consistência da mídia, reduzir custos de mão de obra,
e aumentar a qualidade. Incluir controles negativos e positivos usando
culturas de estoque conhecidas para garantir precisão e confiabilidade contínuas.
Siga as orientações de CQ na Seção 9020B para preparação de mídia, manuseio
e condições de armazenamento.
1. Testes de fermentação de lactose, sorbitol e celobiose
Suspender 16 g de caldo de fenol vermelho base e 5 g do caldo selecionado
carboidrato (lactose, sorbitol ou celabiose) em 1 L de água grau reagente e mexa
para dissolver completamente. Dispensar em tubos,
enchendo cada tubo até um terço do seu comprimento. Depois coloque um pequeno
frasco invertido (tubo Durham) no tubo para determinar a produção de gás. Fechar
os tubos e esterilizar a 121°C durante 12 a 15 min.
Armazene os tubos no escuro (preferencialmente refrigeração) e descarte se
o meio fica descolorido ou a evaporação excede 10% do
volume.
4
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DIFERENCIAÇÃO DE BACTÉRIAS COLIFORMES (9225)/Meio, Reagentes e Procedimentos

Para realizar um teste, inocular um tubo com uma alça cheia de crescimento de
uma colônia bem isolada ou inclinada e incubar por 24 a 48 horas a 35 ± 0,5°C. A
fermentação de carboidratos (produção de ácido) diminuirá o pH, fazendo com que o
indicador de pH do vermelho de fenol mude de vermelho-laranja para amarelo (pH 6,6).
Alternativamente, para fermentação da lactose, caldo lauril triptose (Seção 9221B.3a)
pode ser usado.
para. Reagentes:
1) Meio – Use caldo de glicose tamponado. Dissolva 7,0 g de peptona de proteose
ou peptona equivalente, 5,0 g de glicose e 5,0 g de hidrogenofosfato dipotássico
(K2HPO4) em 1 L de água grau reagente. Dispense em porções de 5 mL em tubos de
ensaio e esterilize em autoclave a 121°C por 12 a 15 minutos, certificando-se de que o
tempo total de exposição ao calor não seja superior a 30 minutos.

2) Solução indicadora – Dissolva 0,1 g de vermelho de metila em 300 mL de álcool

etílico a 95% e dilua para 500 mL com água grau reagente. CUIDADO: O álcool
2. Orto-nitrofenil--D-galactopiranosídeo (ONPG)
etílico é inflamável.
Hidrólise
b. Procedimento: Inocular porções de 10 mL de meio de uma cultura pura. Incubar
a 35 0,5°C durante 5 dias. Em seguida, adicione 5 gotas da solução indicadora de
Este teste procura a enzima -galactopiranosidase através da hidrólise do substrato
vermelho de metila a 5 mL da cultura e leia imediatamente.
o-nitrofenil--D-galactopiranosídeo.
Use um dos numerosos kits e discos de teste comerciais disponíveis ou um meio
Um período de incubação de 48 horas é adequado para a maioria das culturas, mas
contendo ONPG (Seção 9223).
não incube por menos de 48 horas. Se os resultados do teste forem ambíguos às 48
Para realizar o teste, inocular 10 mL de caldo ONPG com uma grande alça cheia
horas, repetir com culturas incubadas durante 4 ou 5 dias. Nesses casos, incubar
de crescimento a partir de uma inclinação e incubar a 35 ± 0,5°C por até 24 horas. Se
culturas duplicadas entre 22 e 25°C. Testar a cultura por meio de 2, 3, 4 e 5 dias pode
o meio desenvolver uma cor amarela – comparado a um tubo não inoculado ou
fornecer resultados positivos mais cedo.
(preferencialmente) a um tubo inoculado com uma cultura negativa para ONPG – os
Os resultados são positivos se a amostra for nitidamente vermelha, negativos se for
resultados serão positivos.
distintamente amarelo e questionável se a cor for um tom misto.
Interprete os testes de organismos com pigmentação amarela com cautela.

6. Teste Voges-Proskauer
3. Outros ensaios cromogênicos para -galactopiranosidase
O teste Voges – Proskauer mede a capacidade dos organismos de produzir um
O teste de hidrossíntese de vermelho de clorofenol-D-galactopiranosídeo (CPRG) produto neutro (acetoína ou acetil metilcarbinol) por meio da fermentação da glicose.
é semelhante ao teste ONPG, exceto que a cor de um resultado positivo é vermelha a para. Reagentes: 1) Meio –
magenta. Da mesma forma, X-Gal (5-bromo-4- cloro-3-indolil--D-galactopiranodise) é Ver 9225D.4a1).
hidrolisado por -galactopiranosidase para produzir um produto azul.
2) Solução de naftol – Dissolva 5 g de naftol purificado (ponto de fusão 92,5°C ou
superior) em 100 mL de álcool etílico absoluto.
Quando armazenada entre 5 e 10°C, esta solução é estável por 2 semanas.
4. Teste da Natureza
CUIDADO: O álcool etílico é inflamável.
3) Hidróxido de potássio, 7N – Dissolva 40 g de KOH em 100 mL
O indol é um produto do metabolismo do triptofano. para.
água de grau reagente.
Reagentes: 1)
b. Procedimento: Inocular 5 mL de meio e incubar por 48 horas a 35 0,5°C. A 1 mL
Meio – Use caldo de triptofano. Dissolva 10,0 g de triptona ou tripticase por L de
de cultura, adicione 0,6 mL de solução de naftol e 0,2 mL de solução de KOH. Agite
água grau reagente. Distribua o meio em porções de 5 mL em tubos de ensaio e
bem após adicionar cada reagente.
esterilize.
Os resultados são positivos se uma cor rosa a carmesim se desenvolver na superfície
2) Reagente de Kovac – Dissolva 5 g de p-dimetilaminobenzaldeído em 75 mL de
dentro de 5 min. Não leia depois de 10 min. Desconsidere os tubos que desenvolvem
álcool isoamílico (ou amílico normal), grau ACS, e adicione 25 mL de HCl concentrado.
uma cor cobre, pois isso representa um resultado negativo.
CUIDADO: Os reagentes são inflamáveis e corrosivos. O reagente deve ser
amarelo.
7. Teste de citrato de Simmons
O pH da solução de álcool amílico deve ser 6,0. Compre álcool amílico e benzaldeído
em quantidades tão pequenas quanto consistentes com o volume de trabalho a ser
O teste do citrato mede a capacidade de uma bactéria de usar o citrato como única
realizado. b. Procedimento: Inocular porções de 5 mL de caldo
fonte de carbono, usando o azul de bromotimol como indicador de pH. para. Meio:
de triptofano
Use ágar citrato de Simmons. Para fazer ágar citrato de Simmons, adicione 0,2 g
meio de uma cultura pura e incubar a 35 0,5°C por 24 2 h. Adicione 0,2 a 0,3 mL
de MgSO4 · 7H2O, 1,0 g de dihidrogenofosfato de amônio (NH4H2PO4), 1,0 g de
de reagente de teste de Kovac e agite suavemente.
K2HPO4, 2,0 g de citrato de sódio di-hidratado, 5,0 g de NaCl, 15,0 g de ágar e 0,08 g
Deixe repousar por cerca de 10 minutos e observe os resultados.
de azul de bromo mol a 1 L água de grau reagente. Autoclave a 121°C por 12 a 15
Os resultados são positivos se a camada superficial de álcool amílico for de cor
min e resfrie os tubos em um ângulo para formar um ágar inclinado. O pH final após a
vermelha escura; os resultados serão negativos se a camada permanecer amarela.
esterilização é 6,8 0,2.
Uma cor laranja provavelmente indica a presença de escatol (um produto de
decomposição do triptofano), mas não é indol. Registre como um resultado variável.
b. Procedimento: Inocular o meio ágar através da técnica de estrias usando um
inóculo leve.
Incubar 48 horas a 35 0,5°C. O meio não inoculado é de cor verde. Os resultados
5. Teste de vermelho de metila são positivos quando o meio desenvolve uma cor azul; isso indica o metabolismo do
citrato e a produção de subprodutos alcalinos. Os resultados são negativos se não
O teste do vermelho de metila mede a capacidade dos organismos de produzir houver alteração de cor.
produtos finais ácidos estáveis através da fermentação da glicose.

https://doi.org/10.2105/SMWW.2882.196 5
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DIFERENCIAÇÃO DE BACTÉRIAS COLIFORMES (9225)/Meio, Reagentes e Procedimentos
8. Teste de motilidade
O teste de motilidade mede se um organismo é móvel em um
meio semissólido.
para. Meio: Adicione 3,0 g de extrato de carne bovina, 10,0 g de peptona, 5,0 g de
NaCl e 4,0 g de ágar a 1 L de água de grau reagente. Ajuste o pH para 7,4, distribua
porções de 3 mL em tubos de 13 a 100 mm ou porções de 8 mL em tubos de 16 a 125
mm e esterilize. b. Procedimento: Inocular perfurando uma
agulha de inoculação com 5 mm de profundidade no centro do meio. Incubar
durante 1 a 2 dias a 35°C. Se os resultados forem negativos, incubar mais 5 dias entre
22 e 25°C.
Os resultados são positivos se houver crescimento difuso no meio a partir do ponto
de inoculação. Os resultados são negativos se o crescimento for visível apenas ao
longo da linha de estabilização e o meio circundante permanecer claro.
Alternativamente, prepare o meio sem ágar e examine uma cultura jovem através
da técnica de deslizamento suspenso para organismos móveis. Examine imediatamente
a lâmina de montagem úmida; não deixe secar.
9. Testes de Lisina e Ornitina Descarboxilase
Este procedimento testa a capacidade das bactérias de metabolizar (descar
boxilato) os aminoácidos lisina e ornitina. O uso de meio preparado comercialmente
é preferido para fins de CQ. para. Reagentes: 1) Meio – Utilize um meio
basal preparado
de acordo com os métodos Moeller ou Falkow. O método Moeller envolve
dissolvendo 5,0 g de peptona (Orthana especial, tiotona ou equivalente), 5,0 g de
extrato de carne bovina, 0,625 mL de roxo de bromocresol (1,6%), 2,5 mL de vermelho
de cresol (0,2%), 0,5 g de glicose e 5,0 mg de piridoxal em 1 L de água grau reagente
e ajuste para pH 6,0 a 6,5. O método Falkow envolve a dissolução de 5,0 g de peptona,
3,0 g de extrato de levedura, 1,0 g de glicose e 1,0 mL de púrpura de bromocresol
(1,6%) em 1 L de água grau reagente e ajuste para pH 6,7 a 6,8.
Para qualquer teste de descarboxilase, divida em três porções: não faça nenhuma
adição à primeira porção (o controle), adicione dicloridrato de L-lisina suficiente à
segunda porção para fazer uma solução a 1% e adicione dicloridrato de L-ornitina
suficiente à terceira para faça uma solução a 1% (para o método Falkow, adicione
apenas 0,5% do L-aminoácido). Após adicionar ornitina, reajuste o pH do meio para
6,0 0,2. Dispense em porções de 3 a 4 mL em tubos de ensaio com tampa de rosca e
esterilize em autoclave a 121°C por 10 min. Um precipitado flocular no meio ornitina
não interfere no seu uso.
2) Óleo mineral —Use óleo mineral esterilizado em autoclave em
121°C por 30 a 60 min, dependendo do tamanho do recipiente.
b. Procedimento: Inocular levemente cada meio, adicionar uma camada de óleo
mineral com aproximadamente 10 mm de espessura para promover a fermentação,
fechar as tampas e incubar a 35 a 37°C por até 4 dias.
Navegue pelos tubos diariamente. Os resultados são positivos se a cor mudar de
amarelo para violeta ou violeta-avermelhado, fracamente positivos se a cor mudar para
cinza azulado e negativos se a cor permanecer amarela (inalterada). Para uma cultura
fracamente positiva, pode-se adicionar uma gota de púrpura de bromocresol. Se a cor
não mudar, é considerado um teste negativo.
https://doi.org/10.2105/SMWW.2882.196
10. Teste de oxidase
O teste de oxidase determina a presença de enzimas oxidase.
As bactérias coliformes são negativas para a oxidase.
para. Reagentes:
1) Meio – Use placas de ágar nutriente ou ágar tríptico de soja para semear culturas
e produzir colônias isoladas. Destes, obtenha o inóculo para teste de oxidase em papel
de filtro impregnado.
As culturas devem ter menos de 24 horas. Não utilize nenhum meio que inclua
carboidrato em sua formulação. Use apenas ágar tríptico de soja se o reagente for
derramado nas colônias.
Tríptico estou ágar:
Tripton.................................................. ....................................15,0 g
Soytone.......... .................................................. ............................5,0 g
Cloreto de sódio (NaCl).............. . .................................................. 5,0
g de ágar ................................................ . ...........................................15,0
g de grau reagente água ................................................... ...................1,0L
O pH deve ser de 7,3 0,2 após a esterilização.
2) Dicloridrato de tetrametil p-fenilenodiamina, solução aquosa a 1% - preparada
na hora ou refrigerada por no máximo 1 semana. Impregne uma tira de papel de filtro*
com esta solução. Alternativamente, prepare uma solução a 1% de cloridrato de dimetil
p-fenilenodiamina. As ampolas de reagentes descartáveis disponíveis comercialmente
são convenientes e econômicas, mas use-as com cautela. Este reagente também está
disponível em pequenos frascos conta-gotas, com os quais o analista pode adicionar
1 a 2 gotas ao papel de filtro. Use ágar tríptico de soja quando o reagente for aplicado
diretamente nas colônias, porque as placas de ágar nutriente fornecem resultados
inconsistentes; Ao espalhar uma porção de uma colônia colhida em papel de filtro
impregnado com reagente, não transfira nenhum meio com o material de cultura.
b. Procedimento: Remova parte da colônia da placa de ágar com um fio de platina,
um bastão aplicador de madeira ou plástico ou um bastão de vidro e espalhe na tira
de teste. Não use ferro ou outro fio reativo porque causará reações falso-positivas. Os
resultados são positivos se uma cor roxa escura se desenvolver dentro de 10 s. Teste
culturas positivas e negativas simultaneamente.
Se for usado reagente líquido, coloque-o nas colônias da placa de cultura. As colônias
oxidase-positivas desenvolvem uma cor rosa que se torna sucessivamente marrom,
vermelho escuro e, finalmente, preto.
11. Pigmento Amarelo
Observe colônias isoladas em placas ou placas de ágar tríptico de soja
(o ágar nutriente pode ser um substituto aceitável) incubado a 25-0,5°C por até 48
horas. A pigmentação geralmente se intensifica à medida que o tempo de incubação
avança.
12. Referências
1. AGRICULTOR, JJ, III, KD BOATWRIGHT & JM JANDA. 2007.
Enterobac teriaceae: Introdução e Identificação. No Manual de
Microbiologia Clínica, 9ª ed., Capítulo 42. Amer. Sociedade Microbiol.
Imprensa, Washington, DC.
* Whatman nº 1 ou equivalente.
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DIFERENCIAÇÃO DE BACTÉRIAS COLIFORMES (9225)/Relatório de Resultados
2. FARMER, JJ, III, MA ASBURY, EW HICKMAN, DJ BRENNER & O GRUPO
DE ESTUDO DE ENTEROBACTERIACEAE. 1980. Enterobacter sakazakii:
Uma nova espécie de “Enterobacteriaceae” isolada de espécies clínicas.
Int. J. Syst. Bacteriol. 30:569.
3. LAPAGE, SP, S. BASCOMB, WR WILLCOX & MA CURTIS. 1973.
Identificação de bactérias por computador: aspectos gerais e perspectivas.
J. Gen. Microbiol. 77:273.
4. HOLMES, B. & M. COSTAS. 1992. Identificação de Enterobacteriaceae
aceae por métodos computadorizados. Em Métodos de Identificação em
Microbiologia Aplicada e Ambiental. Blackwell Scientific Publ., Oxford,
Inglaterra.
9225 E. Relatório de Resultados
Relatórios redigidos com precisão são essenciais devido às limitações dos
métodos de identificação. Especifique o(s) método(s) utilizado(s) e forneça
comentários. Observe que a redação cuidadosa dos resultados não ajudará em
um teste não qualificado. Abaixo estão algumas possibilidades, com identificações
menos precisas fornecidas primeiro.
1. Identificação: Complexo Klebsiella – Raoultella
Klebsiella sp. a identificação é difícil. As duas espécies de
Raoultella foi anteriormente identificada como Klebsiella sp.
Comentário: Esta cultura deu uma “possível identificação” com base no seu
perfil de teste bioquímico determinado pelo sistema de identificação comercial
XYZ (47 testes bioquímicos). Mais testes seriam necessários para uma
identificação definitiva; entre em contato com o laboratório se for necessário.
2. Identificação: espécie Klebsiella
Comentário: A identificação foi baseada nos seguintes resultados de testes
de triagem:
•
cresceram como colônias mucóides grandes, rosadas, em ágar MacConkey
mais 30 g por mL de ampicilina;
• era um bastonete Gram-negativo com cápsulas grandes ao redor do
células; e
• era imóvel, positivo para lisina descarboxilase, negativo para arginina di
hidrolase e negativo para ornitina descarboxilase.
https://doi.org/10.2105/SMWW.2882.196
13. Bibliografia
O'HARA, CM 2005. Instrumentação manual e automatizada para identificação
de Enterobacteriaceae e outros bacilos Gram-negativos aeróbios. Clin.
Microbiol. Apocalipse 18:147.
AGÊNCIA DE PROTEÇÃO DA SAÚDE. 2007. Identificação de Enterobacteriaceae; Método
Padrão Nacional BSOP ID 16:2.
MURRAY, PR, ed. 2007. Manual de Microbiologia Clínica. Amer. Soc.
Microbiol. Imprensa, Washington, DC
AGÊNCIA DE PROTEÇÃO DA SAÚDE. 2010. Identificação de Enterobacteriaceae;
Método Padrão Nacional BSOP ID 16:3. http://www.hpastandard
methods.org.uk/documents/bsopid/pdf/bsopid16.pdf. Acessado em setembro
de 2011.
Todas estas são características típicas e definidoras das espécies de
Klebsiella.
3. Identificação: Klebsiella oxytoca
Comentário: “Identificação de alta probabilidade” baseada no perfil de teste
bioquímico determinado pelo sistema de identificação comercial ABC (21 testes
bioquímicos).
NOTA: Este sistema não é sensível e específico para diferentes
afetando todas as espécies do gênero Klebsiella.
4. Identificação: Klebsiella varícola
Comentário: Esta foi uma “identificação provável” baseada num perfil de teste
bioquímico determinado através do sistema de identificação comercial CDE (95
testes bioquímicos). Posteriormente, foi assinado por uma sequência parcial do
gene 16S rRNA (base 451) feita por um laboratório comercial (relatório em
anexo).
5. Identificação: Klebsiella terrigena
Comentário: Esta identificação é baseada em um teste PCR desenvolvido
pelo nosso laboratório com base em uma sequência do gene rpoB. Este teste
de pesquisa é sensível, específico para Klebsiella terrigena e diferencia outras
espécies de Klebsiella. Esses métodos e resultados serão publicados. Os
detalhes técnicos estão anexados a este relatório.
7