UNESP FACULDADE DE CINCIA E TECNOLOGIA FCT Campus de Presidente Prudente

Unesp

Relatrio de Bioqumica
PROTENAS:
REAES DE COLORAO E PRECIPITAO

Discentes: Gabriela Bitto de Oliveira Jos Carlos de Oliveira Junior Tamara Murisugi de Oliveira Docente: Profa. Dra. Maria de Lourdes Corradi C. Da Silva Disciplina: Bioqumica Curso: Engenharia Ambiental 2 ano

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ndice
Introduo ..............................................................................................................................2

Objetivos .................................................................................................................................5 Matrias Utilizados e Metodologias .....................................................................................6 Resultados e Discusses .........................................................................................................8 Concluso ..............................................................................................................................11 Bibliografia ..........................................................................................................................12

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1. INTRODUO As protenas so as molculas orgnicas mais abundantes e importantes nas clulas e perfazem 50% ou mais de seu peso seco. So encontradas em todas as partes de todas as clulas, uma vez que so fundamentais sob todos os aspectos da estrutura e funo celulares. Existem muitas espcies diferentes de protenas, cada uma especializada para uma funo biolgica diversa. Alm disso, a maior parte da informao gentica expressa pelas protenas. Pertencem classe dos peptdeos, pois so formadas por aminocidos ligados entre si por ligaes peptdicas. Uma ligao peptdica a unio do grupo amino (-NH 2 ) de um aminocido com o grupo carboxila (-COOH) de outro aminocido, atravs da formao de uma amida. So os constituintes bsicos da vida: tanto que seu nome deriva da palavra grega "proteios", que significa "em primeiro lugar". Nos animais, as protenas correspondem a cerca de 80% do peso dos msculos desidratados, cerca de 70% da pele e 90% do sangue seco. Mesmo nos vegetais as protenas esto presentes. A importncia das protenas, entretanto, est relacionada com suas funes no organismo, e no com sua quantidade. Todas as enzimas conhecidas, por exemplo, so protenas; muitas vezes, as enzimas existem em pores muito pequenas. Mesmo assim, estas substncias catalisam todas as reaes metablicas e capacitam aos organismos a construo de outras molculas - protenas, cidos nuclicos, carboidratos e lipdios - que so necessrias para a vida. O estudo de aspectos importantes da bioqumica nos leva, invariavelmente, ao estudo de protenas. Portanto, torna-se importante a existncia de mtodos adequados de purificao e quantificao destes compostos. A purificao e caracterizao de uma protena baseiam-se em suas caractersticas fsico-qumicas. Reaes de Colorao de Protenas Devido s ligaes peptdicas e presena de diferentes aminocidos, as protenas reagem com uma variedade de reagentes, formando produtos coloridos. Algumas reaes de colorao so especficas para aminocidos encontrados na composio das protenas, por exemplo: reao xantoproteca (tirosina, triptofano e fenilalamina), reao de Millon (tirosina), reao de HopkinsCole (triptofano), reao de Sakaguchi (arginina), etc. Estas reaes, so importantes tanto na deteco como na dosagem de aminocidos e protenas. Outras reaes, mais importantes, so aquelas chamadas de gerais, porque iro caracterizar grupamentos comuns a todas as protenas, ou seja, grupo amino e ligaes peptdicas. Teste com a Ninhidrina A reao da ninhidrina usada na deteco de aminocidos por ser caracterstica da funo
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amina primria. A ninidrina um poderoso agente oxidante que reage com -aminocidos, entre pH 4 e 8, originando um composto de cor prpura, que no apresenta sempre a mesma intensidade de colorao. Os aminocidos prolina e hidroxiprolina so excees, pois apresentam colorao amarela. Reao do Bureto A reao do biureto devida s ligaes peptdicas, dando positiva para protenas e peptdeos com trs ou mais resduos de aminocidos. A reao tambm positiva para as substncias que contm 2 grupos carbamnicos (-CO-NH2) ligados diretamente ou atravs de um nico tomo de carbono ou nitrognio. Este o caso do biureto que d reao positiva e de onde provm o nome da mesma. As protenas ou peptdeos, quando tratados por uma soluo de sulfato de cobre, em meio alcalino, do uma colorao violeta caracterstica. Precipitao de Protenas com Desnaturao As protenas possuem uma estrutura tridimensional bem definida que est relacionada com suas propriedades fsicas e biolgicas. A modificao na estrutura tridimensional nativa de uma protena, com a conseqente alterao de suas propriedades conhecida como desnaturao. A desnaturao envolve alteraes nas estruturas quaternria, terciria e secundria de protenas, mas no da primria. A desnaturao, usualmente decresce a solubilidade das protenas. A diminuio da solubilidade pode ser explicada pela exposio de radicais hidrofbicos e outros que prejudiquem a interao protena-gua e favoream a interao protena-protena. A desnaturao o evento primrio e importante. A floculao e a coagulao, que muitas vezes so confundidos com desnaturao de protenas, so simplesmente manifestaes visveis das alteraes estruturais causadas pelos agentes desnaturantes. Existem vrios agentes desnaturantes de protenas, tais como: calor, cidos, lcalis, solventes orgnicos, solues concentradas de uria e guanidina, detergentes, sais de metais pesados, etc. Entre as alteraes que se observam em decorrncia da desnaturao protica, pode-se citar: diminuio da solubilidade, perda de atividade biolgica (por exemplo, da ao enzimtica, da ao hormonal), aumento da reatividade de radicais da cadeia polipeptdica, alteraes na viscosidade e coeficiente de sedimentao, etc. A precipitao com desnaturao, alm de serem utilizadas para caraterizar a presena de protenas em soluo, tambm so teis para proceder a desprotenizao de lquidos biolgicos para anlise de componentes no proticos.

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Precipitao por Ao do Calor A estrutura terciria de uma protena mantida por interaes hidrofbicas entre os radicais apolares que se abrigam no meio aquoso, procurando se agruparem no interior do glbulo protico, pelas atraes inicas entre os radicais carregados com cargas opostas, pelas pontes dissulfeto, pontes de hidrognio, interaes hidrofbicas ou ainda pelas Foras de Van der Waals. Ao fornecer energia a um meio aquoso contendo protenas, atraes entre os radicais so desfeitas e a protena "desenrolada", expondo, ao meio aquoso seus radicais apolares que estavam contidos no seu interior. Isto que leva desnaturao. Precipitao por reao com os reagentes para alcalides Determinados agentes, como os reagentes para alcalides podem ser usados na precipitao de protenas, o que til na desproteinizao de materiais biolgicos, como o sangue: nions de cidos complexos (tricloroactico, tnico, fosfotngstico) formam sais insolveis onde a protena funciona como ction. Precipitao por Reao com Sais de Metais Pesados A adio de sais de metais pesados, tais como mercrio, chumbo, cobre e zinco, levam formao de sais denominados "quelatos" entre os aminocidos cidos e estes metais. A protena precipita porque estes sais so insolveis em gua e tambm porque, com a quebra das ligaes inicas, os aminocidos hidrofbicos ficam mais expostos ao meio aquoso. Precipitao por Ao de Solventes Orgnicos A adio de solventes orgnicos, como o etanol, ter etlico e acetona, s solues aquosas de protenas pode levar precipitao das mesmas. Isto pode ser explicado pelo fato destes solventes apresentarem uma constante dieltrica inferior da gua. Solventes orgnicos em baixas temperaturas (0 C ou menos) so teis para a separao de misturas proticas, porque as protenas podem ser precipitadas sem sofrerem desnaturao. Entretanto, a temperatura mais elevada, os solventes orgnicos podem levar desnaturao por romperem pontes de hidrognio e interaes apolares, importantes na manuteno da conformao protica. A gua tem uma alta constante dieltrica, assim a fora de atrao entre molculas proticas contendo radicais com cargas opostas baixa, predominando a interao protena-gua em vez da interao protena-protena. A adio de solventes, pode inverter esta situao, levando agregao e precipitao das molculas proticas.

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Solubilizao (Salting In) Efeito da Fora Inica sobre a Solubilidade das Protenas A capacidade dos sais neutros de influenciar a solubilidade das protenas, uma funo de sua fora inica, que tanto depende de sua concentrao como na valncia de ctions e nions que formam o sal. Em concentrao reduzida, os sais aumentam a solubilidade de muitas protenas, um fenmeno denominado salting-in, provavelmente devido interao da protena com os sais causando diminuio da interao protena-protena e, portanto, aumentando a solubilidade. Precipitao (Salting Out) Reaes de Precipitao sem Desnaturao As protenas podem ser precipitadas sem sofrer desnaturao por ao de solventes orgnicos, como foi explicado anteriormente, variao do pH e por alteraes da fora inica do meio. A variao do pH pode ser usada para precipitar protenas no seu ponto isoeltrico, pH no qual a repulso eletrosttica entre as molculas mnima. Este efeito denominado de saltingout. As protenas podem ser ressolubilizadas mantendo as suas caractersticas estruturais nativas por uma variao de pH acima ou abaixo do ponto isoeltrico.

2. OBJETIVOS Caracterizar a presena de protenas em material biolgico. Verificar experimentalmente a precipitao de protenas com e sem desnaturao. Relacionar as observaes prticas com a teoria de propriedades gerais, estrutura e isolamento de protenas.

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3. MATERIAIS UTILIZADOS E METODOLOGIAS Experimento 01 - Reaes de Colorao de Protenas Reao da ninhidrina Inicialmente, numerou-se dois tubos de ensaio, acrescentando-se no primeiro 2ml de soluo de ninhidrina com 5 gotas de protenas. Enquanto que no segundo tubo, foram colocadas 2ml de soluo de ninhidrina com 5 gotas de glicina. Ambos os tubos foram aquecidos na chama do bico de bunsen por dois minutos com agitao contnua. Reao do biureto Foram numerados trs tubos de ensaio, sendo que no primeiro colocou-se 1ml de soluo de protenas, 5 gotas de NaOH, 2,5M e 3 gotas de sulfato de cobre 1%. Enquanto que no segundo acrescentou-se 1ml de soluo de glicina com 5 gotas de NaOH 2,5M e 3 gotas de sulfato de cobre 1%. J no terceiro tubo, misturou-se gua destilada com 5 gotas de NaOH 2,5M e 3 gotas de sulfato de cobre 1%. Em todos os tubos foi observada a mudana de colorao das solues.

Experimento 02 Reaes de precipitao de protenas com desnaturao Reao de precipitao por aquecimento Colocou-se 2ml de soluo de protenas em um tubo de ensaio que foi aquecido diretamente na chama. Reao de precipitao com reagentes para alcalides Em um tubo de ensaio, colocou-se 1ml de soluo de protenas e de cido tricloroactico a 10% (TCA). Reao de precipitao com sais de metais pesados Adicionou-se 1ml de soluo de protenas e 1ml de acetato de chumbo a 5%. Reao de precipitao por ao de solventes orgnicos Em um tubo de ensaio acrescentou-se 1mL de soluo de protena e 2mL de lcool etlico.

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Experimento 03 Reaes de precipitao sem desnaturao Efeito da fora inica sobre a solubilidade da ovoglobulina Salting in Colocou-se 3mL de clara de ovo juntamente com 2mL de gua destilada em um bquer pequeno. Tal soluo foi agitada com um basto de vidro at o aparecimento de um precipitado . Em seguida, adicionou se soluo de cloreto de sdio cerca de 30 gotas - at redissoluo do precipitado. Salting out Com o auxlio de uma pipeta adicionou-se 2mL da soluo anterior (salting in) em um tubo de ensaio. Posteriormente, acrescentou-se 2mL de soluo saturada de sulfato de amnio at a percepo de um precipitado de protenas. Ento, juntou-se 4 a 6mL de gua destilada.

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4. RESULTADOS E DISCUSSES

Experimento 01 Reaes de colorao de protenas Reao da ninhidrina Aps o aquecimento de ambos os tubos de ensaio, observou-se que as solues adquiriram colorao violeta, sendo esta mais intensa no segundo tubo. Tendo em vista que tanto a glicina quanto a protena foram utilizadas com o mesmo volume, a diferena na intensidade da colorao de ambas as amostras deve-se a maior superfcie de contato do aminocido (glicina) que contm uma maior quantidade de grupamentos amina disponveis para reao. Porm, isso no ocorre com a protena em funo da presena de ligaes peptdicas entre seus aminocidos, diminuindo assim, sua superfcie de contato. importante ressaltar que houve erro grosseiro no fornecimento de calor aos tubos o que possivelmente influenciou a intensidade da cor. Reao do biureto Todos os tubos tiveram sua colorao inicial alterada aps a adio de sulfato de cobre (CuSO4). O primeiro tubo adquiriu colorao prpura; o segundo, azul claro e o terceiro adquiriu um tom levemente azulado. Uma vez que a reao do biureto caracterizada por identificar a presena de protenas e peptdeos com trs ou mais resduos de aminocidos, no qual uma substncia adicionada, o sulfato de cobre, interage com as ligaes peptdicas ,pode-se concluir que a primeira amostra adquire colorao prpura, devido a presena de protenas. J a segunda amostra, por conter somente aminocidos, no adquire colorao roxa, indicando assim a ausncia de ligaes peptdicas nessa, a qual apresenta colorao azulada semelhante terceira amostra que continha gua destilada.

Experimento 02 Reaes de precipitao de protenas com desnaturao Reao de precipitao por aquecimento Colocou-se 2ml de soluo de protenas em um tubo de ensaio que foi aquecido diretamente na chama. Nesse experimento, a formao do cogulo branco ocorre graas ao calor que, ao provocar a
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agitao trmica da molcula protica, rompe as interaes entre os tomos, afetando sua estrutura tridimensional e consequentemente, diminui a solubilidade da protena. Reao de precipitao com reagentes para alcalides Foi possvel identificar a formao de um precipitado esbranquiado e viscoso grudado na parede do tubo logo que se adicionou o cido tricloroactico (TCA). Nesse experimento, o sal serve como ponte/interage entre a protena e o meio, auxiliando assim, as interaes protena-gua. O fato de se adicionar cido tricloroactico soluo de protenas, reduz o ph do meio, tornando positiva a carga da protena, o que contribui para a formao de um complexo insolvel o tricloroacetato de protena. Alm disso, vale ressaltar que o sal atua como uma ponte entre a protena e o meio. Adicionando-se o cido, diminui a concentrao de sal e a interao protena-gua. Reao de precipitao com sais de metais pesados Observou-se pequenos precipitados semelhantes a fios brancos na soluo. O acetato de chumbo ,na soluo protica, dissocia-se, liberando seus ctions e torna o meio alcalino. Essa caracterstica do meio pH situado no lado alcalino do ponto isoeltrico das protenas - favorvel combinao de algumas protenas com os ctions do sal, formando proteinatos insolveis. Reao de precipitao por ao de solventes orgnicos Formou-se uma mistura esbranquiada. A interao protena-gua maior que a interao protena-proteina devido baixa fora de atrao entre as molculas proticas, fazendo com que a protena se solubilize na gua. Com a adio do lcool etlico (solvente orgnico) na gua, ocorre sua solubilizao, rompendo as interaoes protena-gua, proporcionando a interao protena-protena; o fato de a temperatura estar elevada (temperatura ambiente) leva sua desnaturao devido quebra das pontes de hidrognio e interaes apolares, importantes na manuteno da estrutura protica.

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Experimento 03 Reaes de precipitao sem desnaturao Efeito da fora inica sobre a solubilidade da ovoglobulina Salting in: Aps agitao da soluo de gua destilada e clara de ovo, formou-se um precipitado (globulinas) semelhantes a pontos brancos na soluo. Com a adio de 30 gotas de soluo de cloreto de sdio, houve a redissoluao desse precipitado. Salting out: Formou-se duas fases: a de baixo era esbranquiada e a de cima, transparente. Ento, aps o acrscimo de 4 a 6mL de gua destilada houve a redissoluo desse precipitado Tais fenmenos esto relacionados precipitao da protena sem que ocorra a sua desnaturao. O salting in d-se pela solubilizao do precipitado elevando-se a concentrao de sais no meio e tambm as interaes protena-gua. Enquanto o salting out corresponde precipitao da protena atravs da adio de sais com alta fora inica (sais higroscpicos) que ligam-se a gua, havendo a predominncia da interao protena-protena. Nesse caso, analisando-se as duas fases formadas, a primeira esbranquiada corresponde s primeiras protenas a se precipitarem, as globulinas. J a poro transparente refere-se gua. importante ressaltar que a precipitao de protenas pela alta concentrao de sais um processo muito importante para a separao de misturas complexas de protenas, uma vez que a concentrao de sal necessria para precipitar diferentes protenas varivel.

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5. CONCLUSO As reaes de colorao e precipitao (com ou sem desnaturao) de protenas permitem a caracterizao dessas pela anlise de suas propriedades qumicas e fsicas, entre elas, a presena de ligaes peptdicas, estrutura molecular, solubilidade, fora inica e concentrao molar. A deteco de protenas em materiais biolgicos envolve reaes especificas com determinados reativos, os quais originam substncias coloridas que absorvem luz na regio visvel, permitindo a sua quantificao. No entanto, as reaes de colorao no alteram a estrutura tridimensional da protena, ao contrrio das reaes de precipitao que podem alterar as estruturas quaternrias, tercirias e secundrias das protenas como as reaes por ao trmica, presena de alcalides, sais de metais pesados e solventes orgnicos. J as reaes denominadas Salting-in e Salting-out precipitam o material sem a desnaturao. Apesar de alguns erros grosseiros quanto manipulao dos aparelhos, todos os resultados atingiram as caractersticas pr-estabelecidas pelos conceitos tericos.

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6. BIBLIOGRAFIA Fuly , Andr Lopes. Roteiros de Aulas Prticas. Universidade Federal Fluminense. Rio de Janeiro, 2007. Kehl, Anderson & Langbeck, Carmem. Caracterizao de Protenas. Centro Federal de Educao Tecnolgica do Amazonas. Manaus, 2008. Lehninger, A. Lester. Fundamentos de Bioqumica. 4 ed. So Paulo: Sarvier, 2006. Moreira, Ana Beatriz & Gonalvez, Joaquim. Processos de desnaturao protica. Universidade do Porto, 2008.

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