Validacao em Analises Quimicas Fundamentos e Aplicacoes

Validação em Análises Químicas
Fundamentos e Aplicações
Brasília-DF.
Elaboração
Dra. Jéssica Bernegossi
Produção
Equipe Técnica de Avaliação, Revisão Linguística e Editoração

Sumário
APRESENTAÇÃO.................................................................................................................................. 4
ORGANIZAÇÃO DO CADERNO DE ESTUDOS E PESQUISA..................................................................... 5
INTRODUÇÃO.................................................................................................................................... 7
UNIDADE I
VALIDAÇÃO......................................................................................................................................... 11
CAPÍTULO 1
VALIDAÇÃO EM ANÁLISES QUÍMICAS E A QUALIDADE.............................................................. 11
CAPÍTULO 2
AMOSTRAGEM........................................................................................................................ 28
CAPÍTULO 3
DOMÍNIO DA ANÁLISE............................................................................................................. 39
UNIDADE II
PARÂMETROS NA VALIDAÇÃO............................................................................................................... 60
CAPÍTULO 1
OS PARÂMETROS..................................................................................................................... 60
UNIDADE III
ANÁLISE DE DADOS.............................................................................................................................. 73
CAPÍTULO 1
PRINCÍPIOS DA ANÁLISE DOS DADOS...................................................................................... 73
UNIDADE IV
CHECAGEM DA CALIBRAÇÃO............................................................................................................ 100
CAPÍTULO 1
TESTES DE VERIFICAÇÃO DE CALIBRAÇÃO............................................................................. 100
UNIDADE V
INCERTEZAS....................................................................................................................................... 112
CAPÍTULO 1
INCERTEZAS DE MEDIÇÃO..................................................................................................... 112
CAPÍTULO 2
IMPUREZAS E PRODUTOS DE DEGRADAÇÃO.......................................................................... 117
UNIDADE VI
QUÍMICA VERDE................................................................................................................................. 126
CAPÍTULO 1
CONCEITOS DA QUÍMICA VERDE.......................................................................................... 126
REFERÊNCIAS................................................................................................................................. 131
Apresentação
Caro aluno
A proposta editorial deste Caderno de Estudos e Pesquisa reúne elementos que se

entendem necessários para o desenvolvimento do estudo com segurança e qualidade.
Caracteriza-se pela atualidade, dinâmica e pertinência de seu conteúdo, bem como
pela interatividade e modernidade de sua estrutura formal, adequadas à metodologia
da Educação a Distância – EaD.
Pretende-se, com este material, levá-lo à reflexão e à compreensão da

pluralidade dos conhecimentos a serem oferecidos, possibilitando-lhe ampliar
conceitos específicos da área e atuar de forma competente e conscienciosa,
como convém ao profissional que busca a formação continuada para vencer os
desafios que a evolução científico-tecnológica impõe ao mundo contemporâneo.
Elaborou-se a presente publicação com a intenção de torná-la subsídio valioso, de

modo a facilitar sua caminhada na trajetória a ser percorrida tanto na vida pessoal
quanto na profissional. Utilize-a como instrumento para seu sucesso na carreira.
Conselho Editorial
4
Organização do Caderno
de Estudos e Pesquisa
Para facilitar seu estudo, os conteúdos são organizados em unidades, subdivididas em

capítulos, de forma didática, objetiva e coerente. Eles serão abordados por meio de textos
básicos, com questões para reflexão, entre outros recursos editoriais que visam tornar
sua leitura mais agradável. Ao final, serão indicadas, também, fontes de consulta para
aprofundar seus estudos com leituras e pesquisas complementares.
A seguir, apresentamos uma breve descrição dos ícones utilizados na organização

dos Cadernos de Estudos e Pesquisa.
Provocação
Textos que buscam instigar o aluno a refletir sobre determinado assunto antes
mesmo de iniciar sua leitura ou após algum trecho pertinente para o autor
conteudista.
Para refletir
Questões inseridas no decorrer do estudo a fim de que o aluno faça uma pausa e
reflita sobre o conteúdo estudado ou temas que o ajudem em seu raciocínio.
É importante que ele verifique seus conhecimentos, suas experiências e seus
sentimentos. As reflexões são o ponto de partida para a construção de suas
conclusões.
Sugestão de estudo complementar
Sugestões de leituras adicionais, filmes e sites para aprofundamento do estudo,

discussões em fóruns ou encontros presenciais quando for o caso.
Atenção
Chamadas para alertar detalhes/tópicos importantes que contribuam para a

síntese/conclusão do assunto abordado.
5
Saiba mais
Informações complementares para elucidar a construção das sínteses/conclusões

sobre o assunto abordado.
Sintetizando
Trecho que busca resumir informações relevantes do conteúdo, facilitando o

entendimento pelo aluno sobre trechos mais complexos.
Para (não) finalizar
Texto integrador, ao final do módulo, que motiva o aluno a continuar a

aprendizagem ou estimula ponderações complementares sobre o módulo
estudado.
6
Introdução
Quando se fala em “análises químicas”, automaticamente assimila-se a ideia de

geração de dados coletados por meio de medições e, consequentemente, seu posterior
tratamento e análise estatística. Deve-se juntamente com esse raciocínio ter em mente
que tais dados devem apresentar confiabilidade, de modo que permitam tomadas de
decisões concretas embasadas neles. Caso contrário, pode-se arruinar toda uma etapa
de do processo, o que diretamente refletirá em prejuízos financeiros irrecuperáveis.
Tendo em vista essa situação, são exigidos que os métodos utilizados para a geração
de dados sejam avaliados com muito critério. Essa avaliação, de como são obtidos
os dados, é chamada de validação. A validação em análises químicas é um processo
indispensável e que tem sido vastamente discutido na comunidade acadêmica,
indústrias e órgãos reguladores de diversos países (PEREZ, 2010).
Na prática, pensando na validação de um método, por exemplo, diversos são os fatores

que podem ser influenciados como as condições do ambiente (temperatura, umidade,
etc.), diferentes lotes de reagentes, equipamentos, analista, dentre outros. Com isso,
fica evidente que é de extrema importância que o método, antes de ser utilizado em
qualquer outra oportunidade, seja validado. Para que a validação seja estabelecida,
é necessário que os dados sejam devidamente documentados, de forma que esses
estejam em concordância com as características de qualidade preestabelecidas
(CAZEDEY, 2012).
Há basicamente alguns tipos de validação, os quais são chamados de prospectiva:

simultânea, retrospectiva ou revalidação. Escolhe-se o tipo de validação a ser
executado de acordo com a situação e cenário em que se apresenta o processo. Há
algumas condições para o início de uma validação, partindo do princípio de que
deve ser detalhadamente planejada. A busca incessante de informações deve ser
objetivada, consequentemente, estudos prévios como, por exemplo, em uma validação
de processo produtivo de medicamentos, a compatibilidade entre os componentes
da formulação deve ser avaliada, a realização de um estudo de pré-formulação e de
estabilidade, dentre outros ensaios que fornecem embasamentos para o início de uma
validação (BRASIL, 2010).
Diretrizes são usadas como fonte de recomendações e orientação quanto aos

procedimentos e métodos considerados satisfatórios, tais como guias da Agência
7
Nacional de Vigilância Sanitária, Food and Drug Administration, Farmacopeia
americana, International Conference on Harmonisation. Os parâmetros avaliados
numa validação de método analítico, por exemplo, são linearidade, seletividade,
precisão, exatidão, robustez, limite de detecção (LD) e limite de quantificação (LQ)
(BRASIL 2017a).
Existem agências que, por meio de normas e orientações, direcionam o

credenciamento dos laboratórios no país. Essas são a Agência Nacional de Vigilância
Sanitária (ANVISA), que é vinculada ao Ministério da Saúde, e o Instituto Nacional
de Metrologia, Normalização e Qualidade Industrial (INMETRO). A Resolução da
Diretoria Colegiada da ANVISA que estabelece os critérios para uma validação de
métodos analíticos é a RDC nº 166, de 24 de julho de 2017. Além de dar orientações
quanto à sistemática de validação de métodos analíticos, impõe outras determinações
a serem cumpridas em insumos farmacêuticos, medicamentos e produtos biológicos
em todas as suas etapas de produção. Caso alguma(s) das orientações e normas não
sejam satisfeitas, deverão ser obrigatoriamente esclarecidas tecnicamente para
posterior julgamento da agência regulamentadora. De fundamento orientativo,
o INMETRO disponibiliza, de maneira contínua e atualizada, um módulo de
Coordenação Geral de Acreditação sobre validação de métodos analíticos (BRASIL,
2017a; INMETRO, 2018a).
Como já citado brevemente, o analista tem relação direta com o sucesso da validação.
O treinamento do pessoal é imprescindível, para isso é necessário investir em
treinamentos, cursos e discussões entre a equipe para a troca de experiência e
informações relevantes. Além disso, um pessoal bem qualificado tem a capacidade
de minimizar custos analíticos, reduzir os limites de sensibilidade e justificar os
resultados omitidos com embasamento químico, físico, estatístico entre outros.
Atualmente, o analista deve ter como conceito sedimentado a química verde. O

conceito de química verde surgiu com um acidente nos Estados Unidos, no ano de
1984. Depois do acontecido, as leis estabelecidas pela Agência de Proteção Ambiental
sobre as indústrias químicas se tornaram mais rígidas e, desde então, as indústrias
químicas estão cada vez mais preocupadas em diminuir a liberação de resíduos
tóxicos no meio ambiente. Químicos norte-americanos estipularam etapas para o
desenvolvimento de reações químicas menos tóxicas, devido à preocupação com
o meio ambiente e a qualidade de vida, chamadas de “Doze princípios da Química
Verde”.
8
Espera-se que o analista esteja apto a implementar alternativas aos métodos químicos
analíticos e de produção frequentemente utilizados, buscando incessantemente por
métodos que apresentem menores prejuízos possíveis ao meio ambiente. Em suma,
vale a reflexão de LEITE (2008, p. 26), o qual diz que “Não ter validação é apenas um
número, não um resultado”.
A seguir, serão abordadas detalhadamente as bases e aplicações de validação em

análises químicas.
Objetivos
»» Compreender a importância da validação em análises químicas.
»» Reconhecer a função das agências regulatórias.
»» Avaliar os critérios dos processos de uma validação.
9
10
VALIDAÇÃO UNIDADE I
CAPÍTULO 1
Validação em análises químicas e a
qualidade
Métodos analíticos
Pode-se afirmar que método analítico é um conjunto de operações e técnicas utilizado
com o empenho de se determinar o analito de interesse. Atualmente, observa-se uma
primordialidade em apresentar a confiabilidade das análises químicas, de maneira a
evidenciar a qualidade do determinado processo. Caso contrário, se o método analítico
não se apresentar com a devida qualidade exigida, o reflexo será com certeza de
insucesso total da análise, uma vez que serão tomados como verdadeiros os resultados
inadequados. Com essa inferência em dados analíticos enganosos, advindo de análises
químicas imperfeitas, ocasionam-se gastos, dispêndios exorbitantes e irremediáveis
(LA ROCA et al., 2007).
Pode-se classificar os métodos como clássicos ou instrumentais.
Métodos clássicos
Os métodos clássicos estabelecem resultados por meio de massas ou volumes,

determinados experimentalmente, juntamente com massas atômicas ou moleculares
e reações bem definidas (MATOS, 2013a). A seguir, na Figura 1, estão representados
alguns exemplos de métodos clássicos.
11
UNIDADE I │ VALIDAÇÃO
Figura 1. Exemplos de métodos clássicos.
Métodos clássicos
Análise gravimétrica Titulações
Fonte: (CAZEDEY, 2017).
Pode-se observar algumas vantagens em se utilizar métodos clássicos de análise,

dentre elas:
»» A simplicidade na sua execução;
»» A exatidão;
»» A precisão;
»» Menor custo;
»» Baixo tempo de análise;
»» Baixa geração de resíduos.
E, ainda, devem ser consideradas algumas desvantagens como:
»» Ponto de viragem de uma titulação.
»» Consumo de maior quantidade de amostra para a realização das

análises.
Métodos instrumentais
Já os métodos instrumentais são caracterizados capazes de detectar, por meio de um

instrumento, sinais emitidos pelo analito de modo a identificá-lo ou quantificá-lo em
uma amostra (MATOS, 2013a). A seguir, na Figura 2, estão listados alguns exemplos
de métodos instrumentais mais comumente utilizados.
12
VALIDAÇÃO │ UNIDADE I
Figura 2. Exemplos de métodos instrumentais.
Métodos instrumentais
Técnicas de Técnicas Técnicas

Outras técnicas
separação espectroscópicas eletroquímicas
Cromatografia Espectroscopia
Espectrometria
gasosa, molecular,
cromatografia de massas,
espectroscopia Potenciometria e
líquida e métodos térmicos
atômica e voltametria
e análise de
eletroforese ressonância
capilar superfície
magnética nuclear
Fonte: (MATOS, 2013a).
Algumas vantagens que podem ser observadas ao se utilizar métodos instrumentais:
»» Maior sensibilidade.
»» A exatidão.
»» A precisão.
»» Menor quantidade de amostra.
E também é possível observar algumas desvantagens:
»» Custo elevado.
»» O tempo de análise é considerado de médio a alto;
»» Necessidade de treinamento do analista;
»» Maior geração de resíduo.
Por fim, ressalta-se que qualquer tipo de método analítico para ser considerado um
método capaz de originar resultados confiáveis quanto à amostra analisada deve
passar por uma prova que o certifique como tal, chamada de validação (LIMA et al.,
2006).
13
A importância da validação de métodos

analíticos
A validação é um processo de várias etapas, a qual se faz necessária para que haja
a elaboração de um documento que comprove que uma determinada medição
química, processo, método ou equipamento indique uma qualidade almejada. Para
isso, ela é investigada por meio de comparabilidade, rastreabilidade e confiabilidade
(RIBANI et al., 2004). Ou seja, validar é certificar que o produto, processo, método
ou equipamento apresente qualidade constante dentro do estabelecido (VALENTINI
et al., 2007).
Mas por onde começar? Para o início de uma validação, é importante que ela seja
delineada visando obter dados confiáveis para posteriormente serem tratados e
analisados. Como estamos falando de validação em análises químicas, vamos partir
do pressuposto, no decorrer deste capítulo, de uma validação de método analítico, que
mais comumente se faz na rotina laboratorial. Quando pensamos em registro de novos
fármacos e qualquer outro produto químico, abre-se obrigatoriamente a necessidade
de desenvolver métodos que sejam capazes de detectar e quantificar tais produtos
e/ou fármacos e, assim, viabilizar a garantia de sua qualidade.
Métodos, em geral, podem apresentar disfunções sob diferentes situações, como,

por exemplo, a aplicação do método analítico em dias diferentes, que por sua vez
podem apresentar condições climáticas extremamente opostas. Outros fatores como
a utilização de reagentes de diferentes fabricantes ou até mesmo de lotes, alteração
do equipamento comumente utilizado, a execução do ensaio por diferentes analistas e
outros. Por isso almeja-se que antes de o método ser propagandeado para a aplicação
em outros laboratórios, o método analítico desenvolvido seja satisfatoriamente
validado e, consequentemente, comprovado por meio da apresentação dos resultados
obtidos e descritos detalhadamente.
Essa consolidação por meio de dados e informações documentadas favorece

profundamente a garantia da qualidade de uma determinada operação gerar o
resultado ou produto pretendido, conferindo com as exigências, espeficicações e
características de qualidade previamente estabelecidas e preconizadas em compêndios
(CAZEDEY, 2012).
O planejamento da validação do método analítico é essencial para se obter os

resultados almejados. O documento de caráter orientativo do INMETRO, o qual é
intitulado como Orientação sobre Validação de Métodos Analíticos (INMETRO,
2008), norteia o planejamento e a execução de uma validação por meio de
recomendações que auxiliem nesse processo, como a se definir:
14
»» Objetivo e finalidade do método.
»» Os parâmetros de performance.
»» Quais princípios que serão acordados para aprovar a confiabilidade de

cada parâmetro a ser testado.
»» Conferir a compatibilidade requerida do equipamento de acordo com o

método analítico a ser validado.
»» A avaliação de todos os componentes que serão utilizados.
»» Delineamento dos ensaios que serão realizados, assim como decidir qual
o teste estatítico a ser aplicado em cada grupo de resultado.
»» Execução de todos os ensaios planejados.
»» Aplicar a análise estatística, memorando os princípios acordados para

aprovação, que apontarão a decisão de se aceitar ou não a hipótese
gerada.
»» Avaliar os resultados obtidos (os quais devem estar documentados e

registrados). Finalizar com a comprovação de que o método é pertinente
(ou não) ao que se planeja (INMETRO, 2018a).
São tidos como obrigatórios para uma validação de método analítico, segundo a RDC
nº 17, de 16 de Abril de 2010, os documentos listados a seguir:
I. Procedimentos operacionais padrão;
II. Especificações;
III. Plano Mestre de Validação (PMV);
IV. Protocolos e relatórios de qualificação, e;
V. Protocolos e relatórios de validação (BRASIL, 2010).
Validação de métodos analíticos

Em conformidade com a Food and Drug Administration (FDA), agência federal do
Departamento de Saúde e Serviços Humanos dos Estados Unidos, todos os métodos
analíticos precisam detectar e mensurar inclusive as possíveis variações que possam
haver durante a análise. Com isso, após a obtenção dos resultados e suas variações,
15
devem estar em concordância com o limite permitido para o produto e processo. Para
se predizer a variabilidade total, deve-se realizar a adição da variabilidade real do
processo com a variabilidade do sistema de medição (FDA, 2011).
A adequação e a confiabilidade dos dados obtidos necessitam ser garantidas na

validação do método analítico. Os parâmetros, os quais são capazes de refletir se
o método apresenta uma boa performance ou não, basicamente são a precisão,
a exatidão, a especificidade, limite de detecção, limite de quantificação e a
linearidade.
O “Guia para validação de métodos analíticos e bioanalíticos”, o qual pode ser

observação a Resolução RE nº 899/2003, determina para a variabilidade para o
método, o valor de 5% como limite máximo permitido do desvio-padrão relativo
(BRASIL, 2003).
O termo capacidade de medição denota a menor incerteza de medição que uma

entidade de calibração pode atingir quando realiza calibrações ou medições dentro
do propósito de estabelecer sua acreditação. A capacidade de medição de qualquer
método analítico, levando em conta a variabilidade (Figura 3), pode ser determinada
pela Equação 1.
% P 100
6σ Equação 1
T=
LSE − LIE
Onde,
P= precisão;
T= tolerância;
6σ= a variação da medição;
LSE= limite superior de especificação;
LIE= limite inferior de especificação.
Alguns autores da área consideram que %P/T de um método ideal deve ser abaixo de
10%, valores entre 10-30% são admissíveis e acima de 30% intoleráveis.
16
Figura 3. Representação das variabilidades
Variabilidades
do produto da medição total
Fonte: Bernegossi (2019).
Tudo o que envolve qualquer tipo de aferição (equipamento, vidrarias, instrumentos,

etc.) no processo de validação do sistema de medição necessita ser adequadamente
calibrado de acordo com as exigências do órgão regulamentador. Segundo
Barros-Neto e colaboradores (2002): “A calibração, em geral, é uma operação que
relaciona uma grandeza de saída com uma grandeza de entrada, para um sistema de
medida sob determinadas condições”.
As informações resultantes de uma calibração possibilitam a determinação de

melhorias que devem ser realizadas ou também os valores equivalentes das grandezas
predeterminadas por padrões (PINTO et al., 2010).
Visto a extrema importância do assunto “calibração”, este será abordado de forma

mais detalhada posteriormente.
Tipos de validação
Existem alguns tipos de validação, os quais são nomeados de acordo com o momento
em que são aplicados. Logo a seguir, veremos os tipos de validação prospectiva,
simultânea, a retrospectiva e a revalidação.
Prospectiva
Quando a validação é realizada no início da projeção de um produto, fase na qual serão

observadas as particularidades do método, esta é denominada como prospectiva.
Simultânea
Já quando toda a metodologia para a manufaturação do produto está completamente

resolvida e colocada em prática, a validação é chamada de simultânea ou também
conhecida como concorrente. A validação simultânea é muito aplicada quando há
mudanças em alguma fase da produção, sob a condição de que sejam previamente
17
conhecidos os fundamentos da metodologia a ser validada e que ela possibilite o

acompanhamento dos primeiros lotes gerados.
Retrospectiva
Este tipo de validação, como o próprio nome já sugere, busca, por meio de
acontecimentos documentados, evidenciar e assegurar que o método, processo,
colaborador ou equipamento pretendido a ser validado atenda a todas as exigências,
mas com a regra de que nada tenha sido alterado durante todo o tempo de análise.
Contudo há restrições para sua utilização. Em casos singulares, como, por exemplo,
numa empresa, são escolhidas determinadas novas condições. A validação
retrospectiva não pode ser aplicada em métodos que envolvam a fabricação de
produtos estéreis e também para novos métodos. Ela é favorável quando é pretendida
a obtenção de maiores informações de todo o processo.
Revalidação
E para finalizar os tipos de validação, esse processo é praticado quando se faz

necessária a revalidação de uma parte ou de um método analítico completo, para
garantir que tal método permaneça desempenhando a mesma competência requerida.
A revalidação de um método analítico geralmente é realizada quando há modificações
na técnica para obtenção do insumo farmacêutico ativo ou no processo de síntese.
Além disso, para alterações no método analítico ou nos componentes do produto, a
revalidação também se faz necessária (PINTO et al., 2010; BRASIL, 2017a).
Plano Mestre de Validação

Como já explanado anteriormente, dentre as documentações exigidas para uma
validação, destaca-se, neste momento, o plano mestre de validação. Existem duas
maneiras de se qualificar um plano mestre de valiação. O Plano Mestre de Validação
pode ser delineado de uma maneira mais extensiva, de modo que contemple
conteúdos importantes como os posicionamentos que uma determinada empresa
defende como prioridades para sua sustentação, toda parte da organização,
administração e ideologias para que seja realizada uma validação na empresa, também
todos os estímulos e diligências para a tal realização, os trâmites dos procedimentos
operacionais padrão, conceitos e outras características almejadas, dentre outros
arquivos documentativos para definir detalhadamente conteúdos que se considerem
necessários (PINTO et al., 2010).
18
O Plano Mestre de Validação também pode ser caraterizado como um documento

mais objetivo e pontual, o qual tem como intuito organizar e sistematizar todos os
procedimentos da etapa de produção, delineando com detalhes de informações quanto
aos propósitos, metas, incumbências de todos os colaboradores, dentre outras que
forem consideradas importantes (SANTOS et al., 2016).
Segundo a RDC nº 17, de 16 de abril de 2010, que dispõe sobre as Boas Práticas de
Fabricação de Medicamentos, o Plano Mestre de Validação é o:
documento geral que estabelece as estratégias e diretrizes de validação

adotadas pelo fabricante. Ele provê informação sobre o programa
de trabalho de validação, define detalhes, responsabilidades e
cronograma para o trabalho a ser realizado (BRASIL, 2010).
Ainda quanto às instruções contidas nessa Resolução, empresas que terão a

necessidade de realizar uma validação, qualquer que seja o método analítico, devem
possuir um Plano Mestre de Validação que contenha evidentemente estipulados e
estabelecidos os elementos-chave da validação, inclusive o comprometimento para
que haja a conservação do tal plano determinado (BRASIL, 2010).
Atualmente, as empresas habituaram-se com a ideia de estar sempre renovando e

inovando os princípios determinados em relação aos processos realizados, pela busca
de melhorias constantes (PINTO et al., 2010).
A normativa citada acima descreve alguns dos elementos-chave que devem estar
obrigatoriamente especificados em um Plano Mestre de Validação. Ressalta-se que
devem ser descritos de modo que sejam compreendidos facilmente e de maneira mais
sucinta possível. Dessa forma, devem, então, conter pelo menos os itens expostos a
seguir:
»» Uma política de validação.
»» Estrutura organizacional das atividades de validação.
»» Sumário/relação das instalações, sistemas, equipamentos e processos

que se encontram validados e dos que ainda deverão ser validados
(situação atual e programação).
»» Modelos de documentos (ex: modelo de protocolo e de relatório) ou

referência a eles.
»» Planejamento e cronograma.
19
»» Controle de mudanças.
»» Referências a outros documentos existentes (BRASIL, 2010).
Na Figura 4, pode ser contemplada a representação dos procedimentos que estão

envolvidos em um Plano Mestre de Validação.
Figura 4. Esquema das etapas para a elaboração de um Plano Mestre de Validação.
Relatório de validação
Protocolo de validação
Análise de risco
Método analítico validado
Instrumentos calibrados e matérias-

primas qualificadas
Procedimentos e recursos
qualificados
Fonte: (PINTO et al., 2010 apud VISSOTO, 2007).
Como observado na Figura 4, os Planos Mestres de Validação devem incluir protocolos

de validação e relatórios de validação de cada operação. Esses relatórios e protocolos
de validação serão assuntos exclusivos em breve nos itens a seguir. Também
deve-se adicionar no Plano Mestre de Validação um tópico de gerência de alterações,
no qual haverá uma programação ao se realizar qualquer tipo de mudança no
decorrer dos procedimetos já preliminarmente validados. Esse controle deve ocorrer
devido a possíveis interferências decorrentes das mudanças que podem influenciar
os equipamentos e procedimentos, consequentemente, tendo potencial de interferir
na qualidade final do produto. Toda a equipe envolvida deve analisar e discutir as
prováveis intercorrências na produção (PINTO et al., 2010).
Vale ressaltar que mudanças relevantes, de maior significância, como, por exemplo,
compra de equipamentos com mecanismos de funcionamento diferentes aos
que foram utilizados anteriormente durante a validação, é necessário que seja
consentido preliminarmente pelas agências reguladoras. Logo, é importante que já
se tenha-se em mente o tempo calculado com a aprovação. Já quando se tratar de
mudanças insignificantes, as quais claramente não irão apresentar uma repercussão
considerável, e por consequência não afetarem o produto final, tais mudanças devem
ser examinadas e ponderadas por meio de uma requalificação completa ou parcial e
20
ou também por revalidação do método. Novamente ressalta-se a necessidade de se

estipular o tempo exigido para que se realize os devidos processos cabíveis (PINTO et
al., 2010).
Protocolo de validação
O protocolo de validação é um dos documentos que devem compor o Plano Mestre de
Validação como já visto anteriormente.
Segundo Villela (2004, p. 4 ), o plano de validação é um:
plano escrito que estabelece como a validação será realizada,

compreendendo os parâmetros de teste, as características do produto,
o equipamento de produção e os pontos decisivos sobre o que constitui
resultados de teste aceitáveis.
Dentre os esclarecimentos e informes que devem ser inseridos em um Protocolo de

Validação estão:
»» Os objetivos do estudo.
»» Local (esquematizado por mapa do ambiente) em que o estudo será

realizado.
»» Os responsáveis envolvidos.
»» O detalhamento dos procedimentos a serem empregados.
»» As referências e preceitos para os processos importantes e

evidentemente para os produtos.
»» Qual o tipo de validação a ser realizada.
»» Os processos e/ou parâmetros.
»» A amostragem.
»» Os procedimentos, os ensaios e as exigências para o monitoramento.
»» Os treinamentos necessários para a validação.
»» Princípios de aceitação ou rejeição dos dados.
»» Detalhamento do processo para a realização da análise dos resultados

(método e estatístico, software, dentre outras informações cabíveis).
21
Após a aprovação do Protocolo de Validação pelos encarregados responsáveis por

tal atividade (é indicado que se tenha uma equipe multidisciplinar, dentre os quais,
profissionais da área da produção, engenharia, segurança, assuntos regulatórios,
garencia de validação) se houver quaisquer distanciamentos dos parâmetros que
foram estipulados, os mesmos devem ser registrados e acompanhados de uma
explicação plausível que permita a argumentação do ocorrido (GQ, 2019; PINTO et al.,
2010).
Relatórios de validação
Como já comentado anteriormente, dentro do Plano Mestre de Validação devem ser
incluídos os relatórios de validação. Eles devem ser elaborados em conformidade com
os protocolos de validação, e é necessário que sejam incluídos:
»» Título.
»» Objetivo.
»» Reportações quanto ao protocolo de validação.
»» Informações pormenores dos materiais, equipamentos, programas e

também dos ciclos utilizados.
»» Procedimentos, técnicas e métodos utilizados.
»» Conclusão das atividades de acordo com os resultados obtidos.
Deste modo, após a confecção do relatório de validação, este deve ser analisado e
aprovado pelo pessoal responsável pela validação de processos e igualmente pelos
colaboradores envolvidos na qualificação dos equipamentos.
A qualidade
Em geral, a qualidade é um conceito considerado em incessante construção, que tem
tomado forma mais palpável desde o século XX. Sucintamente, pode ser apresentada
em quatro diferentes fases, sendo elas a inspeção, o controle de qualidade, a garantia
da qualidade e a gestão da qualidade total. A fase da inspeção foi estabelecida
com a Revolução Industrial, em que houve um aumento súbito na produção e,
paralelamente com essa expansão, levou-se a observação de maiores números de
defeitos apresentados. Esses defeitos eram identificados pelos fiscalizadores que
22
inspecionavam a qualidade durante a produção. Os fiscais eram responsáveis por

realizar a seleção e separação dos produtos defeituosos dos que estavam dentro dos
padrões estabelecidos. Eles eram vistos com uma imagem não tão simpática, uma vez
que seu papel era apontar erros de produtos já terminados, logo eram comparados de
maneira receosa a policiais que iriam penalizá-los. Assim, os colaboradores preferiam
acobertar e esconder as imperfeições ao contrário de solucioná-las (PINTO et al.,
2010).
Seguindo, a fase do controle de qualidade é aderida por volta de 1930. Nela, iniciou-se
o acompanhamento de todas os procedimentos para a obtenção da amostragem, de
modo que pudessem detectar quais os possíveis erros que ocasionavam a produção
com irregularidades, e também houve o estabelecimento da inferência de modelos
estatísticos para a corroboração dos resultados e posterior direcionamento de quais
decisões serem tomadas.
Em meados de 1960, a etapa da garantia da qualidade foi implementada de modo

que como o próprio nome já diz, certificar que o serviço ou produto incumbido
apresente a qualidade pretendida. E, finalmente, a fase da gestão da qualidade
total, que concentrou a atenção voltada exclusivamente para os colaboradores,
fornecedores e clientes, visando manter a qualidade e satisfação dos produtos
e/ou serviços, com concomitante apoio de outras áreas funcionais da empresa,
ocasionando, assim, a redução de custos. Logo houve a consolidação da ideia
de que focar na garantia da qualidade era fundamental para obter o retorno do
investimento aplicado (JURAN, 1990).
Nessa mesma época, houve uma grande propagação de uma filosofia da cultura
japonesa e que foi vastamente implementada para melhorar qualidade dos produtos
em indústrias e que objetivava atingir o “defeito zero”. Concomitante a isso, também
houve difusão e aplicação do conceito dos 5 S´s, os quais estão descritos na Figura
5. Dentre os 5 S´s, a disciplina (Shitsuke) é considerada como a mais desafiadora em
se assimilar, de modo que, ao se atingir seu nível desejado, os demais também serão
consequentemente. Outro método que foi (e ainda é) utilizado para auxiliar a obtenção
do aperfeiçoamento dos processos no dia a dia é o ciclo de PDCA (abreviatura de
palavras em inglês), em que “P”: plan, “D”: do, “C”: check e “A”: act, que quer dizer
planejar, fazer, verificar e agir, respectivamente (PINTO et al., 2010).
23
Figura 5. Representação do conceito dos 5 S´s.
SEIRI
(Organização)
SHITSUKE SEITON
(Disciplina) (Arrumação)
5 S´s
SEIKETSU SEISÔ
(Asseio) (Limpeza)
Fonte: Adaptado de Kogawa (2015).
Sistema de qualidade
Um sistema de qualidade (SQ) bem definido é uma estratégia de extrema importância
para a obtenção de produtos e serviços com constância almejada. A qualidade exigida
por clientes que irão adquirir tais produtos e/ou serviços gera a busca ininterrupta
de melhorias. O sistema de qualidade propicia sistematização, que possibilita a
intercambialidade entre laboratórios. Na prática, são registrados por meio de arquivos
todos os procedimentos a serem seguidos, padronizando-os as condutas a serem
seguidas. Há uma Organizanização Mundial de Padronização, do inglês International
Organization for Standardization, fundada em 1947, em Genebra, e que reune
especialistas que desenvolvem normas internacionais relevantes, voluntárias,
baseadas no consenso e no mercado de interesse que apadrinhem inovações e
proporcionem soluções para as dificuldades enfrentadas mundialmente (ISO 9001).
As certificações da garantia da qualidade no Brasil são criadas pela Associação

Brasileiras de Normas Técnicas (ABNT), as quais são formadas pela sigla NBR.
Existem ainda três grandes áreas que norteiam as documentações elaboradas. Uma
área com foco em segurança da saúde ocupacional, outra em responsalbilidade social
e outra em meio ambiente (ANOREG, 2018). Quando se pensa em normas para o
estabelecimento de um sistema de gestão da garantia, o grupamento de normas mais
particularizadas para empresas são as ISO 9000 e a ISO 9001. A empresa que anseia
em obter tal certificado deve admitir um amoldamento em seus setores como nas
técnicas que utilizam, também nos aspectos físicos e de seus colaboradores. Após o
replanejamento e tracejo das metas a serem atingidas, e posteriormente sua aplicação,
24
a empresa é assistida, e, se tudo estiver dentro dos conformes, o certificado da ISO é

finalmente emitido. (ISO 9000, 2015).
A ABNT NBR ISO 9000 é uma norma que apresenta os termos utilizados no sistema,
ela foca o processo e não diretamente o produto, mas claro que, consequentemente, o
segundo sofrerá influência direta do primeiro. Já a ABNT NBR ISO 9001 estabelece
o modelo com as determinações da gestão da qualidade, ela traz em detalhes as
exigências a serem cumpridas para a conquista do reconhecimento dessa organização.
Esta é a norma mais integral e emprega a maioria dos princípios da ISO 9004, que por
sua vez, traz informações sobre gerenciamento da qualidade e elementos do sistema
da qualidade (ISO 9004, 2018).
Em suma, a organização da ISO viabiliza processos internos, facilitando a efetivação

da garantia da qualidade e, assim, traz ao consumidor a certeza e a tranquilidade de
que estará consumindo um produto feito em condições ideais para sua aplicação.
Sistema de boas práticas de laboratório

Segundo o INMETRO, os “Princípios das boas práticas de laboratório” avaliam a
estrutura física do laboratório por meio de testes que são requisitados pelos orgãos
que normatizam o registro de produtos resultantes de uma produção industrial, como
de medicamentos, cosméticos, diversos produtos químicos, produtos relacionados
ao setor veterinário, organismos geneticamente modificados. Essa avaliação das
instalações tem a intenção de qualificar o risco ambiental e a segurança do pessoal
envolvido (INMETRO NIT DICLA 35, 2019).
Resumindo, o sistema de boas práticas de laboratório, assim como as normativas da

ISO, idealiza a organização e descrição do passo a passo de todos os procedimentos e
que esses estejam à disposição dos colaboradores. Esse posicionamento de organizar e
descrever detalhadamente, documentando cada operação a ser realizada, é chamado
de Procedimento Operacional Padrão (POP´s).
Procedimento Operacional Padrão
Para essa sistematização, há inúmeros procedimentos a serem minuciados. Dentre

eles estão:
»» Todas as informações que se referem à empresa, como o nome de

registro, sua localização, nome (s) proprietário(s) e responsáveis,
quadro de funcionários e suas funções, dentre outras.
25
»» Gráfico da estrutura que indique a hierarquia institucional.
»» Planta com as metragens, indicando a posição ocupada pelos

equipamentos.
»» Os procedimentos exigidos para a manutenção da higiene e segurança

do pessoal.
»» A maneira que são captadas as matérias-primas e todo seu processo,

identificação, rotulagem, manuseio, amostragem e armazenamento.
»» O esquema utilizado para organização registros e de papéis importantes.
»» Quaisquer tipos de armazenamento, informando o período que deverá

permanecer nessa situação.
»» Os cuidados para conservação, rotineiras ou não, de equipamentos,

dispositivos, dentre outros.
»» O modo e periodicidade das calibrações.
»» Em casos que necessitem de regulagem e/ou calibração, descrever todo

andamento. Esse procedimento deve ser certificado pela empresa que,
por sua vez, deverá ser associada à Rede Brasileira de Calibração.
»» As atividades executadas e controles realizados nos equipamentos/

instrumentos.
»» Monitoramento da temperatura do(s) laboratório(s).
»» As precauções realizadas em caso de oscilações da corrente elétrica,

pensando nos reflexos que poderiam ser causados.
»» Cuidados destinados aos padrões de referência.
»» Os procedimentos destinados à prática de uma metodologia e sua

validação.
»» A evolução da divulgação dos resultados obtidos nos ensaios.
»» O modo de recepção das reclamações e/ou sugestões.
»» Controle das matérias-primas e demais substâncias utilizadas no

processo de produção.
26
»» Processo de higienização dos utensílios, equipamentos, sala de

procedimentos. E paralelamente, POP que estabeleça o passo a passo
em caso de imprevistos na manipulação da amostra.
»» Agenda-mestra. Nela, constam todos os experimentos realizados. Deve

descrever informações como:
›› Nome do componente estudado.
›› Essência do estudo.
›› Data de início.
›› Método em experimentação.
›› Atual situação do estudo.
›› Indivíduo que requer o estudo ou que fomenta todo o progresso

deste, sendo que até mesmo o financie.
›› Nome do encarregado que dirige o estudo no geral, que designa as

funções ao pesquisador principal.
›› Nome do pesquisador principal que lidera um segmento do estudo.
›› Modo que se deve documentar acontecimento inesperado no decorrer

do ensaio.
›› Técnicas de amostragem.
›› Ficha de funcionários que apresentam relação com o controle de

qualidade. Certificados que atestem suas competências (INMETRO
NIT DICLA 028, 2003. LEITE, 2008).
Esses são os POP´s que rotineiramente precisam ser elaborados em indústrias

farmacêuticas. Eles devem ser redigidos de maneira que sejam facilmente
compreendidos pelo público-alvo. É frequentemente usual a exposição de fotos que
exemplifique o procedimento a ser realizado. Os POP´s devem ser disponibilizados de
maneira que todo o pessoal interessado tenha rápido e fácil acesso.
27
CAPÍTULO 2
Amostragem
A amostragem se faz frequentemente necessária em análises químicas, ela deve ser

capaz de representar um lote no seu total. Uma vez que falamos em amostragem, já é
remetida a ideia da retirada de uma parcela do lote em questão, mas de que maneira
se deve fazer tal procedimento? Podemos apenas coletar uma parte da amostra sem
a aplicação de nenhuma técnica? É o que vamos discutir neste capítulo, as diversas
maneiras de selecionar a porção a ser analisada.
Vale lembrar a importância de se realizar uma amostragem eficientemente, pensando

na relação direta com os resultados que serão obtidos. O rigor nessa etapa refletirá
a confiabilidade analítica, ressaltando que, no cotidiano, em determinados casos, far-
se-á necessária uma visão que vai além da que é descrita na teoria.
Primeiramente, deve-se considerar que há uma população (termo utilizado para

referenciar a amostra ainda a ser realizada – Figura 6). Dessa população, será
tecnicamente retirada uma porção e em seguida aferida por meio de análises
estatísticas para então dar andamento aos ensaios pretendidos. É necessário que essa
porção selecionada seja representativa, ou seja, que reflita as mesmas características
do lote como, por exemplo, o seu tamanho, o mesmo nível de deformidades, os
mesmos resultados que seriam obtidos se fosse realizado no lote completo.
Figura 6. Exemplificação de população e amostra.
Amostragem
Amostra
População
Há também de se observar as particularidades de cada lote, como o estado da

substância a ser analisada (sólida, gasosa ou líquida), qual a etapa do processo
de produção (matéria-prima, durante a produção ou produto final). A seguir,
28
vamos abordar maneiras que são utilizadas para a obtenção de amostras que sejam
representativas.
Tipos de amostragem
Existem dois tipos de amostragem: a probabilística e não probabilística. A
amostragem probabilística proporciona melhor representatividade da população e,
por isso, sempre que for possível a que deve ser aplicada. Ela só pode ser executada
quando a população for totalmente de fácil acesso e possuir um limite. Dentre as
amostragens probabilísticas estão: amostragem casual simples, a sistemática, a por
meio de aglomerados e a múltipla a sequencial. Já amostragem não probabilística
por se tratar de cenários onde a população ainda não teve um fim, somente é possível
sua aplicação por inferência estatística. Um exemplo de uma situação onde se faz
necessário a aplicação de uma amostragem não probabilística, é quando a realização
da amostragem precisa ser feita durante a fabricação do produto, logo ainda não será
100% finalizado. A amostragem a esmo, a em material contínuo e a intencional, são
exemplos de amostragem não probabilística.
Quanto à quantidade de itens a ser coletada de uma população para compor uma
amostra, falando de líquidos (soluções, suspensões, emulsões, etc.) e semissólidos
(pomadas, cremes, entre outros), para garantir que ela apresente propriedades
farmacotécnicas determinadas, é preciso abranger fases durante a produção como
também do material finalizado. Já no caso de a população ser constituída de sólidos
(mistura de pós, comprimidos, drágeas, pellets, etc.), deve-se, além da amostra
coletada para a execução dos testes, somatizar uma quantiedade extra para o
armazenamento de uma contraprova (PINTO et al., 2010; LEITE, 2008).
Amostragens probabilísticas
Casual simples
Nesta amostragem, toda a população tem a mesma possibilidade de ser selecionada,

ela é comparada a um sorteio de loteria. Logo pensando que a amostragem realizada
a
“a” e a população total “A”, temos a probabilidade de que a amostragem tenha sido
A
originada da população em questão (LEITE, 2008).
29
Por meio de conglomerados
Esta maneira de se obter amostras pode ser aplicada quando a população tem divisões
em cada volume. Um exemplo de amostragem por meio de conglomerados é se
pensarmos em lote produzido em uma indústria de bebidas, em que a embalagem de
refrigerantes é feita em fardos com seis unidades cada. Assim, ao se realizar a seleção
de um desses fardos por sorteio, essa amostra já será a final (LEITE, 2008).
Sistemática
Neste tipo de amostragem, existe um esquema sistemático no qual uma parcela

da amostra é coletada durante o processo e que no final o acúmulo resultará numa
única amostra final. Dessa maneira, pode-se imaginar, por exemplo, um lote de
comprimidos em produção, o qual se supõe que seja finalizado em um determinado
tempo já conhecido e que tais comprimidos estejam em uma esteira, e a cada dez
minutos seja coletado um comprimido para a composição da amostra (OCHOA, 2015).
Múltipla
Com a utilização deste método, almeja-se a diminuição do número médio de amostras.

Para a técnica de amostragem múltipla, é feito o recolhimento de amostras em
diferentes e seguidas fases da produção. Um exemplo de seu emprego é na inspeção
de amostragem, cujo objetivo compactua com a ideia dessa técnica, que é a redução do
número de amostras e assim, consequentemente, o custo será abatido (LEITE, 2008).
Sequencial
Neste caso, a amostragem múltipla é feita de modo semelhante. Nela, também

pretende-se utilizar um número mínimo de amostras, de maneira que são adicionadas
unidades por unidades até que a hipótese seja a ideal (LEITE, 2008).
Amostragens não probabilística
A esmo
Esta primeira técnica para amostragem não probabilística é a que se compararia à

amostragem probabilística casual simples, porém apresenta a diferença de que
não realiza sorteio para sua coleta. As amostras são retiradas aleatoriamente e são
consideradas com a mesma confiabilidade de representação da população que de uma
amostragem probabilística, com a condição de que a população seja homogênea.
30
Em material contínuo
Este tipo de amostragem é utilizado com sucesso quando a população se encontra

no estado gasoso ou líquido e, após sua homogeneização, é coletada amostra sem
maiores estratégias. Em situações em que a população seja sólida e não homogênea,
o elemento a ser amostrado é fracionado em algumas partes e em seguida retirado a
esmo. Esse procedimento de divisão da amostra é conhecido como quarteamento
(LEITE, 2008).
Intencional
Como o próprio nome sugere, este método ocorre premeditadamente. O mostrador

escolhe os itens de maneira subjetiva, ou seja, conforme seu próprio pensamento, o
que torna essa metodologia um pouco comprometedora (LEITE, 2008).
Considerações da amostragem
O número de unidades a ser coletado para compor a amostra deve ser decidido com
cautela. Em ambos os tipos de amostragem, probabilística ou não probabilística, é
ponderada a quantidade de amostras, uma vez que esse número refletirá diretamente
na despesa gerada. Pensando na amostragem de apenas um lote, talvez não aparente
espanto com o custo gerado, porém, multiplicando pelo número de vezes em um dia
e, posteriormente em um ano, esse valor torna-se alarmante. Lembrando que é sabido
que todo e qualquer custo, no decorrer de todo o processo produtivo, é repassado
ao consumidor, e este, por sua vez, contempla a qualidade e preço de um produto
(LEITE, 2008).
A realização da amostragem deve ter como auxílio para o cálculo amostral a estatística.
Contudo, na prática, algumas indústrias aplicam fórmulas simplificadas para dar
suporte a essa decisão, como por exemplo, a Equação 1.
=
NA n +x Equação 1
Onde,
NA= número de amostra;
n= total de embalagens do produto;
x= número de aplicações, geralmente igual a 1.
31
Também é comumente utilizada a amostragem extraída e adaptada do controle de

inspeção, de acordo com Militar Standart, dentre outras técnicas (PURPURATA,
2019).
Há que se considerar alguns pontos na coleta e armazenamento da amostra, como:
»» Onde e como retirar a amostra.
»» Composição química das unidades amostrais.
»» Planejamento de resguardo em caso de catástrofes.
»» Montante de amostra satisfatório.
»» Manutenção do saneamento.
»» Controle:
›› atmosfera inerte;
›› pressão de equilíbrio;
›› qualidades do meio.
Estado físico da amostra
Sólida
As amostras sólidas podem ser coletadas durante a produção contínua em uma

indústria ou mesmo de maneira estática, quando estocadas em tambores. Em ambos
os processos, a amostragem deve ser realizada de modo a assegurar que o material
coletado represente o lote como um todo.
Para a validação da amostragem de sólidos, há algumas dificuldades a serem

contornadas, como garantir essa representatividade. Algumas observações devem ser
notadas, como:
»» Assegurar que a amostra não apresente perdas (contaminação,

evaporação, entre outras).
»» Utilizar o recipiente mais apropriado, de acordo com a metodologia.
»» Empregar a amostra livre de umidade.
32
»» Realizar a amostragem após garantir a homogeneidade do material –

triturar ou macerar o sólido e misturá-lo.
»» No caso do material ser solo compactado, coletar amostras da superfície,

30 e 60 cm de profundidade.
»» Estudar o ponto de amostragem que trará maior representação do

material como um todo.
Para a averiguação da precisão da amostragem, é indicado o emprego da ferramenta

estatítica nos valores amostrados obtidos. Há alguns erros que podem ser cometidos
na amostragem. Existem fórmulas que auxiliam no cálculo da estimativa desses erros,
em casos de falhas em amostras de sólidos heterogêneos (LEITE, 2008).
ST
= S S2 + S A2 Equação 2
Onde,
ST= estimativa do desvio-padrão ou erro total;
SA= estimativa do desvio-padrão ou erro analítico;
SS= estimatia do desvio-padrão ou erro da amostragem.
Ou,
=
ST VA + VS Equação 3
Onde,
VA= estimativa de variância da análise;
VS= estimativa da variância de amostragem.
São estimados valores para SS= 3% e SA=1%, dessa forma o valor do erro total será
confome a Equação 4.
32 + 12 =± 3,16% Equação 4
Outra possível maneira de se ponderar o erro da amostragem é pela teoria da

probabilidade. Na teoria da probabilidade, estima-se a chance da amostra coletada
apresentar a mesma constituição do lote todo. Para isso, há de se analisar a
amostragem aleatória e o tamanho das partículas misturadas do material em questão.
33
Considerando que a amostra seja uma mistura de duas partículas diferentes (A e B), a
probabilidade de se amostrar a partícula A ou a partícula B (Equações 5 e 6) é:
nA
pA = Equação 5
nA+ nB
Onde:
pA= probabilidade de coletar a partícula A;
nA= número de partículas do tipo A.
nB
qB = = 1− p Equação 6
n A + nB
Onde:
qB= probabilidade de coletar a partícula B;
nB= número de partículas do tipo B.
Para a realizar o cálculo do desvio-padrão da amostragem, aplica-se a Equação 7.
S n = npq Equação 7
Onde:
Sn= desvio-padrão da amostragem;
Npq = n = tamanho amostra;
p= probabilidade de sucesso;
q= probabilidade do fracasso.
Gasosa
A amostragem de porções referentes a compostos gasosos deve ser realizada de

maneira cautelosa. Esse tipo de amostragem é considerado de risco, de modo que
o quesito segurança é indispensável para a sua efetivação. Os principais riscos
considerados na amostragem desse tipo de composto são o seu possível vazamento e a
inflamabilidade. Para a prevenção do vazamento e consequente riscos de intoxicações
ou explosões, deve ser garantida a estanqueidade das tubulações, que pode ser por
34
meio de teste de estanqueidade, ou seja, inspecionar se o gás apresenta-se vedado,

sem nenhum vazamento (WAGNER, 2016).
A validação da amostragem é um processo desafiador devido à dificuldade na garantia

da representatividade desse tipo de amostra. De acordo com Leite (2008), a primeira
questão a ser examinada é quanto à coleta entrelaçada a essa questão, o equipamento
também deve ser motivo de preocupação. Logo, para a garantia de uma coleta
adequada deve-se:
»» Certificar que não esteja havendo perda de gas no processo.
»» No caso de se realizar o processo da amostragem em pressões menores

que a atmosférica, é importante garantir a estanqueidade. Problemas
com esse parâmentro podem causar a contaminação da amostra com
outros gases externos.
»» Os medidores de vazão devem ser periodicamente calibrados. Medidor

de vazão é um dispositivo o qual tem como função aferir a taxa (tempo x
pressão) de vazão do volume de gás, neste caso (OMEGA, 2018).
»» Realizar testes que comprovem o fluxo ótimo da coleta.
»» Fiscalizar a formação de condensados.
»» Utilizar a isocineticidade durante as amostragens, ou seja, a mesma

velocidade de fluxo para todas as coletas.
»» Conferir todo o processo antes da coleta, assegurando a estabilidade

de todo o sistema. Para a obtenção do equilírio do sistema, realiza-
se primeiramente o método de limpeza que elimina, neste caso, gases
indesejáveis através de ventilação no interior do ambiente que o mesmo
se encontra. Esse procedimento de limpeza é conhecido como purga
(NR33, 2018).
Juntamente com os tópicos observados acima, Leite (2008) ainda afirma que todas as
etapas devem ocorrer em colaboração da engenharia de processos, para a excelência
na validação da amostragem.
Líquida
A amostragem de subtâncias líquidas é considerada a de menor complexidade

dentre as anteriormente citadas, pois levando em conta seu processo de coleta é,
na maioria das vezes, possível executá-la facilmente com sucesso, respeitando as
35
exigências quanto aos procedimentos destinados à amostra e também ao analista que

o desempenhará.
Contudo, é necessário observar as características comportamentais das amostras

durante todo o processo da coleta para a amostragem. Algumas substâncias
apresentam peculiaridades conforme as condições do ambiente em que se encontram,
podendo transitar para líquidos de maior viscosidade de acordo com a temperatura ou
até mesmo se tornarem sólidas após a finalização da coleta (LEITE, 2008).
Durante a coleta, caso o material a ser realizado na amostragem seja heterogêneo, é

necessário que se realize a homogeinização do líquido por intérmédio da agitação.
É usual a utilização de bombas de circulação, dentre outras maneiras para garantir
que a coleta seja bem-sucedida. Mas nos casos em que esse processo não é possível
de se realizar por motivos justificáveis, deve-se garantir a representatividade da
amostragem executando a coleta em pontos variados, prestigiando diferentes
profundidades (SAMANCTA, 2018).
A amostragem de água, apesar de mostrar-se como um procedimento sem a

necessidade de maiores cuidados, deve ser analisada com muita sensatez. Sua coleta,
assim como todas as outras, precisa que o quesito representatividade seja alcançado.
Em coletas realizadas em rios e lagos, necessita-se da aplicação de estratégias para
sua obtenção. Para isso, no caso dos rios, a coleta deve ser realizada de maneira que
contemple diferentes fluxos da água no percorrer de toda sua trajetória. Em lagos, por
exemplo, devem ser coletadas amostras de diferentes profundidades (LIMA, 2006).
Algumas observações devem ser atentadas quanto à validação da amostragem de

líquidos. Dentre esses cuidados, encontram-se:
»» O controle durante todos os processos da amostragem quanto às

possíveis perdas de amostra. Essa perda pode ocorrer, por exemplo, por
meio de evaporação, embalagens com fissuras.
»» Assim como na amostragem de gases, a purga é um procedimento

importantíssimo para a garantia de um sistema estável e deve sempre
ser realizada antes das coletas.
»» Adequar o melhor tipo de frasco para se realizar a coleta.
»» Em casos de amostragem de água, identificar o local da nascente, lençol

freático, rio etc., que descarte ocorrência de contaminações.
36
Além dessas recomendações, vale lembrar que para se validar o processo de

amostragem, os dados obtidos devem ser analisados após a inferência estatística.
Considerações para amostragem

Objetivando uma amostragem com excelência desejável, todos os procedimentos
precisam ser satisfatóriamente planificados, ou seja, ser planejados de maneira
detalhada em todas as suas etapas. Partindo desse princípio, deve ser descrito todo o
modo que deverá ser procedido no momento da coleta, desde o número de amostras
que deverá ser colhido, a quantidade de amostra, os pontos de amostragem, recipiente
que deverá ser utilizado para a coleta na amostragem, tempo que a amostra poderá
ser estocada e as condições para sua conservação, além das características que o
analista deverá apresentar. Nesse planejamento, é importante descrever informações
pontuais quanto à previsão de recebimento das amostras coletadas, de modo a realizar
a análise logo que chegarem ao laboratório (SILVA, 2015). Assim, tem-se o esquema
representado na Figura 7, apontando quais os itens básicos para a realização da
amostragem.
Figura 7. Esquema das vertentes básicas da amostragem.
Planejamento
Prevenção de Treinamento
contaminações pessoal
Amostragem
Número Estado físico

amostral
Exatidão de Custo agregado

análise
Fonte: Silva (2015) com modificações.
Algumas observações quanto à amostragem podem ser consultadas na Resolução

RDC no 17, de 16 de abril de 2010, a qual dispõe sobre as Boas Práticas de Fabricação
de Medicamentos. Nela, constam algumas informações relacionadas a essa etapa
da validação, como as responsabilidades do funcionário encarregado pelo controle
de qualidade, as quais incluem a participação na idealização e constituição das
determinações quanto ao processo de amostragem. Dentre essas determinações para
o procedimento da amostragem, citam-se as especificações, os métodos de ensaio e os
procedimentos de controle de qualidade (BRASIL, 2010).
37
Na resolução, estão descritas orientações de quais informações, necessariamente,

devem conter na elaboração do procedimento operacional padrão no processo da
amostragem, sendo elas:
»» Qual técnica de amostragem utilizada e todo seu esquema.
»» A relação dos equipamentos envolvidos que serão empregados no

processo.
»» Os cuidados dispensados para o esquivo de contaminações da amostra

ou qualquer outro tipo de prejuízo em sua qualidade.
»» O número de amostras a ser retirado para a amostragem.
»» Caso a amostra tenha que passar por alguma subdivisão, seu

procedimento deve ser detalhadamente explicado.
»» Especificar o tipo de embalagem destinado para o armazenamento da

amostra até o momento que será analisada.
»» As informações que devem conter no rótulo e o procedimento de

rotulagem.
»» Descrever o processo para realizar a amostragem, especificando se deve

ser em condições assépticas ou não.
»» Deixar explícitas todas as prevenções e cautelas que devem ser tomadas,

especialmente quando relativo a amostras consideradas nocivas ou que
devem permanecer estéreis.
38
CAPÍTULO 3
Domínio da análise
Ao decidir realizar a certificação de que determinado método analítico é válido e

fidedigno para a identificação e/ou quantificação de certo analíto, o sistema deverá
ser inteiramente avaliado de forma que sua credibilidade seja estabelecida. Pode-se
considerar a divisão desse sistema em operação e resolução.
O sistema da operação envolve tudo o que se diz respeito aos processos operacionais,
como, por exemplo, o ambiente em que as operações deverão ser realizadas, o
armazenamento, instrumentos/equipamentos utilizados em em toda a validação,
balanças, entre outros, o que de certa forma acaba envolvendo também a resolução.
Já o sistema da resolução propriamente dito engloba questões mais complexas como o
pesquisador que realiza as análises (LEITE, 2008).
O responsável
O conhecimento prévio de toda a validação é requerido do profissional responsável
pelo método analítico. É sua obrigação realizar todo o planejamento para o início do
processo, como quanto a aquisição da matéria-prima e solventes que serão utilizados
nas análises, também da escolha do local que melhor se adapte à recepção e ao
armazenamento de todos os materiais e reagentes, assim como o local que deverá
ocorrer a sua manipulação. Ainda, ser responsável por todos os cuidados relativos aos
padrões analíticos e equipamentos destinados ao uso durante a validação do método.
O responsável deve apresentar o planejamento dos experimentos laboratoriais,

recomendações em casos que houver possíveis etapas críticas, além de averiguar
todos os documentos originados da validação, fiscalizando e certificando os resultados
obtidos. É função do responsável a investigação científica para o estabelecimento do
método, a sua execução e a comunicação escrita de qualquer tipo de remodelação do
método.
Ademais, a seleção do analista é realizada de acordo com a triagem feita pelo

responsável da validação do método. Assim como a superintendência dos requisitos
necessários e competências de todos os colaboradores que desempenham as funções
consideradas de maiores responsabilidades (EURACHEM, 2005).
39
Após toda a explanação das responsabilidades desse profissional, pode ser observada
a importância que suas escolhas terão e, consequentemente, trarão de modo positivo
ou negativo para todo o processo de validação do método analítico (EMBRAPA, 2011).
O analista
A confiabilidade do método está diretamente relacionada ao analista que o executará.
O bom analista carrega em sua bagagem profissional uma boa formação acadêmica
(básica, técnica e superior), a experiência na área, critérios pessoais, discernimento
e capacidade de resolução dos obstáculos ou imprevistos durante qualquer análise do
processo de validação. A padronização do analista é creditar que tal profissional esteja
apto a desenvolver suas funções, sendo aplicado-lhe a calibração de suas ações (LEITE
et al., 2008).
Abbey (1981, p. 529) evidenciou a magnitude do profissionalismo do analista em

relação a própria metodologia, por meio da afirmação: “A confiabilidade de um
resultado depende mais de quem o produz do que como é obtido. Não existem
maus métodos, mas apenas maus analistas que não atentam para suas próprias
limitações”.
É imprescindível que o analista entenda todos os estágios de um processo de validação

para se obter sucesso em todas as operações. Os analistas são os cooperadores que
executam todo o planejamento idealizado pelo reponsável da validação do método
analítico. É o colaborador que deve, de maneira direta, apontar, na prática, os
pormenores que devem ser analisados e talvez revistos pelo responsável. Dessa
maneira, ele deve ser considerado como o colaborador que compartilha as principais
responsabilidades.
O analista deve ser treinado e estar apto a desempenhar todas as etapas previstas
no processo de uma validação. É também desejável que esse profissional tenha um
perfil característico de indivíduo mais criterioso e sitemático, que preste atenção em
detalhes minusiosos. O analista tem como dever conferir todas as particularidades de
funcionamento do método, que tem como objetivo sua validação (BRITO et al., 2003).
Adicionalmente, em conjunto com o profissional responsável pela aplicação da análise

estatística, o analista deve ser capaz de explorar os resultados obtidos e organizá-los
de maneira que facilite sua interpretação. Além disso, deve emitir o parecer técnico
para todas as análises realizadas. Ainda, deve acompanhar o estatístico na realização
da avaliação das mensurações, na efetivação da codificação dos componentes para
a organização e seu armazenamento, na certificação de que os ensaios procederão à
40
cega e que seja necessária a repetição da amostra, ou seja, que ela seja retestada, não
pertencendo à mesma porção que foi analisada anteriormente (EMBRAPA, 2011).
O analito
É essencial que se tenha em sua totalidade o conhecimento do analito em que será

realizada a validação de seu método analítico. É necessário que o analista tenha
elucidado todas as informações prévias possíveis, como:
»» Estrutura química.
»» Formas estruturais.
»» Características físico- químicos:
›› pH;
›› Densidade;
›› Ponto de fusão;
›› Ponto de ebulição;
›› Estabilidades;
›› Coeficiente de solubilidade;
›› Morfologia;
›› Massa molecular;
›› Dentre outros.
»» Segurança para seu manuseio.
»» Condições de armazenamento ideal.
»» Prever interações com outras substâncias do meio.
»» Pressupor qual metodologia analítica da substância química apresentará

melhor sinal analítico.
»» Determinar a amostragem apropriada.
»» Delinear as condições analíticas indicadas.
41
Este último subitem, condições analíticas, pode ser estabelecido basicamente por duas
maneiras: pesquisas na literatura disponível e experimentos. Partindo da escolha
do(s) solvente(s) que mantenha o analito estável, suponha que determinado método
analítico deve ser validado para identificação e quantificação de um dado analito, o
qual será realizado por cromatografia líquida de alta eficiência, no que diz respeito às
condições analíticas, deverão ser basicamente definidos:
»» Fase móvel.
»» Fase estacionária.
»» Fluxo do sistema solvente.
»» Detecção.
»» Separação.
»» Repetição.
Com base nos resultados obtidos no parâmetro da precisão, a variabilidade pode

ser calculada por meio da Equação 8, que, por sua vez, é prevista em relação à
concentração do analito a ser analisada (LEITE, 2008).
CV = 2(1−0,5log C ) Equação 8
Onde:
CV= coeficiente de variação;
C= g do analito.
Estabilidade do analito
O conhecimento em relação ao comportamento do analito frente a diversas

situações deve ser previsto. A instabilidade do analito acarreta resultados
inapropriados, prejudicando, assim, toda a evolução da metodologia. Para evitar
esses inconvenientes, deve-se realizar o estudo de estabilidade do analito, que
resumidamente acontece expondo-o a essas diversas situações, como:
»» Temperaturas.
»» Níveis de umidade.
»» Solução de oxidação.
42
»» Soluçao ácida.
»» Solução alcalina.
»» Solventes/ reagentes que desorganizam a estrutura do analito.
Esse estudo de estabililidade, além de dar suporte ao planejamento nas condições

ideais, uma vez que antecipa tais influências no analito, também contribui na
determinação do tempo de estocagem.
Estabilidade do equipamento
A compreensão do mecanismo de um equipamento, assim como todo o domínio
teórico e prático, deve ser prezada por todos os colaboradores que trabalham
diretamente com ele. O bom desempenho do equipamento é impreterível, uma vez
que é mantido em funcionamento na totalidade do expediente de trabalho. Sendo
assim, alguns critérios devem ser constantemente fiscalizados, os quais necessitam
apresentar estabilidade, como, por exemplo, temperatura, sinal emitido, sistema de
fluxo, pressão, entre outros. A ausência dessa estabilidade interferirá diretamente
nos resultados que serão obtidos. Portanto, para a certificação de que o equipamento
esteja devidamente regulado, deve haver o acompanhamento de sua variabilidade.
Na prática, a variabilidade pode ser verificada pelo controle dos resultados pela
aplicação de uma mesma metodologia, para a análise de um mesmo componente
e nas mesmas condições analíticas. A repercussão dessa investigação trará uma
estimativa de qual a durabilidade da estabilidade que o equipamento apresentará em
funcionamento contínuo (LEITE, 2008).
Padrões
A substância padrão ou também conhecida como substância química de referência
é um composto modelo para orientar na consideração da conformidade de
medicamentos e insumos farmacêuticos. Os padrões devem apresentar alto nível de
qualidade e ser oficialmente aprovados e reconhecidos pela ANVISA. Antigamente,
era exclusiva do mercado internacional a comercialização dessas sustâncias químicas
consideradas como padrão, o que além do tempo que despendia para sua importação,
apresentava um custo elevado.
Hoje em dia, esses compostos de referência são estabelecidos e produzidos no Brasil,

para que indústrias, universidades, entre outros, que possam ter interesse em adquirí-
43
los tenham acesso, e assim, conferindo maior agilidade no processo de redução de

gastos. O Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde (INCQS) é uma
unidade da Fiocruz que trabalha com tecnologias de laboratório e pesquisas e está
relacionado ao Controle de Qualidade de diversas áreas. Ele desempenha essa função
paralelamente com auxílio da ANVISA. Esse instituto é incubido de administrar o
compartilhamento oficial dos padrões da Farmacopeia Brasileira (FIOCRUZ, 2019;
BRASIL, 2019).
Preparo da amostra
Para o preparo de uma amostra, deve-se ter em mente que essa etapa é de extrema
importância para a garantia de resultados fidedignos. Durante o preparo, pode haver
a somatória de pequenos erros em alguns dos procedimentos laboratoriais necessários
para sua execução. Visto a importância dessa etapa, Krug (2006, p. 3) afirmou:
É oportuno observar que, dentre todas as operações analíticas, a etapa

de tratamento das amostras é a mais crítica. Em geral, é nesta etapa
que se cometem mais erros e que se gasta mais tempo. É também
a etapa de maior custo. Por isso, os passos de um procedimento
de tratamento de amostra deverão ser sempre considerados
cuidadosamente.
A seguir, nos próximos subitens, serão abordados os processamentos, informações

relevantes relacionadas e os cuidados realizados ao longo de todas as etapas do
preparo das amostras.
Pesagem
Alguns cuidados são requeridos no momento da pesagem do(s) componente(s)

da amostra para que se tenha sucesso em todas as etapas posteriores. Há algumas
considerações a serem feitas para o uso da balança no preparo de uma amostra:
»» Aguardar o aquecimento da balança (modo stand-by). Geralmente, o
tempo aguardado para esse proceder é de quatro horas.
»» Certificar o nivelamento por meio da centralização da bolha indicadora.
»» Conferir os limites da capacidade de pesagem, mínima e máxima,
lembrando que em se tratando de análises químicas para a validação de
métodos, esta deverá ser analítica.
»» Constatar a calibração.
»» Realizar as pesagens em temperatura constante, 20ºC ± 1.
44
»» Manusear a amostra com pinças, evitando que possíveis sujidades

fiquem aderidas ao papel de pesagem.
»» Fechar cautelosamente as portas protetoras de vidro da balança até sua
estabilização.
»» Nunca adicionar uma massa acima do limite máximo da capacidade.
»» Realizar a leitura da massa da substância com as portas protetoras
fechadas; Correntes de ar prejudicam a pesagem.
»» Manter a bancada que a balança estiver instalada sem qualquer
vibração.
»» Não desplugar o cabo da balança da tomada quando desligá-la. Essa
conduta pode ser realizada caso não haja a inutilização da balança
analítica por um período maior que um mês.
»» Utensílios adequados (MIRANDA et al., 2012).
»» Deve-se realizar a calibração da balança analítica periodicamente. Para
se realizar tal procedimento, pode-se contratar uma empresa que o
realize.
Magnitude da análise
De acordo com a necessidade da quantidade do analito a ser utilizada nas análises, os

métodos podem ser classificados em macroanálise, microanálise, semimicroanálise e
ultramicroanálise.
A grandeza da análise classificada em conformidade com relação à massa de amostra

empregada está representada na Figura 8.
Figura 8. Representação da relação da classificação da grandeza conforme o tamanho da amostra.
Macro
Tamanho da amostra (gramas)
Tipos de análise
Semimicro
Micro
Ultramicro
0,0001 0,001 0,01 0,1
Fonte: Adaptado de Skoog (1992).
45
A análise de tão baixas quantidades de massa do analito é um fator interessante para

as indústrias químicas/farmacêuticas, uma vez que o custo dispensado para sua
análise, no quesito da amostra a ser utilizada, é relativamente menos dispendioso.
Porém há de se ressalvar a dificuldade em se obter resultados satisfatórios em relação
à precisão e exatidão desses casos (MATTA, 2008).
Para pequenas quantidades de analito, é necessário se atentar quanto à

representatividade e homogeineidade da amostra, pois nessas ocasiões há grandes
chances de essas características serem prejudicadas. Para se evitar que isso ocorra,
deve-se subdividir a amostra em pequenas frações. Essa técnica, quando utilizada,
auxilia para que pequenas quantidades de pós sejam corretamete homogeneizadas
(BUSANELLO et al., 2017).
Cuidados com a amostra
São necessárias algumas precauções no preparo da amostra, não se descuidando

também do intervalo de tempo entre a finalização do preparo da amostra e sua análise.
Para isso, é necessário o levantamento das características do analito e as condições
em que deve ser mantido para que permaneça estável. Amostras fotossensíveis, por
exemplo, devem ser acondicionadas em recipientes âmbar, evitando assim qualquer
tipo de dano. Outro bom exemplo, são as amostras que são sensíveis a temperaturas
elevadas, sendo muito importante que se tenha o controle da temperatura do
ambiente desde a manipulação do analito até análise. A metodologia analítica que
está rotineiramente presente nas indústrias químicas, farmacêuticas e afins é a
cromatografia líquida de alta eficiência, muitas vezes acoplada ao espectofotômetro
de massas. Essa metodologia permite que haja o controle da temperatura aplicada
durante toda a análise (LEITE, 2008).
Para o preparo das amostras, deve-se ter em mente que elas devem ser tratadas de
modo conveniente ao método a ser utilizado. Esse pré-tratamento é realizado a fim
de tornar o analito em sua forma de origem mais homogêneo e também eliminar
possíveis interferentes.
Tratamentos preliminares
Na maioria das vezes, são operações mecânicas como, por exemplo, lavagem,
centrifugação, filtração, secagem, moagem, destilação, liofilização, irradiação, dentre
outras, de acodo com a necessidade de cada caso (LEITE, 2008).
»» Lavagem: geralmente é realizada para a eliminação de possíveis

resíduos. Deve-se ter o máximo de cuidado para que não ocorra perdas
do analito de importância nesse procedimento.
46
»» Centrifugação: invariavelmente, no processo de lavagem das amostras,

é necessário que se faça a centrifugação para que seja efetivada a
separação entre as fases por meio da precipitação, ou seja, a obtenção
do precipitado e, consequentemente, do sobrenadante. Caso o analito de
interesse não tenha ficado no sobrenadante, deve ser descartado e nesse
momento o risco de perda fica evidente.
»» Filtração: é praticada para que ocorra a separação de uma mistura, por

meio de membranas ou filtros específicos (teflon, celulose, nylon, etc.).
Em alguns casos, é nessária a eliminação de partículas em suspensão.
Como, por exemplo, análises por cromatografia líquida de alta eficiência,
em que nesses casos são utilizados pré-filtros de vidro ou também filtros
porosos, os dois com porosidade em escala micrométrica.
»» Secagem: esse procedimento visa à eliminação do teor de água em

amostras sólidas. Para isso, utiliza-se estufa, liofilizador ou dessecador.
É importante que se determine as condições para esse recurso de acordo
com as características e a vulnerabilidade da amostra.
»» Moagem: é sucedida em amostras sólidas com o intuito de reduzir o

tamanho das partículas e/ou a homogeneização dos componentes da
amostra. Para tal evento, geralmente faz-se o uso de um pistilo e gral,
ou de moinhos (que pode ser do tipo: facas, discos, bolas, jatos de ar,
criogênicos, dentre outros) em que ambos são capazes de proporcionar
atrito. A moagem proporciona a facilitação da dissolução, uma vez que
a dimimuição do tamanho da partícula aumenta a relação entre a área
superficial e o volume da amostra.
»» Destilação: no destilador, a destilação simples é praticada nos casos

em que se deseja a separação de amostras compostas por dois líquidos
miscíveis, com diferentes pontos de ebulição (distanciamento mínimo
entre os pontos deve ser de 25ºC) e que estes sejam de no máximo a
150ºC. Também é aplicada essa técnica separação para remoção de
impurezas não voláteis.
»» Além da destilação simples, há a fracionada, a vácuo, a vapor, entre

outras.
»» Liofilização: também é conhecida como criodesidratação ou

criosecagem, a qual é realizada pelo equipamento denominado
liofilizador. Muito resumidamente, ocorre mediante o congelamento da
47
amostra seguido de aplicação de vácuo. Nesse segundo processo, ocorre

a secagem primária e a secundária. Na primária, a água da amostra
é removida por sublimação e adição de calor e, na secundária (ou
dessorção), ocorre a redução da água fortemente ligada. A liofilização é
considerada um processo de estabilização da amostra.
»» Irradiação: é a exposição à radiação, tem sido muito utilizada para a

decomposição e secagem de amostras. Para emulsões, a irradiação por
intermédio de micro-ondas pode ocasionar a sua desemulsificação, ou
seja, provocar a separação entre os compostos líquidos, uma vez que
há uma rápida transferência de energia para a amostra. Em amostras
sólidas, a radiação originada por micro-ondas possibilita a facilitação da
solubilidade devido às altas temperaturas atingidas. Também podem ser
aplicadas a radiação ultravioleta e ultrassom. No caso do ultravioleta,
é muito utilizada para a decomposição de amostras orgânicas. O
ultrassom, com a cavitação acústica em amostras líquidas, como
exemplo em soluções, promove a formação de microjatos, ocasionando
a desagregação e, consequentemente, aumenta a área superficial do
soluto, facilitando sua extração. (NOBREGA, 2019; MATOS, 2013b;
TERRONI et al., 2013
Separação dos analitos
Após o(s) tratamento(s) preliminar(es), como os descritos anteriormente,

normalmente são realizados alguns procedimentos ainda na etapa do preparo da
amostra. Esses procedimentos podem ter como finalidade a remoção ou pelo menos
a diminuição de qualquer tipo de interferente que possa prejudicar a análise quali
ou quantitativa. Como exemplos dessas técnicas, podemos citar a extração líquida,
extração em fase sólida, cromatografia em colunas abertas, destilação, vaporização,
entre outros. Além disso, são realizados também para a pré-concentração do(s)
analito(s).
Análise amostras em solução
A maioria das técnicas analíticas necessita que o estado da amostra a ser analisada
esteja líquido, consequentemente, para os analitos sólidos são frequentemente
preparadas soluções. As amostras em estado líquido apresentam favorável condição
para:
»» O preparo de curvas analíticas.
48
»» Nos casos em que seja necessário utilizar concentrações mais baixas

que a inicial (diluição da amostra), esse processo é considerado
descomplicado.
»» Quando necessário realizar a separação de constituintes.
Porém algumas limitações podem ser observadas, como a instabilidade no analito

da amostra em meio líquido e até mesmo problemas com a solubilidade. Outra
desvantagem desse procedimento é que se acrescentam muitas possibilidades de risco
de variadas falhas no processo geral. Pode-se citar como exemplos dessas eventuais
falhas que podem decorrer desse procedimento perdas da amostra (volatização
solvente), o que consequentemente reflete diretamente na precisão e exatidão dos
resultados obtidos e também nas possíveis contaminações da amostra.
Além do mais, a transformação de uma amostra em sua forma inicialmente sólida para
uma forma líquida pode muitas vezes demandar bastante tempo para sua obtenção
(variando de minutos a muitas horas, ou até mesmo alguns dias), de acordo com a
complexidade da amostra (MATOS, 2013b).
Por conseguinte, nesses casos em que o analito da amostra é sólido e requer estar no
estado líquido, são necessários processos para que ocorra essa transição. Técnicas
de digestão são as comumente utilizadas, como exemplo a dissolução (também
chamada de solubilização) e a fusão do analito. Ambas transformam diretamente a
amostra em uma solução. Frequentemente, esses processos exigem que os reagentes
utilizados apresentem alto grau de pureza, o que gera um custo elevado e fica evidente
novamente a importância de que o analista seja capacitado e de preferência com
experiência na área. Ainda quanto a analitos sólidos que serão preparados em solução
aquosa, há muitos casos em que são requeridas reações químicas para que tal amostra
sólida seja modificada e se encontre em uma condição mais solúvel. Essa técnica é
chamada de decomposição, mas também muito comumente designada como abertura
(MAGALHÃES; ARRUDA, 1998).
Dissolução
A dissolução consiste em transformar um analito que está em sua forma original

sólida em uma solução, sendo esse processo executado de maneira direta, ou seja, sem
maiores técnicas (KRUG, 2006).
49
Decomposição
Como já introduzido anteriormente, existem casos em que o analito sólido necessita

de uma alteração química antecedente para que se proceda sua solubilização.
Depois da modificação química ocasionada, o analito se torna prontamente sóluvel,
formando-se a solução (KRUG, 2006).
Fusão
A fusão, por sua vez, se dá quando ocorre o mesmo cenário que a decomposição. A
amostra sólida exige que se suceda a prévia transformação química para se tornar
facilmente solúvel, e quando essa reação ocorre em temperaturas elevadas, é
denominada fusão (BOCK, 1979).
Para explanar um caso no qual é possível aplicar essa técnica, tomamos como exemplo
uma amostra de silicato (forma de origem: insolúvel), a qual é adicionado carbonato
de sódio e, em seguida, levada em temperatura elevada até seja fundida. Após ocorrer
a fusão e, em seguida, a retirada da fonte de calor, a amostra se solidifica e torna-se
solúvel no solvente apropriado, que nesse caso é o ácido clorídrico.
Na Tabela 1, estão relacionados alguns solventes frequentemente utilizados para a

abertura de determinados analitos.
Tabela 1. Relação de solventes utilizados com a finalidade de se realizar a técnica de decomposição do
respectivo analito.
Solvente Analito Recipiente

Água Analitos hidrossolúveis Vidro
Ácido clorídrico Materiais carbonatos, óxidos e metais Vidro
Ácido fluorídrico Materiais silicosos Cadinho ou cápsula de platina
Ácido nítrico Óxidos e metais Vidro
Ácido sulfúrico Metais Vidro
Fonte: (LEITE, 2008).
Análise direta em amostra sólida
Em contrapartida, algumas análises permitem também que o analito permaneça

em seu estado sólido, realizando, assim, toda a análise diretamente na amostra sem
qualquer tratamento preliminar, o que muitas vezes atrai a atenção do pesquisador
e/ou analista reponsável que delineará o processo. Quando possível se decidir utilizar
50
a amostra no seu estado original, sólida, essa escolha apresenta vantagens em relação
ao método tradicional, que permitirá:
»» Reduzir o tempo destinado ao pré-tratamento da amostra.
»» Atenuar o risco de variadas falhas no processo geral, como a

contaminação por manipulação, utilização de solventes, entre outros.
»» Reduzir possíveis perdas do analito na amostra.
»» Maior segurança para o analista, pois dispensa o manuseio de solventes

potencialmente tóxicos ou corrosivos.
»» Reduzir a produção de resíduos.
»» Melhor desempenho em relação a amostras diluídas, na aplicação de

análises por técnicas consideradas de baixa sensibilidade.
»» E também, em casos que tenham quantidade reduzida de amostra

(KURFÜRST, 1998. KRUG, 2006).
»» Ponderar quanto as desvantagens relacionadas em se analisar

diretamente uma amostra sólida. Como exemplo de inconvenientes,
a necessidade de se ter uma amostra excelentemente homogeneizada
(etapa crítica), caso contrário, a precisão será prejudicada.
Técnicas e suas exigências
Na Tabela 2, estão relacionadas as técnicas analíticas e a condição física aceita da

amostra para a realização da análise.
Tabela 2. Técnicas analíticas e as condições da amostra requeridas para sua análise.
Técnica Condição amostra

Solução Sólida
Volumetria X
Gravimetria X
Espectometria de absorção atômica X
Espectrometria de absorção molecular X
Espectrometria de emissão atômica X
Espectrometria de fluorescência atômica X
Voltametria X
Amperometria X
Potenciometria X
Cromatográficas X
51
Análise por ativação neutrônica instrumental X X

Fluorescência de raios X X X
Espectrometria de absorção atômica X X
Espectrometria de emissão atômica por plasma X X
acoplado indutivamente
Espectrometria de massa por plasma acoplado X X
indutivamente
Espectrometria de emissão atômica com arco X
Faísca X
Ablação com laser X
Baseada em reação de combustão X
Fonte: (KRUG, 2006).
Solução-mãe
Para a realização de análises químicas, como já dito anteriormente, a maioria das
técnicas demanda que a amostra de interesse esteja no estado líquido e, para isso, são
comumente preparadas soluções. As chamadas soluções-mãe são fundamentais nas
análises de quantificação, uma vez que possibilitam, no processo geral, a determinação
da concentração do analito de uma amostra. Pode-se dizer que a solução-mãe é a
solução de maior concentração, a partir da qual se fazem as diluições.
Considera-se que, para o preparo das soluções de trabalho, deva ser utilizada uma
solução estoque, denominada de solução-mãe. A solução-mãe, de concentração
conhecida, após a premeditação das concentrações almejadas e realização do cálculo,
é transferência de uma alíquota para balões volumétricos de menor volume. Em
seguida, os balões são, então, completados até o menisco com solvente previamente
utilizado na preparação da solução-mãe. O mínimo de réplicas (solução de trabalho) a
ser analisado é de 3 soluções para cada concentração predeterminada, como ilustrado
na Figura 9.
Para o cálculo das soluções de trabalho, em que se considera a concentração inicial

(solução-mãe) para que se obtenha o volume necessário para o preparo das soluções
de trabalho, utiliza-se a Equação 9.
Ci .Vi = C f .V f Equação 9
Onde,
Ci = concentração inicial
Vi = volume inicial
52
Ct = concentração final
Vt = volume final
Ressalta-se, ainda, a importância da utilização de vidrarias volumétricas (pipetas,

balões volumétricos) devidamente calibradas para quaisquer procedimentos no
decorrer de todo o processo.
Figura 9. Esquema representativo do processo de obtenção de uma série de soluções de trabalho a partir da
diluição da solução-mãe.
5
4
1
Solução-mãe
O branco
Quando se trata tanto de análise química qualitativa quanto na quantitativa, são

usados os chamados branco analítico. O termo “branco” é utilizado para se referir a
uma porção contendo todos os componentes da amostra que será analisada, exceto
o analito de interesse. Nesse caso, o branco é utilizado para calcular o valor real do
analito, uma vez que o seu valor obtido é subtraído do valor obtido da amostra
completa (analito + demais componentes) (LICHTENBERG et al., 1987; AMARANTE
JUNIOR et al., 2001; KRUG; JUNIOR, 2006).
Nas análises de soluções, as quais contenham uma concentração de analito muito

baixa, o branco é utilizado como um recurso importante. Ele é utilizado nos processos
analíticos com o intuito de captar impurezas e/ou quaisquer possíveis interferentes
dos componentes da amostra, uma vez que é capaz de evidenciar tal informação pela
53
resposta instrumental. Além disso, o branco também possibilita a deteção de traços

de analitos que possivelmente podem ter ficado impregnados em quaisquer utensílios
utilizados como frascos, cubetas dentre outros, ou mesmo no próprio equipamento em
que se realiza as análises.
Consideram-se alguns tipos de brancos, como:
»» Método.
»» Campo.
»» Reagentes.
É denominado branco de método a mistura de todos os elementos químicos utilizados

na amostra total, com excessão do analito de que se trata. O branco de método é
utilizado no decorrer de todo o experimento. Ele é a inferência mais completa para
a colaboração da melhor resolução analítica. Para o cálculo do resultado final da
análise da amostra, deve-se descontar o resultado do branco de método do resultado
da amostra quem contém inclusive o analito (amostra total). Desse modo, tem-se o
resultado da quantidade de analito real na amostra analisada.
Resultadofinal = Resultadoamostra total – Resultadobranco método
É considerado como branco de campo, igualmente como o branco de método

citado anteriormente, com a ressalva de que tenha entrado em contato com o
mesmo ambiente que o da amostragem. Já o branco de reagentes segue as mesmas
elucidações iniciais do branco de método, porém ele não é exposto aos procedimentos
de preparo da espécime.
Então, para melhor fixação do conteúdo visto até o momento, pode-se observar na
Figura 10 o esquema de todo o andamento dos processos básicos, desde o momento
da obtenção da amostra até seu processamento e obtenção dos resultados almejados.
54
Figura 10. Esquema da conduta necessária entre o processamento da amostra e a realização do ensaio.
Amostra em mãos Amostra em mãos
Processamento da amostra
Tratamentos preliminares
A amostra está na forma

de solução?
Sim Não
Propriedade passiva Preparo da amostra:

de ser mensurada? proceder à dissolução,
decomposição ou fusão
Não Sim Eliminar interferências
Alterar a forma
química Realizar medida
Processar dados e
calcular resultados
Estimar a confiabilidade
dos resultados
Fonte: Sousa (2015) com modificações.
Calibração
Como já abordado anteriormente, a calibração é uma das operações mais importantes,
em se tratando de medições analíticas. Tem-se como significação de calibração o
procedimento pelo qual se realiza o ajuste/regulagem de determinado equipamento,
para que se obtenham resultados de acordo com o qual é destinado. Segundo a
definição do INMETRO (2018b), calibração é o:
Conjunto de operações que estabelece, sob condições especificadas,

a relação entre os valores indicados por um instrumento de
medição ou sistema de medição ou valores representados por uma
55
medida materializada ou um material de referência, e os valores

correspondentes das grandezas estabelecidas por padrões.
São raros os casos que o próprio analista pode, de fato, executar a calibração. Na maior
parte das vezes, eles apenas realizam experimentos que determinam se o equipamento
em questão está ou não de acordo com o esperado. Existem laboratórios de calibração
acreditados, ou seja, que estão qualificados a realizar efetivamente a calibração para
terceiros, de acordo com as práticas internacionais definidas em guias internacionais
da ISO. Esses laboratórios são credenciados na Rede Brasileira de Calibração e estão
disponibilizados no sítio eletrônico do Inmetro para consulta online.
Compreende-se também como calibração o procedimento realizado pelo analista,

tanto em análises quantitativas como qualitativas, de se estabelecer em um processo
analítico, volumes ou massas confirmadas, de modo que possibilite a inferência da
concentração de uma outra ainda desconhecida. Ou também incluir parâmetros que
permitam que um composto eluído seja identificado ou quantificado para que seja
considerado padrão.
A seguir, serão abordadas algumas informações relevantes quanto à calibração de

equipamentos e à conduta dos profissionais envolvidos em experimentos analíticos
(LEITE, 2008).
Calibração do equipamento
Para que um equipamento seja calibrado, é necessário que o seu ajuste seja realizado.
Segundo o dicionário Michaelis, ajuste significa: “arranjo para a consecução de
determinado fim; concerto, contrato, convenção”. Logo, entende-se como ajuste
a intervenção que (re)torna o equipamento ou método em seu estado garantido.
Há de se observar a variabilidade e o ajuste da calibração, nos quais essas variáveis
estão justamente relacionadas com a capacidade do equipamento, expressando,
dessa forma, qual influência repercutirá no resultado e, se relevante, tal variabilidade
precisa ser inserida permanentemente (MICHAELIS, 2019).
Verificação
Exige-se dos laboratórios de análises a rastreabilidade pormenorizada dos ensaios

analíticos realizados. A rastreabilidade, segundo o Vocabulário Internacional de
Metrologia é:
Propriedade dum resultado de medição pela qual tal resultado pode

ser relacionado a uma referência através duma cadeia ininterrupta e
56
documentada de calibrações, cada uma contribuindo para a incerteza

de medição (INMETRO, 2012).
Pode se dizer que a confiabilidade e a credibilidade das medições estão fortemente

correlacionadas à rastreabilidade (IPEM-PR, 2014).
Todas as ocorrências devem ser relatadas, como todos os procedimentos e cuidados

com os reagentes que são utilizados na análise, os nomes dos analistas que a
realizaram e operaram o equipamento, quem realizou testes de verificação de
calibração, dentre outras informações detalhadas.
A verificação de calibração é um procedimento de extrema importância. Os testes

de verificação de calibração são aplicados para testar e monitorar a eficiência dos
equipamentos, confirmando se estão funcionando satisfatóriamente. Para essa
verificação, pode-se realizar a avaliação da precisão dos ensaios (quantitativos ou
qualitativos) dessa categoria, por meio do emprego dos protocolos elaborados pelo
controle de qualidade. Porém testes de verificação são utilizados ao se constatar
que a precisão dos protocolos não está sendo aceitável ou ao se pressentir que o
equipamento não está em seu estado de perfeito funcionamento, podendo interferir
negativamente no resulatdo analítico final (SEVERO et al., 2015). Testes como os de
verificação, de adequação, adequação do sistema, traduzido do termo inglês System
suitability, são utilizados como testes capazes de verificar se o equipamento está
verificado (DOLAN, 2004).
A periodicidade da aplicação dos testes de verificação não segue uma regra obrigatória,
ela é estabelecida de acordo com a relevância do ensaio realizado em determinado
equipamento. Entretanto, há a obrigatoriedade de ser realizada a verificação da
calibração todas as vezes que o equipamento passar por qualquer tipo de manutenção
ou também quando houver qualquer tipo de ajuste na metodologia (LEITE, 2008).
O teste de verificação
O teste de verificação, propriamente dito, é executado pelo analista, o qual é discutido

e elaborado pela equipe de pesquisa ou também pelo sistema de confiabilidade da
instituição, de maneira escrita e detalhada, registrando toda consecução que deve
ser seguida para tal. É necessário que o teste de verificação esteja de acordo com o
regulamento da empresa contratada que realiza a auditoria para o laboratório (LEITE,
2008).
Vale resssaltar que alguns testes de verificação da calibração serão abordados

detalhadamente em itens futuros.
57
Periodicidade da calibração
A calibração deve ser verificada de acordo com o definido pelo grupo de confiabilidade
da organização, o qual deverá ponderar as informações do histórico do equipamento,
podendo ser pontual, multipontual e por extremos.
»» Pontual: o teste de verificação de calibração deve ser realizado em

intervalos de tempos preestabelecidos. Somente é possível realizar esse
tipo de verificação da calibração se houver todos os registros de uso e
acompanhamento das manutenções preventivas do equipamento.
»» Multipontual: do mesmo modo que a pontual, o teste de verificação

de calibração também deve ser realizado em intervalos de tempos
preestabelecidos, porém esses intervalos de tempos são menores, ou
seja, com maior assiduidade.
»» Por extremos: nos casos em que a confiabilidade é duvidosa, deve-se

realizar o teste de verificação de calibração todos os dias ou até mesmo
antes de cada análise. Frente a esse tipo de verificação, consideram-se
alguns pontos negativos, como procedimento dispendioso, uma vez que
demandará tempo para sua realização além dos reagentes utililzados
durante o processo de verificação. Outro ponto negativo é que o elevado
número de verificações pode causar inconstância e, por consequência,
oscilações no equipamento (LEITE, 2008).
Certificado de calibração
Com o intuito de se documentar todas as operações e trabalhos que foram destinados

à realização de uma calibração, existe um registro denominado Certificado de
Calibração. Tal documento é expresso pelo Laboratório de Calibração que o realizou,
sendo que este deve ser impreterivelmente reconhecido e creditado pelo Inmetro.
Por intermédio da leitura do Certificado de Calibração de determinado equipamento,

por exemplo, é possível que se verifique minuciosamente todo o processo da
calibração, incluindo as falhas que ocorreram em seu progresso. Esse livre acesso
permite que o analista reveja tais falhas de modo a repará-las (LEITE, 2008).
Considerações finais
Finalizando esta primeira unidade, que discutiu a validação em análises químicas e

a qualidade, apresentamos de maneira geral todo o processo inicial de validações,
58
deixando clara a relação interdependente de todas as etapas do processo para que se

obtenha um resultado satisfatório, como exposto na Figura 11.
Figura 11. Representação da relação e interdependência entre os componentes.
Analista
Preparação Amostra
da amostra
Equipamentos;
sistemas
Fonte: Adaptada de Kogawa (2015).
59
PARÂMETROS NA UNIDADE II
VALIDAÇÃO
CAPÍTULO 1
Os parâmetros
Muitos métodos já validados estão descritos em compêndios oficiais, de modo

que se for justificável seu uso, é necessária apenas uma validação parcial. Caso seja
selecionado algum método para sua posterior aplicação, o qual ainda não tenha sido
publicado em veículos aprovados pela Anvisa, este necessita ser validado de maneira
integral. Como já esboçado anteriormente, em uma validação, são testados alguns
parâmetros indispensáveis. Tais parâmetros estão descritos na Resolução 166/2017,
disponibilizada pela Anvisa. É preciso analisar e estabelecer quais deles são exigidos
para determinada situação. A RDC 166/2017 contém uma relação de possibilidades
e quais são os parâmetros requeridos de acordo com cada uma (BRASIL, 2017a;
BRASIL, 2017b).
Seletividade
Esse parâmetro visa testificar a eficiência do método em quantificar ou mesmo apenas
detectar o componente de interesse na análise. Com isso, ao se utilizar um método
considerado seletivo, podemos garantir que o sinal detectado é único e exclusivamente
do analito e não de interferentes, como dos excipientes, possíveis impurezas e
produtos de degradação. Para a avaliação da seletividade, deve ser utilizada como
comparativo a substância química de referência.
Quando se trata do empenho em constatar a seletividade em métodos de identificação,

é necessária a realização do teste com substâncias análogas a de interesse, assim,
após a aplicação do método, a substância parecida não deve ser indentificada, e
assim sendo, tal resultado será aceito. Da mesma forma, em validações compostas
por quaisquer amostras que contenham substâncias derivadas de vegetais, devem ser
testadas amostras que contenham espécies vegetais similares, e da mesma maneira
como descrito acima, o método seja capaz de diferenciar os compostos analisados.
60
PARÂMETROS NA VALIDAÇÃO │ UNIDADE II
Como já mencionado anteriormente, deve-se assegurar que ao se aplicar o método

não haja interposição de sinais captados, resultantes de possíveis outras substâncias
presentes na amostra (Figura 12). Para isso, deve-se realizar o estudo dos produtos
de degradação e impurezas, prevendo potenciais interferentes na amostra, e
consequentemente, esse conhecimento prévio permitirá o impedimento desse
inconveniente. Além dos produtos de degradação e impurezas, é necessário que seja
comprovado que a matriz e/ou diluentes não prejudiquem a análise.
Resumidamente, para o estudo de produtos de degradação, a amostra deve ser exposta

a diversas condições extremas como em ácido e bases, temperatura, umidade, soluções
oxidantes, soluções de íon metálicos e irradiação de luz direta. Então, essas situações
de exposição antecipam as reações e apontam a geração dos produtos derivados. O
estudo de produtos de degradação é usado principalmente para a determinação do
prazo de validade (LEITE, 2015).
Figura 12. Exemplificação de interposição de sinais detectados em caso de interferentes.
Analito
Interferente
Em alguns casos, o estudo de produtos de degradação é dispensado: quando o

material já tiver sido aprovado pela Resolução 53, de setembro de 2015, que determina
parâmetros para notificação, identificação e qualificação de produtos de degradação
em medicamentos. Também, quando na ocasião se tratar de método de desempenho
ou métodos que não sejam em cromatógrafos.
Precisão
Para que um método seja considerado preciso, ele deve proporcionar resultados que
estejam próximos entre si, ou seja, os valores obtidos nos ensaios com as amostras
devidamente preparadas e expressos numericamente precisam obrigatoriamente
apresentar similaridade. Na precisão, é garantida a reprodutibilidade. A precisão
é obtida com a repetição e pela dispersão dos resultados. Após a organização dos
61
UNIDADE II │ PARÂMETROS NA VALIDAÇÃO
dados obtidos, são realizadas inferências estatíticas. Com esse intuito, basicamente é
calculado o desvio-padrão relativo (DPR), que é alcançado por meio da aplicação da
Equação 32:
DP
DPR
= ×100 Equação 32
CMD
Onde:
DP = desvio-padrão;
CMD = a concentração média determinada.
Para o sucesso no alcance de dados consistentes, algumas considerações devem ser

feitas, como, por exemplo:
»» Ao se tratar de amostras sólidas ou semissólidas, é necessário em muitos

casos que o analito seja previamente dissolvido em solvente indicado
para então dar andamento à análise. A solução obtida a partir desse
procedimento é chamada de solução-mãe. Para a avaliação da precisão,
não são permitidas análises em soluções diluídas de uma única solução-
mãe.
»» Para a repetibilidade ser comprovada, as amostras devem ser analisadas

sob as mesmas circunstâncias, em uma única corrida analítica, no
mesmo equipamento, sem troca do pesquisador que deu início ao
experimento. Deve-se também realizar nove medições, de modo que
abranja o intervalo linear do método analítico que está sendo validado,
sendo assim, analisar três concentrações (com três réplicas), ou também
analisar em sextuplicata individualmente preparadas.
»» A precisão intermediária deve apresentar resultados semelhantes

entre si, advindos de uma única amostra, nas mesmas concentrações
e número de constatações exigidos para a análise da repetitividade, e
que tenha sido analisada no mínimo em dois dias distintos, alterando o
analista.
Também se faz necessária a averiguação da reprodutibilidade, que é realizada

por meio da análise com resultados próximos e que tenham sido executados em
laboratórios diferentes.
62
O propósito em realizar a comprovação de que determinado método analítico é

preciso, é que dessa maneira está apto para repetir e reproduzir resultados quando
aplicado (LEITE, 2008).
Exatidão
O empenho em certificar que um valor constatado é circunvizinho do valor exato é a
corrida incessante pelo resultado impecável. Em uma validação de método analítico,
todos os demais parâmetros têm como objetivo a exatidão. A relação estreita entre
os parâmetros e a exatidão reflete em resultados numéricos almejados, dentro dos
preestabelecidos.
A exatidão de um método é dada quando cada resultado obtido durante o ensaio

tem seu valor próximo ao verdadeiro. Ela pode ser estabelecida por dois métodos,
o de adição de padrão ou pelo método de placebo contaminado. No método de
adição de padrão, são acrescentadas porções conhecidas da substância química
de referência na amostra a ser analisada. Já no método do placebo contaminado, o
fármaco é adicionado em quantidade conhecida a uma mistura dos componentes do
medicamento. Após a aplicação de um dos métodos, é recuperada a quantidade do
padrão ou do fármaco adicionado à amostra e calculado o valor obtido (KOGAWA,
2015).
Para a constatação da exatidão de um método, devem ser avaliadas no mínimo nove

determinações, três concentrações com três réplicas em cada nível de concentração.
A escolha das concentrações a serem analisadas deve englobar o intervalo linear
do método em validação. No caso, as amostras precisam ser preparadas de modo
individual e podem proceder de uma mesma solução-mãe da substância química de
referência.
Conforme o método analítico a ser validado, o direcionamento para a experimentação

deve ser analisado de forma a se decidir qual a maneira mais apropriada a ser
prosseguida. Para isso, o que deve ser analisado é se o método analítico é destinado
para o estudo de insumos farmacêuticos ativos, produtos terminados ou de impurezas.
No caso de insumos farmacêuticos ativos, é necessário que a pureza do fármaco

utilizado na análise seja conhecida. Os resultados coletados durante a aplicação do
método proposto devem ser comparados com resultados de um outro método que já
tenha sido validado, inclusive a exatidão. Quando o insumo farmacêutico ativo estiver
inserido em uma matriz complexa, deve-se realizar o teste utilizando o método de
adição de substância química de referência.
63
Já quando se trata de um método analítico para a avaliação de um produto terminado,

deve-se ter conhecimento da concentração do padrão incluído na matriz. Caso não
possua amostra suficiente de todos os compostos presentes no produto acabado,
é permitida a avaliação pelo método da adição da substância química de referência.
Após a obtenção de todos os dados, estes devem ser conferidos com resultados de um
segundo método já validado.
Nas observações para estudo de impurezas, deve-se empregar o método de adição

de padrão, ou seja, adicionar porções conhecidas de impurezas ou de produtos de
degradação. Se por eventualidade não tiver amostras de determinadas impurezas e/
ou produtos de degradação, é possível que os resultados advindos sejam comparados
com de outro método já validado e a utilização do fator de resposta relativo. O fator de
resposta relativo corresponde à relação existente entre dois fatores de resposta, a qual
é empregada como correção do cálculo da concentração de um ativo, em casos onde
essa determinação é realizada por intermédio da resposta analítica de outro ativo.
Um erro bastante cometido é associar equivocadamente a exatidão com precisão, uma

vez que eles apresentam conceitos divergentes. E o inverso também é verdadeiro.
Observe a Figura 13, a qual exemplifica a diferença entre esses dois parâmetros.
Figura 13. Esquema explicativo do conceito de exatidão e precisão.
- Não preciso - Exato

- Não exato - Exato - Preciso - Preciso
Para que seja realizado o cálculo da exatidão obtido pelo método analítico que está em
processo de validação, deve-se aplicar a Equação 33.
concentração média experimental

Recuperação × 100 Equação 33
concentração teórica
Ou também por meio da Equação 34:
64
CA ( amostra adicionada ) − CA ( amostra )

Recuperação × 100 Equação 34
CTA
Onde,
CA= a concentração experimental do analito;
CTA= a concentração teórica do analito adicionado.
Nos casos em que a validação ocorre parcialmente, vale lembrar que além da precisão
e da seletividade, o parâmetro exatidão deve ser obrigatoriamente avaliado (BRASIL,
2017a).
Linearidade
É considerado linear o método analítico que permite o alcance de resultados
diretamente proporcionais à concentração do composto analisado em uma amostra.
O desafio em realizar a quantificação de derminado analito é conseguir afirmar a
concentração exata da solução analisada, ou seja, ser capaz de certificar o valor da
massa da substância ativa em determinada amostra, com o mínimo de variabilidade
possível, ainda que dentro da permitida.
Para a determinação da concentração do composto de interesse em um análise

química, é preciso que a amostra seja previamente preparada e inserida em
um sistema analítico, o qual emitirá sinais. Tais sinais são instantâneamente
recepcionados em um software, permitindo uma correlação entre esse sinal captado e
a massa ou concentração do analito inserido, gerando uma curva de resposta (LEITE,
2008).
Curvas de respostas, também chamadas de curvas de quantificação ou curva de

calibração analítica, apontam a relação funcional do sinal observado (eixo y), dada
uma certa quantidade de analito (eixo x), a qual é plotada em gráfico de dispersão. Ou
seja, para uma determinada concentração analisada, será obtido determinado valor de
resposta que irá compor tal gráfico. A avaliação da lineariaridade é feita entre o ponto
de maior e de menor concentração analisada.
Visando à constatação da linearidade de um método analítico, é necessária a avaliação

de soluções preparadas com a substância química de referência. As soluções devem ser
analisadas no mínimo em cinco concentrações distintas e com no mínimo três réplicas
de cada. As amostras precisam ser preparadas de modo independente, podendo ser
65
advindas da diluição de uma única solução-mãe. Considera-se preparo indendente

quando é realizada a pesagem individual de cada réplica.
Após a análise das amostras e coleta de dados, devem ser realizados os cálculos
que indicarão se o método pode ser considerado linear ou não. Os dados devem
ser avaliados quanto a sua homocedasticidade, e ainda vale salientar que o nível de
significância para a aplicação dos testes estatísticos deve ser de 5%. Para a exposição
desses resultados, por obrigatoriedade, precisam:
»» Estar representados em gráficos em função da concentração do fármaco

em estudo;
»» Exibir o gráfico de dispersão dos resíduos com a análise estatística;
»» Apresentar equação da reta de regressão, reconhecida com a aplicação

do método dos mínimos quadrados;
»» Considerar por meio dos valores de coeficiência de correlação (r) e de

determinação (r2) a relação linear entre as variáveis e; ressaltando que o
valor do coeficiente de correlação precisa estar acima de 0,990;
»» Avaliar a significância do coeficiente angular (deve ser

significativamente diferente de zero) (BRASIL, 2017a).
Elaboração da curva
Para a elaboração de uma curva de calibração, há duas maneiras comumente

realizadas. Podendo ser por diluição de uma solução-mãe ou pela preparação ponto
a ponto. Há divergências nos valores da curva a serem considerados ideais, a ANVISA
considera entre 80% e 120%, o IUPAC recomenda entre 0 a 150% ou 50 a 150%, e
o ICH aconselha o valor de 20% (LEITE, 2008; BRASIL, 2017; IUPAC, 2002; ICH,
2005).
Curva de calibração por diluição
Para o preparo de uma curva de calibração partindo de uma solução-mãe, deve-

se realizar as diluições necessárias, de acordo com o planejado. Para que isso
aconteça, as amostras a serem analisadas devem ter sido estipuladas, idealizando
uma concentração provável de ser detectada pelo sistema analítico. Com a solução
já pronta, inicia-se o processo de diluição conforme os pontos, que como já dito
anteriormente, deve ser de no mínimo cinco. A seguir, observemos um exemplo de
66
curva de calibração em planejamento, a qual apresentará sete pontos. Para maior

exemplificação, será admitida uma concentração fictícia, presumindo, então, que
a solução-mãe contém 100 mg/mL do analito A, que será usado para a obtenção
das amostras de trabalho. Ainda seguindo o raciocínio do exemplo, os dados das
sete concentrações obtidas a partir da solução-mãe, após serem analisadas em um
determinado equipamento, foram organizados na Tabela 3:
Tabela 3. Exemplificação dos resultados fictícios obtidos a partir da análise das amostras preparadas em sete
concentrações diferentes, originadas da solução-mãe.
Ponto Concentração (mg/mL) Sinal emitido pelo equipamento

1 2 49
2 4 102
3 6 155
4 8 201
5 10 253
6 12 300
7 14 348
É importante ressaltar, como já informado, que para o preparo da solução-mãe, deve-

se obrigatoriamente ser utilizada a substância padrão do analito em questão, a qual é
certificada de que apresentará resultados confiáveis.
Para a construção da curva de calibração, deve-se realizar a plotagem dos dados

em um gráfico, do tipo dispersão (x,y), como na Figura 14, a qual traz os resultados
contidos na Tabela 3.
Figura 14. Exemplo de curva de calibração.
Curva de calibração
400
350
300
250
Sinal
200
150
100 y = 24,839x + 2,4286
50 R² = 0,9995
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Concentração do Amostra Padrão
67
Como é possível observar, o sinal emitido pelo equipamento utilizado na análise

das amostras, apresenta claramente linearidade. Porém, após a plotagem dos dados
no software, é possível e necessária a obtenção da equação do gráfico e o valor do
R-quadrado. No gráfico demonstrado na Figura 14, a equação da reta é y = 24,839x
+2,4286 e com um r2= 0,9995.
Após a obtenção dos dados, para que se realize a análise da relação, utiliza-se o ajuste
de modelos matemáticos de regressão linear (como o método dos mínimos quadrados)
para sua análise (PORTAL ACTION, 2018c).
Regressão linear
Determinar a melhor reta que passa pelos pontos experimentais: regressão linear ou
método dos mínimos quadrados (NUPIS, 2012).
A equação de uma linha reta é:

y= a + bx
Onde:
y = variável dependente;
x = variável independente;
b = inclinação da reta;
a = intersecção no eixo dos y;
Robustez
Este parâmetro indica a competência do método em se obter resultados seguros apesar
da existência de variações mínimas. Sua aplicação foi instituída pela observações
de intercorrências em sinais analógicos, obtidos em equipamentos eletrônicos que
possuiam ponteiros no momento em que ocorriam oscilações da corrente de fundo.
Além de situações quando haviam alterações no uso de substâncias com diferentes
graus de pureza.
A robustez é geralmente examinada durante o desenvolvimento da metodologia

analítica. Para sua avaliação, são impostas possíveis mudanças durante a aplicação do
método e observa-se reflexo. As alterações mais usuais para sua avaliação são:
»» Temperatura durante a análise;
68
»» Grau de pureza dos reagentes ;
»» Constituição e pH da fase móvel;
»» Comprimento de onda.
Podendo haver alterações significantes com as pequenas variações criadas, deve-se

apresentar cautelas que limitem tais alterações. Em se tratando de métodos que visem
à quantificação de analitos, os dados obtidos precisam ser analisados da mesma forma
que os da exatidão.
Anexo III – Condições para a avaliação da robustez do método:
Preparo das amostras:
»» Estabilidade das soluções analíticas;
»» Tempo de extração;
»» Compatibilidade de filtros.
Espectrofotometria:
»» Variação do pH da solução;
»» Diferentes lotes ou fabricantes de solventes.
Cromatografia líquida:
»» Variação do pH da fase móvel;
»» Variação na composição da fase móvel;
»» Temperatura;
»» Fluxo da fase móvel.
Cromatografia gasosa:
»» Diferentes lotes ou fabricantes de colunas;
»» Temperatura.
Outras técnicas analiticas:
»» As variações a serem testadas deverão ser avaliadas criticamente e seus

resultados deverão ser apresentados.
69
Limites
Em todas as análises, de algum modo, são obtidos sinais proporcionais de acordo com
a quantidade de analito analisada. Logo, quanto maior a porção do analito, maior será
o sinal detectado, e obviamente, quanto menor a massa da amostra analisada, menor
será o sinal constatado. A capacidade de determinado sistema captar sinais com a
mínima quantidade possível do analítido é chamada de detectabilidade. Seguindo tal
racíocínio, são percebidos três principais tipos de limites que devem ser avaliados. O
limite do instrumento, o limite de detecção e o de quantificação, os quais serão vistos a
seguir (LEITE, 2008).
Limite instrumental
A empresa que produz instrumentos utilizados em análises para a detecção e

quantificação realiza testes para poder, consequentemente, fornecer a informação da
capacidade de seus equipamentos. Sendo assim, almeja obter os melhores resultados
de forma a qualificar positivamente seu produto no mercado. Para isso, presume-se
que tal empresa tenha efetuado tais análises nas melhores condições possíveis,
solventes ideiais, coluna analítica nova, entre outras. Na prática, muitas vezes não
se vê o cenário originalmente idealizado, podendo, então, deparar-se com muitas
variações, sendo necessária a imposição de limites. O limite instrumental é dado pela
detecção da menor porção de amostra analisada, nas melhores circunstâncias de
trabalho, sem possíveis interferentes.
Limite de detecção
Deve ser estabelecido o limite de detecção ou determinação por meio da avaliação, nas
condições preestabelecidas pelo método em questão, da capacidade de apenas detectar
o analito em determinada amostra em sua quantidade mínima. Essa avaliação pode
ser feita de várias maneiras, dependendo das características que o método analítico
utilizado apresenta. Dentre essas maneiras, são destacados o método visório, a técnica
da razão sinal-ruído, além de fundamentadas nos parâmetros da curva de calibração
ou utilizando o branco.
O limite de detecção realizado em métodos visórios é dado pela menor concentração

que permita a certificação do resultado visual pretendido. Quando o método é
instrumental, a detecção da razão entre o sinal e o ruído (deve ser ≥ a 2:1) precisa
ser detalhada e explicada. Já para a definição do limite de detecção fundamentada em
parâmetros da curva analítica, a Equação 34 pode ser aplicada.
70
3,3.σ
LD = Equação 34
IC
Onde:
LD= limite de detecção;
σ= desvio-padrão;
IC= inclinação da curva de calibração.
O desvio-padrão pode ser definido das seguintes maneiras:
»» Baseado no desvio-padrão do intercepto com o eixo Y, de três curvas de

calibração (ao menos). Essas curvas devem apresentar concentrações
aproximadas das que provavelmente serão identificadas como o limite
de detecção. Seu cálculo pode ser feito por meio da Equação 34;
»» Por meio do desvio-padrão residual da linha de regressão;
»» Segundo a pressuposição de ruído advindos da análise de uma

quantidade adequada de amostras do branco.
Limite de quantificação
O limite de quantificação é ponderado para o conhecimento da menor quantidade

de analito que pode ser estabelecida quantitativamente, utilizando as condições
experimentais recomendadas pelo método, com precisão e exatidão admissíveis.
O processo para se obter resultados que permitam a determinação do limite de
quantificação deve ser similar ao realizado para o limite de detecção, com a Equação
34. A diferença é que deve se considerar a razão sinal/ruído de no mínimo 10:1.
Caso a sua especificação seja feita de acordo com parâmetros da curva analítica, deve
ser aplicada a Equação 35, lembrando de que as concentrações relativas ao limite de
detecção devem ter precisão e exatidão examinadas.
10. σ
LQ = Equação 35
IC
Onde,
LQ= limite de quantificação;
71
σ= desvio-padrão;
IC= inclinação da curva de calibração.
A obtenção do desvio-padrão pode ser realizada da mesma maneira que descrito no

item 4.6.2.
Considerações
A validação parcial deve avaliar, pelo menos, os parâmetros de precisão, exatidão
e seletividade. A seguir, na Tabela 4, estão listados os parâmetros que devem ser
avaliados na validação analítica de determinados ensaios.
Tabela 4. Resumo dos parâmetros a serem avaliados na validação analítica.
Parâmetro Teste
Impurezas Identificação Doseamento*
Quantitativo Ensaio limite
Exatidão X X
Precisão repetibilidade X X
Precisão intermediária X*** X***
Seletividade** X X X X
Limite de detecção **** X
Limite de quantificação X ****
Linearidade X X
Intervalo X X
Fonte: (BRASIL, 2017a).
* Dissolução (quantificação); Uniformidade de conteúdo; potência.
* Nos casos de ensaios de identificação, para que se atinja o nível necessário de discriminação, pode ser necessária a
combinação de dois
ou mais procedimentos analíticos;
* Nas situações em que foi conduzida a reprodutibilidade, não é necessário conduzir

a precisão intermediária;
* Pode ser necessário em alguns casos.
72
ANÁLISE DE DADOS UNIDADE III
CAPÍTULO 1
Princípios da análise dos dados
Considerações iniciais
Há algumas considerações a serem feitas antes os processos de análise estatística
que sejam apresentados. A seguir, serão explanadas algumas operações e reflexões
relacionadas à matemática consideradas básicas, porém, muitas vezes negligenciadas,
atingem diretamente o resultado final da análise.
Algarismos significativos e aproximações
Em geral, é de grande relevância que se tenha conhecimento dos valores exatos

obtidos em quaisquer atividades, uma vez que são realizados arredondamentos nos
resultados de medidas. Em análises químicas, essa compreensão é imprescindível.
Os algarismos significativos são os números obtidos em uma medição, podendo ser
considerados exatos ou duvidosos, como exemplificado a seguir (IPEM, 2019; ITA,
2019).
Em uma análise para validação de um método em cromatografia líquida de alta

eficiência, por exemplo, analisando o mesmo fármaco com o mesmo método analítico
proposto, obtêm-se como resultado de três analistas diferentes os tempos de retenção
(minutos), sendo eles:
»» 12,4;
»» 12,5;
»» 12,6.
73
UNIDADE III │ ANÁLISE DE DADOS
A partir dos valores dos tempos de retenção acima listados, pode-se considerar como
algarismos verdadeiros ou exatos o 1 e o 2, e como algarismos duvidosos os números
depois da vírgula, 4, 5 e 6 (IPEM, 2019; ITA, 2019).
Observa-se outro exemplo de algarismos significativos como resultados obtidos por

uma análise de titulação volumétrica (mililitros):
»» 6,8±0,6;
»» 6,7±0,6;
»» 6,9±0,6.
Em procedimentos que envolvam fatores como a evaporação e a diluição, por

exemplo, é comum que o resultado final seja expresso com todos os algarismos, sem
a realização de aproximações. Pensando no exemplo acima, nos resultados fictícios de
uma titulação volumétrica, caso houvesse a obtenção de mais um resultado e que fosse
de 6,83, o segundo dígito após a vírgula (3) não teria representatividade alguma, pois
o segundo dígito após a vírgula (8) já é considerado duvidoso (LEITE, 2008).
Ao observar os dados abaixo, pode-se constatar a quantidade de números

significativos (ns):
»» 13,50mg (ns= 4);
»» 0,0611mg (ns= 3);
»» 0,0310mg (ns= 3).
São contabilizados os algarismos significativos, observando-os no sentido de leitura

(esquerda para direita), a começar pelo número distinto de zero (IPEM, 2019).
Regras gerais para a realização de operações com

algarismos significativos
Algumas determinações para realizar operações devem ser seguidas.
Em operações como adição e subtração, ao se realizar os cálculos de modo rotineiro,

após o arredondamento, o valor a ser expresso deve ser com o mesmo número de
casas decimais que o valor com menor quantidade de casas decimais (FTBS, 2019).
Observe o exemplo a seguir para a realização da operação matemática adição:
74
ANÁLISE DE DADOS │ UNIDADE III
23,09 mg +
18,90 mg +
19,0385 mg +
30,1089 mg +
12,126 mg +
0,0065 mg +
= 103,2699 mg
O valor obtido da soma é 103,2699mg, no qual o número 6 pode ser considerado

como algarismo menos duvidoso, logo arredonda-se para 103,27mg que é o valor mais
próximo (do que 103,26mg). Como a menor quantidade de casas decimais dos valores
relacionados acima são 2 dígitos após a vírgula, mantém-se o resultado com essa
mesma quantidade (UDESC, 2019). Para a operação matemática, subtração, seguem-
se os mesmos procedimentos:
2707, 299 g –
2112,0 g
= 595,299 g
Podendo ser arredondado o resultado 595,299 para 595,3, uma vez que é o valor mais
próximo e é 1 o número de casas depois da vírgula.
Em multiplicação e divisão, o quociente deverá ser expresso com a mesma quantidade

de números significativos (ou um a mais) que os valores que estão na operação, como
no exemplo a seguir (LEITE, 2008):
10,32 cm x
28,87 cm
= 297,9384 cm
No exemplo acima, deve-se aproximar o resultado obtido para 297,94cm. E tem-se

como exemplo da divisão, a seguinte operação:
1080,38 Kg /
12,24 Kg
= 88,2663 Kg
Para o exemplo acima, deve-se aproximar o resultado obtido para 88,27Kg.
Para a realização de potenciação e radiciação, o quociente deve ser equivalente

à quantidade de algarismos significativos da base, para o caso da potenciação, e do
75
radicando nos casos de radiciação. Como pode ser observado no exemplo (LEITE,
2008):
(1,52 x 10³)² = 2,31 x 106
E para radiciação, o seguinte exemplo:
(0,75 x 104)1/2 = 0,87 x 102
Segundo Leite (2008), um questionamento muito comum se refere aos números

finais. Para o caso que se queira apresentar o algarismo com precisão, de 10-2 (0,001,
como exemplo, 10,23), e seu resultado exibe casas de 10-4 (0,0001, como, por exemplo,
10,2345). Para esse questionamento, deve-se seguir algumas observações impostas,
como as regras de arredondamento que serão apresentadas a seguir.
Regra de arredondamento
Para a aplicação do arredondamento, deve-se seguir as seguintes regras:
»» Não é permitido realizar operações e arredondá-las individualmente.

É necessário que seja feito apenas o arredondamento do valor final da
operação.
»» Caso, no momento de se realizar o arredondamento, tenha-se

antecedente ao último algarismo significativo (ou seja, à sua direita) um
algarismo igual a 5, é necessário proceder à análise observando se esse
número é par ou ímpar. A seguir é representado o exemplo:
›› 18,25: o número que antecede o último número significativo (5) é 2,

um número par, então deve-se manter o mesmo algarismo, ele não
muda, tendo então como resultado o valor 18,2.

ou seja, um número ímpar, e em casos como esse o procedimento a
ser seguido é somar 1 ao número antecedente ao último significativo,
tendo como resultado, 18,4.
»» Caso, ao se realizar o arredondamento, tenha-se antecedente ao último

algarismo significativo um algarismo maior que 5, deve-se adicionar o
número 1 a ele como no exemplo:

ou seja, maior que 5, logo, somando 1 a ele, tem-se o resultado 8,9.
76
»» E por último, ao se realizar o arredondamento, o antecedente ao último

algarismo significativo seja um algarismo menor que 5, deve-se manter
o mesmo inalterado, como no exemplo:
›› 8,12: o número que antecede o último número significativo (2) é 1, ou

seja, menor que 5, logo, mantendo-o sem qualquer alteração, tem-se
o resultado 8,1 (LEITE, 2008).
Unidades quantitativas de medida
As unidades de medidas são essencialmente usadas em análises químicas. Pode-

se afirmar que as mais usuais são os prefixos, centi, mili, micro e nano. A seguir, na
Tabela 5, tem-se a relação de alguns prefixos com seus fatores e símbolos.
Tabela 5. Relação de prefixos e símbolos, conforme Sistema Internacional de Unidades.
Fator Prefixo Símbolo

10 24
Yotta Y
10 21
Zetta Z
1018 Exa E
10 15
Peta P
1012 Terá T
10 9
Giga G
10 8
Mega M
103 Quilo K
10 2
Hecto H
10 Deca Da
10 0
unidade fundamental
10 -1
Deci D
10-2 Centi C
10 -3
Mili M
10-6 Micro M
10 -9
Nano N
10 -12
Pico P
10-15 Femto F
10- 18
Atto A
10-21 Zepto Z
10 -24
Yocto Y
Médias
A média aritmética é considerada como conhecimento necessário essencial para

a estatística básica. Na área acadêmica e das indústrias químicas, é utilizada
77
rotineiramente para a análise de dados. O cálculo da média é realizado com a soma de

todos os valores da variável e dividida pelo número de dados (MARQUES et al., 2011).
Contudo a média aritmética simples pode ser classificada em algumas situações

como imprecisa, entretanto a maioria das análises estatísticas de dados que guiam as
análises químicas faz necessária sua aplicação (LEITE, 2008).
A seguir, serão apresentados os diferentes tipos de médias aritméticas, como a moda,

a mediana, a simples, a ponderada, a geométrica e a harmônica.
Média aritmética moda
A média aritmética moda é determinada como a frequência máxima de um conjunto

de medidas, se possuir acaso uma.
Exemplo: 1, 1, 2, 2, 3, 3, 8, 8, 5, 5, 5, 5, 4, 4, 4, 9, 9, 6, 6, 7, 6, 6.
Observa-se que o valor mais frequente dentre os contidos no grupo de medidas no

exemplo acima é o número 5, que aparece quatro vezes. Logo, 5 é o resultado que
representa a média modal.
Média aritmética mediana
A mediana é uma medida considerada mais realista nos casos em que representa
pelo menos a metade dos valores mínimos e a metade dos valores máximos, quando
comparada à média aritmética, moda e a simples. Para sua análise, é necessário que se
organize os dados, em ordem crescente, e então se obtenha o valor da mediana. Tem-
se o exemplo a seguir para tal observação.
Exemplo de medidas obtidas:
2, 2, 5, 5, 4, 4, 4, 8, 8, 6, 6, 7, 9.
Dispondo esse mesmo grupo em ordem crescente de valores, obtêm-se:
2, 2, 4, 4, 4, 5, 5, 6, 6, 7, 8, 8, 9.
Após a organização dos dados, pode-se observar que dentre o grupo com 13
algarismos, o valor da mediana é 5. Para os casos em que o grupo de medidas
apresentar número par de medidas, a mediana será o valor que estiver ao meio de
duas medidas centrais. Porém, imaginando que no mesmo exemplo acima houvesse
apenas um valor de medida 5, a mediana então seria 5,5 (LEITE, 2008).
78
Média aritmética simples
A média aritmética simples é a mais aplicada dentre todos os tipos. Mas como já
comentado anteriormente, em alguns casos, ela se apresenta imprecisa. Nos casos em
que há medidas que se apresentam distantes entre si, a representatividade da média
se torna enganosa. Observem o exemplo do conjunto de valores das concentrações
obtidas em dois diferentes tipos de medicamentos novos em fase de teste.
Conjunto 1: valores: 4, 5, 6, 7, 8 = média 6
Conjunto 2: valores: 2, 4, 6, 8, 10 = média 6
No conjunto 1, os valores estão mais próximos entre si, comparado ao conjunto 2,

logo a média aritmética simples de resultado igual 6, melhor representa o conjunto
de valores do conjunto 2. A Equação 10 abaixo, representa a média aritmética comum
(LEITE, 2008).
∑
n
Xi
X= i =1 Equação 10
n
Onde,
n
∑X = soma de todos os valores obtidos;

i =1
i
n = números de medidas.
Tem-se o seguinte exemplo, quatro medidas de pH foram realizadas em uma mesma

amostra, sendo representadas na Tabela 6.
Tabela 6. Valores fictícios de medidas de pH para exemplificação da média aritmética simples.
Número de medidas Valores

realizadas obtidos
1 7,2
2 5,1
3 6,4
4 7,6
26,3
Conforme a soma das medidas, 26,3 divide-se pelo número de medida realizadas
(26,3/4), resultando em 6,575.
79
Abaixo, uma forma diferente de simbolizar a medida da média aritmética comum,

disposta pela Equação 11.
X1 + X 2 + X 3 +  + X n
X= Equação 11
n
Média aritmética ponderada
A média aritmética ponderada deve ser calculada, em um primeiro momento, da

mesma forma que a média simples, porém atribui-se pesos sobre o conjunto de
valores obtidos, conforme a repetição desses valores (LEITE, 2008). Abaixo, é possível
observar o seguinte exemplo:
Conjunto de valores obtidos: 3, 5, 3, 3, 5.
Organizando esse mesmo grupo, obtêm-se: 3, 3, 3, 5, 5.

3+3+3+5+5 =3,8
X=
5
A partir, dessa média inicialmente simples, observa-se que o valor 3 foi obtido três
vezes e o valor 5, duas vezes. Então, seguindo com o cálculo:
3,3 + 5,2 9 + 10
=X = = 3,8
5 5
Média aritmética geométrica
A média aritmética geométrica, dentre todos os tipos de média, é a mais complexa.

Para a realização do seu cálculo, faz-se a extração da raiz n do fator dos membros do
conjunto de medidas (LEITE, 2008). Logo, pode-se observar a Equação 12, abaixo,
que pondera os resultados:
X=n abcn Equação 12
Usando como exemplo os valores obtidos 3, 2, 4, a média aritmética geométrica

alcançada será:
=
X 3
3  2=
4 =
3
24 2,8845
80
Média aritmética harmônica
Para a média aritmética harmônica, observa-se a Equação 13 a seguir:
1
X=
1 1 1 1
+ + + Equação 13
a b c d
n
Para exemplificar esse tipo de média, toma-se como exemplo a obtenção do conjunto
de medidas: 2, 4, 3, 3 (LEITE, 2008).
1 1 0,71
=
X = = = 0,18
1 1 1 1 1,41 4
+ + +
2 4 3 3 4
4
Considerações finais
É necessário que o analista, ao realizar o cálculo de quaisquer tipos de média, tenha

critérios para a sua aplicação, de modo a evitar resultados tendenciosos.
Erros
O conceito de erro de medida é comumente associado ao termo desvio-padrão, porém

tal conceito tem significados distintos (LEITE, 2008).
Entende-se como conceito de erro a subtração do valor obtido na medida e o seu valor
real ou correto.
erro = valor medido – valor real
E o desvio-padrão é dado pela diferença entre um valor obtido ao se medir uma

grandeza e um valor adotado, que mais se aproxima do valor real. Na pratica,
trabalha-se, na maioria das vezes, com desvios e não com erros (LEITE, 2008).
∑ (x − MA )²
n
i
DP = i =1
n
Onde,
Σ = somatório de todos os termos, desde a primeira posição até a posição n;
xi = valor na posição i no conjunto de dados;
81
MA = média aritmética dos dados;
n = quantidade de dados (GOUVEIA, 2019).
Qualquer medida realizada em análises químicas está sujeita a variações, as quais

são denominadas de erro de medição. Consequentemente, avaliando um resultado,
pode-se concluir que qualquer medida experimental está sujeita ao erro, ou seja,
haverá sempre uma diferença entre o valor dito verdadeiro e o valor medido. Pode-se
determinar alguns tipos de erros como:
»» Erros grosseiros;
»» Erros sistemáticos;
»» Erros indeterminados.
Erros grosseiros
Os erros grosseiros são considerados de fácil observação e detecção, de modo que

o analista percebe e consegue facilmente corrigi-lo, como a troca de unidades de
medida, erro de digitação entre outros. É aconselhável que haja a conferência de outro
analista (duplo checagem), pois caso passe despercebido na primeira leitura, tenha a
possibilidade de ser identificado.
Erros sistemáticos
Pode-se dizer que os erros sistemáticos são aqueles que ocasionam desvios de medida,
como os erros instrumentais, erros de impurezas, erros de operação, erros pessoais,
erros de métodos, dentre outros.
Erros indeterminados
Erros indeterminados são erros de difícil controle, advindos de modo aleatório.

Como exemplos de erros dindeterminados, têm-se umidade, temperatura, pureza do
reagente dentre outros (LEITE, 2008).
Análise estatística
Após a obtenção dos dados por meio da técnica de análise selecionada, é necessário
que haja a organização dos dados, visando ao tratamento desses resultados e, assim,
posteriormente, aplicar o teste estatístico ideal. A Anvisa elaborou e disponibilizou
82
um guia com recomendações para essa etapa do processo, mais especificamente

quanto à avalição estatística da linearidade e do efeito matriz, Guia Para Tratamento
Estatístico da Validação Analítica, com o objetivo de orientar e auxiliar o
cumprimento da Resolução RDC no 166/2017, já citada anteriormente, que é a
normativa em vigência (BRASIL, 2017).
A análise estatística é uma ferramenta que proporciona respaldo para a correta

conclusão dos dados. Para que a aplicação do modelo estatístico ideal seja realizada,
alguns pressupostos devem ser atendidos previamente, ou seja, há uma necessidade
de se esquadrinhar esses modelos para a compreensão de seus pressupostos,
e concomitantemente verificar se os dados obtidos os atendem. É de extrema
importância que essa etapa seja respeitada e realizada, pois, caso contrário, as
conclusões feitas possivelmente serão errôneas (BRASIL, 2003).
Avaliação estatística na linearidade
Sabe-se que o parâmetro da linearidade corresponde à competência em se propiciar

resultados analíticos diretamente proporcionais à concentração do analito, segundo
um determinado método analítico. Obviamente que, de acordo com o método a ser
validado, apresentará uma resposta analítica relativa a sua habilidade. Como exemplo
de diferentes respostas analíticas, podemos citar o volume usado da solução titulante,
a absorbância, a área do pico, entre outros.
Para o tratamento dos dados de validação, como exigido pela RDC 166/2017, as
medições devem ser realizadas de maneira independente, sendo um pressuposto a
se atender. Dessa maneira, as amostras devem ser obrigatoriamente preparadas de
maneira independente, o que significa que a substância química de refêrencia deve ser
realizada em diferentes pesagens.
Porém, quando essa conduta, de se realizar o preparo de amostras independentes já no

princípio da experimentação, ou seja, desde a pesagem do analito, não for executável
e consequentemente obedecida, aconselha-se a preparação das soluções segundo uma
mesma solução estoque, contando que essa solução estoque seja produzida a partir da
pesagem da substância química de referência. Vale ressaltar que a análise da mesma
solução não é satisfatória para a aplicação dos modelos estatísticos que serão descritos
a seguir.
Com a intenção na verificação e avaliação da linearidade, os resultados devem ser

plotados em um gráfico no qual deve ser construído uma reta analítica (como já
83
explicado na anteriormente), de forma a possibilitar a constatação de que a resposta

analítica é realmente proporcional à concentração do analito.
Para o método que será exposto a seguir, depende da elucidação do centroide, que
é a localização (𝑥; 𝑦), na qual 𝑥 é média aritmética dos valores de x, e 𝑦 é a média
aritmética dos valores de y (BRASIL, 2003).
Análise aparente
Com o gráfico devidamente plotado, a primeira análise que se deve realizar é a análise
aparente, ou seja, a análise efetuada visualmente. Essa análise viabiliza a observação
dos pontos determinados no gráfico, se são ou não aparentemente lineares, como o
exemplo exposto na Figura 15.
Figura 15. Representação de gráficos linear e não linear.
Obviamente que apenas com essa análise não há fundamentação para que seja feito
qualquer tipo de afirmação/conclusão, porém aconselha-se que se faça antes de
realizar a análise com modelo estatístico propriamente dito. Se, por eventualidade, na
análise visual for constatado que os pontos não apresentam linearidade, nenhum dos
modelos matemáticos poderá ser aplicado.
A equação do modelo proposto é a mesma já apresentada anteriormente,

considerando que a resposta analítica deve ser diretamente proporcional à
concentração para cumprimento da normativa (RDC 166/2017). O método sugerido
que utiliza a aferição da equação é o método dos mínimos quadrados, que, se aplicado
diretamente, sem qualquer fator de ponderação, é chamado de método dos mínimos
quadrados ordinários. Nos casos em que o método possui um fator de ponderação, ele
é denominado de método dos mínimos quadrados ponderados. Também, o método
dos mínimos quadrados ordinários pode ser considerado como uma particularidade
do método dos mínimos quadrados ponderados, o qual seu fator de ponderação é
84
equivalente a 1. Após a determinação do modelo a ser utilizado, a equação da reta é

obtida e empregada na elucidação dos valores da regressão. Os valores obtidos nesse
seguimento serão indispensáveis para a análise de variância (ANOVA) (BRASIL,
2003). A ANOVA é um conjunto de modelos estatísticos, nos quais esses modelos
testam a variância das amostras em questão de maneira fragmentada em diferentes
componentes em virtude dos diferentes fatores (PORTAL ACTION, 2018a).
Segundo Cruz da Silva (2018, p. 31) é “Uma análise de variância (Anova) rejeita ou
não a hipótese de igualdade de médias populacionais de diversos grupos, mas não
determina quais grupos têm médias estatisticamente diferentes”.
Como se pode constatar na afirmação acima, a Anova é capaz de responder apenas

se há ou não diferença entre as médias analisadas, porém não consegue apontar qual
média específica é diferente de qual, sendo ainda necessária a aplicação de um teste
com essa habilidade (CRUZ DA SILVA, 2018). O teste da Anova será explanado com
detalhes em um dos próximos itens.
Selecionando o método dos mínimos quadrados

ordinários ou método dos mínimos quadrados
ponderados
Nessa etapa, para que nortear a definição de qual dos métodos se aplicar, deve-
se avaliar a homocedasticidade dos dados. A homocedasticidade é a variância
entre os resultados da variável y para a variável x, podendo ser homocedásticos ou
heterocedásticos. São considerados homocedásticos, os dados que apresentarem
a variância de y constante, nesses casos opta-se por aplicar o método dos mínimos
quadrados ordinários. Entretanto, se os dados não apresentarem a variância de y
constante, ou seja, os dados são heterocedásticos, o método que deverá ser admitido
é o médoto dos mínimos quadrados ponderados. Se por uma eventualidade, o método
provavel a ser utilizado for o dos mínimos quadrados poderados e utilizarem o dos
mínimos quadrados ordinários, os resultados podem ser considerados tendenciosos.
Para a estimativa da variância dos valores de y para cada um dos níveis de

concentração, aplica-se a Equação 14:
Syi 2= 1 m − 1 ∑ ( yij − yi ) 2 m j= 1 Equação 14
Onde:
j= j-ésimo resultado para o conjunto de réplicas i;
m= o número de medidas (réplicas) para a resposta analítica y em cada ponto.
85
Homocedasticidade dos dados
Como visto anteriormente, é necessária a conferência da variância dos dados para

a escolha do método estatístico a ser utilizado e, consequentemente, a condução do
teste. Para isso, o teste de Cochran é recomendado, onde se dispõem as hipóteses:
H0 : σ2y1 =σ2y 2 =σ2yi ... =σ2yi


= H1 pelo menos um dos σ2yi 's diferente,
= i 1,2,... , n
Onde:
σ2yi = a variância dos valores de y para um determinado nível de concentração.
O H0, hipótese nula é que as variâncias sejam todas iguais e H1, hipótese alternativa,
demonstra que pelo menos uma das variâncias seja diferente das outras.
Onde:
S2ymax maior variância em y

=C =
∑ i S yi soma de todas as variâncias em y
n 2
Onde:
C= razão entre a maior variância observada para os conjuntos de dados de y e a

soma das variâncias de y observadas para todos os níveis de concentração.
Compara-se ao valor crítico, o valor de C calculado com nível de significância de 5%.
Logo, no caso de o C calculado ser menor que o C crítico, a conclusão é que se aceite a
hipótese nula (dados homocedásticos). Mas caso o C calculado seja maior ou igual ao
C crítico, rejeita-se a hipótese nula (dados heterocedásticos).
Para consulta, estão descritos na Tabela 7, os valores de C crítico ao nível de

significância de 5%.
Tabela 7. Valores de C crítico com nível de significância de 5%.
Número N° de medidas (réplicas) para a variável y

de pontos 2 3 4 5
5 0,841 0,684 0,598 0,544
6 0,781 0,616 0,532 0,48
7 0,727 0,561 0,48 0,431
8 0,68 0,516 0,438 0,391
9 0,638 0,478 0,403 0,358
10 0,602 0,445 0,373 0,331
86
11 0,57 0,417 0,348 0,308

12 0,541 0,392 0,326 0,288
13 0,515 0,371 0,307 0,271
14 0,492 0,352 0,291 0,255
15 0,471 0,335 0,276 0,242
16 0,452 0,319 0,262 0,23
17 0,434 0,305 0,25 0,219
18 0,418 0,293 0,24 0,209
19 0,403 0,281 0,23 0,2
20 0,389 0,27 0,22 0,192
Fonte: (BRASIL, 2003).
A aplicação do método dos mínimos quadrados

ordinários
O método dos mínimos quadrados ordinários pode ser utilizado nos casos em que os
dados forem homocedásticos. Para isso, os coeficientes são estimados de acordo com a
Equação 15.
∑ ni=1 ( xi − x )( yi − y ) 
b= Equação 15
 ∑ ni=1 ( xi − x )²
e
a= y − b
Onde:
b = a inclinação da reta;
a = o intercepto.
Todos os pontos da reta estão passíveis de trazer consigo um erro possivelmente

ocasionado durante toda a experimentação, e dito isso, consequentemente atribui-se
esse erro à resposta analítica, que se refere ao y, porém tal erro pode também estar
nos coeficientes.
A aplicação do método dos mínimos quadrados

ponderados
Os coeficientes da reta de regressão precisam ser calculados ao se utilizar o método

dos mínimos quadrados ponderados. Para a realização dessa estimativa dos
coeficientes, emprega-se um fator de ponderação, o qual, por sua vez, é atribuído por
87
meio do opoente de s2i , que é a variância de y, ponderando a média harmônica das

variâncias de y.
Pensando que é indicado:
»» cada ponto da reta de regressão como (x1, y1), (x2, y2), (x3, y3)... ou (xi,
yi)... ou ainda, (xn, yn)... ;
»» os seus desvios-padrão como s1, s2, s3... si... sn;
»» e depois de estabelecidos, os pesos individuais como w1, w2, w3...wi... wn.
De modo que os pesos individuais podem ser calculados por meio da Equação 16.
s i−2
wi = Equação 16
∑ ni=1 si−2 /n
E após a obtenção dos pesos individuais, considera-se a Equação 17.
∑ ni=1 w i x i y i − nx w y w
bw = Equação 17
∑ ni =1 w i x 2i − nx 2w
a=
w y w − bx w
Onde:
bw= inclinação ponderada da reta;
x w e y w = coordenadas do centroide ponderado;
aw = intercepto ponderado.
Os coeficientes
Para se certificar da linearidade do método, a significância do coeficiente angular

[representa a inclinação da reta em relação ao eixo das abscissas (x)] deve ser
indispensavelmente demonstrada, em concordância com a normativa RDC 166/2017.
Conforme o método que está sendo validado, esta verificação traz a possibilidade de se
obter esclarecimentos relevantes. Com essa finalidade, a análise do coeficiente angular
é realizada por intermédio do teste F da Anova.
88
Para a constatação se o coeficiente linear [representa o valor numérico por onde

a reta passa no eixo das ordenadas (y)] é ou não estatisticamente diferente de
zero, é aconselhada a aplicação do teste t. A resposta almejada desse teste é que o
coeficiente linear não apresente diferença estatística, ou seja, que seja semelhante a
zero. Contudo, como existe a possibilidade de haver diferença estatística de zero,
faz-se necessário uma investigação para prever a repercussão dessa resposta frente
linearidade do método em processo de validação. Outros fatores também podem ser
julgados, como talvez a interferência no sinal analítico que está sendo observado de
quaisquer dos componentes utilizados na amostra em análise, ou também avaliar o
valor do coeficiente linear em relação as concentrações analisadas.
Sintetizando a lógica dos critérios a serem tomados, deve-se reavaliar a linearidade do

método em validação nos casos em que:
»» o coeficiente linear se apresentar estatisticamente diferente de zero;
»» se apresente a importância significativa para o sinal analítico.
Por fim, se ocorrer de o intercepto ser estatisticamente diferente de zero e com

grandeza significativa em relação às respostas analíticas, aconselha-se utilizar uma
curva de calibração em vez de um só ponto exclusivo para a padronização da análise.
Análise de variância (Anova)
Ainda sobre a análise dos dados obtidos para a avaliação da linearidade do método em
validação, a aplicação da análise de variância possibilita verificar se a reta de regressão
estimada em questão é capaz de esclarecer proficientemente a relação que há entre a
concentração do analito e o sinal detectado pelo equipamento utilizado na análise.
É importante se dizer que, de acordo com o método utilizado, podendo ser o método
dos mínimos quadrados ordinários ou o método dos mínimos múltiplos quadrados
ponderados, a Anova utiliza fatores diferentes para o cálculo.
A Anova é processada por intermédio da análise das fontes de variação do sistema em

sua totalidade (regressão, resíduos, total).
»» A regressão é a variação dos resultados analíticos em relação à

amplitude do modelo;
»» Resíduo é variação das respostas analíticas reais em relação aos erros;
»» Total é a soma das variações da regressão e dos resíduos. É

imprescindível para se atestar a linearidade a constatação de que o
89
y varia em relação ao x. Para isso, deve-se apresentar que a variação

correspondente à regressão (modelo) é consideravelmente maior que a
variação decorrida ao erro (resíduos).
A Anova aplicada em método dos mínimos quadrados

ordinários
Na realização da Anova para o método dos mínimos quadrados ordinários, deve-se

proceder às somas dos quadrados. A Equação 18, apresenta as somas dos quadrados.
n n n
∑ ( y i − y )= ∑ ( yˆ i − y ) + ∑ ( y i − yˆ i )²
2 2
Equação 18
=i 1 =i 1 =i 1
Onde:
𝑦 = a média aritmética dos valores de y no centroide;
𝑦𝑖= um valor individual de y obtido experimentalmente em um determinado ponto

(i-ésimo ponto);
ŷ𝑖= um valor individual de y calculado pelo modelo (equação) em um determinado

ponto (i-ésimo ponto);
n= o número total de pontos;

n
∑( y − y ) = a soma dos quadrados total, também conhecida como SQTot;

2
i
i =1
n
∑ ( ŷ − y ) = a soma de quadrados da regressão, também conhecida como SQReg;

2
i
i =1
n
∑( y − yˆ i ) = a soma de quadrados devidos aos erros (ou resíduos), também

2
i
i =1
conhecida como SQRes;
Podendo ainda ser expressa conforme a Equação 19, logo abaixo.
SQTot = SQReg + SQRes Equação 19
Posteriormente, com a resposta das somas dos quadrados, é possível calcular os

quadrados médios. Para o cálculo dos quadrados médios, deve-se dividir as somas
dos quadrados pelo número de graus de liberdade. Logo, obtêm-se a Equação 20
[(Quadrado Médio da Regressão (QMReg)], a Equação 21 [(Quadrado Médio dos
Resíduos (QMRes)] e Equação 22 [Quadrado Médio Total (QMTot)].
90
= 1( y
∑ − y )²
n
i
QMRe g = i Equação 20
p −1
= 1( y
∑ − ˆy ) ²
n
i
QMRe s = i Equação 21
n−p
= 1( y
∑ − y )²
n
i Equação 22
QMTot = i
n −1
Onde:
p= o número de parâmetros do modelo.
Para essa situação, o valor do número de parâmetros do modelo é igual a dois (p=2).
Sabendo disso, é possível calcular o valor de F. O valor de F pode ser obtido realizando
a divisão do quadrado médio da regressão (modelo) pelo quadrado médio dos resíduos
(erros).
A partir daí, pode-se obter o valor de F, dividindo-se o quadrado médio da regressão

(modelo) pelo quadrado médio dos resíduos (erros). A seguir, pode-se observar pela
Equação 23 a obtenção do valor de F.
∑ ( )
n
i
= 1 ˆy i − y ²
p −1 QMReg
=F = Equação 23
∑ i = 1 ( y i yˆ i )² QMRes
n
n−p
Para melhor elucidação e fixação, os valores considerados para a Anova no MMQO

estão apresentados no Quadro 1.
91
Quadro 1. Esquema com as informações da Anova nos métodos dos mínimos quadrados ordinários.
Fonte Graus de
Soma de quadrados Quadrado médio F Hipóteses
variação liberdade
= 1( y
∑ − y )²
n
ˆ
= 1( yˆ − y )
∑
i n 2
Regressão p–1 i
i
i
p −1
∑ ( )
n
i
= 1 ˆy i − y ²
∑ 1 ( y i − ˆy ) ²
n
= 2 p −1 QMReg H0: b = 0
1 ( y i − ˆy ) F
∑i =
n
Resíduos n–p i
= =
∑ i = 1 ( y i yˆ i )² QMRes
n
n−p H1: b ≠ 0
n−p
= 1( y
∑ − y )²
n
∑i 1( yi − y )
n 2
Total n–1 i i
=
n −1
Fonte: Adaptado de Brasil (2003).
Ainda no que se refere às hipóteses, após a realização da conferência do valor de F

frente a um valor crítico, e consequentemente, de acordo com a resposta, há a
possibilidade de rejeitar ou aceitar a hipótese nula, que é de b=0.
Caso o Fcalculado seja maior ou igual ao valor de F(𝛼,1,𝑛−2) :

Rejeita-se a hipótese nula de que b= 0 e entende-se que y varia, sim, em função de x,
e que o método pode ser considerado linear.
F(0,05;1;𝑛−2) tem distribuição de probabilidade F de Snedecor com 1 grau de liberdade no

numerador e n-2 graus de liberdade no denominador ao nível de significância de 5%.
A Anova aplicada em método dos mínimos quadrados

ponderados
Os mesmos fatores de ponderação devem ser aplicados na Anova, ao se utilizar o

método dos mínimos quadrados ponderados. Apesar de se seguir o mesmo raciocínio
empregado para a Anova do método dos mínimos quadrados ordinários, as fórmulas
diferem.
Novamente, para melhor elucidação e fixação, os valores considerados para a Anova

no método dos mínimos quadrados ponderados estão apresentados no Quadro 2.
92
Quadro 2. Esquema com as informações da Anova nos métodos dos mínimos quadrados ponderados.
Fonte Graus de
Soma de quadrados Quadrado médio F Hipóteses
variação liberdade
∑ w i ( ˆy i − y ) ²
n n
∑w i ( y i − y )
2
Regressão p–1 i =1
i =1 p −1
∑ = 1wi ( yî − y ) ²
n
i
∑ w i ( y i − yˆ i ) ²
n n
p −1 H0: b = 0
∑w ( ˆy − y)
2
Resíduos n–p i i
i =1 F=
∑ = 1wi ( yi yî ) ²
n
i =1 n−p H1: b ≠ 0
i
n− p
∑ w ( yi − y ) ²
n
∑ w ( yi − yî )
n 2
Total n–1 i =1 i
i =1 i
n −1
Fonte: Adaptado de Brasil (2003).
Lembrando que o raciocínio do método dos mínimos quadrados ordinários referente

à Anova é o mesmo para o método dos mínimos quadrados ponderados, o F crítico e a
regra de decisão para a hipótese nula.
A correlação linear
Depois de ter decidido o modelo, o coeficiente de correlação de Pearson (r) pode ser
ponderado. A correlação de Pearson é capaz de demonstrar o grau de associação linear
entre as variáveis em questão. Para que essa correlação seja calculada, deve-se seguir
de acordo com o método usado. Se o método selecionado foi o método dos mínimos
quadrados ordinários, utiliza-se a Equação 24 descrita a seguir para calcular o valor
de r.
∑ = 1 ( X i − X ) ( y i − y ) 
n
i
r= Equação 24
 n =−
∑ 1 ( X i X ) ²  ∑ i =
1 ( y i − y ) ²
n
 i  
Onde:
r= coeficiente de correlação de Person.
Se o método selecionado foi o método dos mínimos quadrados ponderados, utiliza-se

a Equação 25 descrita a seguir para calcular o valor de r.
93
∑ w ∑ w x y − ∑ w x ∑ w y
n n n n
i i i i i i i i
rw = i i i i
w ∑ w x − ( ∑ w x ) ²   ∑ w ∑ w y − ( ∑ w y ) ² 
Equação 25

 ∑
n n 2 n n n 2 n
i i i i i
 
i i i i  i i i i i i i
Onde:
rw= o coeficiente de correlação de Pearson ponderado.
Considera-se que quanto mais forte for a correlação entre as duas variáveis estudadas,
maior será o valor de r. Também, quanto mais verdadeiro for o modelo proposto
(equação), maior o valor de r.
De acordo com a RDC166/2017, para que o valor de r ou o valor de rw seja aceito, esse
valor ser de no mínimo 0,990. Para que seja realizada a aproximação dos valores de r
e rw, devem ser consideradas pelo menos 3 casas decimais (BRASIL, 2003).
A análise de resíduos
São denominados de resíduos a diferença entre o valor determinado de y e o valor

estimado pelo modelo (equação) em um determinado ponto da reta, (𝑦𝑖 − 𝑦̂𝑖).
Com o valor do resíduo, a distância entre o valor real e o valor estimado pode ser
dimensionada. Sabe-se que muitos erros podem ocorrer no percursso de toda a
análise, quando os erros do modelo são decorrentes meramente das variações normais
de análises, pressupõe-se que os resíduos tenham distribuição normal e que sejam
independentes entre si. Isto é:
εi ~iid N ( 0, σ² )
É indispensável que os pressupostos básicos para análise da variância sejam

conferidos. A normalidade, a independência e a homocedasticidade devem ser
sempre examinadas. Orienta-se que a investigação da normalidade dos resíduos seja
realizada:
»» Primeiramente, pela a avaliação visual do gráfico.
»» Por testes estatísticos de normalidade. Alguns exemplos de testes

estatísticos de normalidade são o Shapiro Wilk, Lilliefors, gráficos de
probabilidade ou histograma.
94
Para que seja realizada a observação visual do gráfico, a distribuição de todos os

resíduos em função da concentração e também da resposta deve ser acrescentada.
Para tal fim, é recomendado que seja por meio de uma linha reta no valor de média e
outras duas linhas delimitando os valores prováveis (esperados).
Na Figura 16, pode ser observado um gráfico de distribuição de resíduos em função

da resposta analítica para a sua apreciação. Nessa figura, os dados aparentam ser
homocedásticos, ou seja, a variância dos resíduos parece ser constante.
Figura 16. Gráfico de distribuição dos resíduos em função da resposta analítica.
Fonte: (BRASIL, 2017b).
Os valores esperados podem ser ponderados pela aplicação de testes como o de

Grubbs, D de Cook, além de outros com esse intuito. Alguns valores poderão ser
atípicos, apresentando um amplo afastamento dos demais valores do grupo de
dados. Quando ocorrer essa situação descrita, tais valores aberrantes são chamados
de outliers. Frente a esse contexto, deve-se esquadrinhar qual(is) a(s) possível(is)
razão(ões) decorrente(s) da análise que está originando tais valores desarranjados.
Para a elucidação e maior fixação de todo o processo descrito até o momento, quanto à
análise estatística dos dados referentes ao parâmetro linearidade, o fluxo substanciado
está organizado na Figura 17.
95
Figura 17. Fluxograma para avaliação de linearidade.
Avaliação aparente
Sim É visualmente linear? Não
Tratamento
Conferência da variância dos
matemático dos
dados (teste de hipóteses) dados para que se
adapte ao modelo
Apresenta
Sim homocedasticidade? Não
Heterocedástico (Método dos

Homocedástico (Método dos
mínimos quadrados ponderados)
mínimos quadrados ordinários)
Anova e Correlação (Método dos Anova e Correlação (Método dos

mínimos quadrados ordinários) mínimos quadrados ponderados)
Valor de r e teste F
Análise de resíduos
Todos os requisitos da RDC nº

Sim 166/2017 foram atendidos? Não
Linearidade Linearidade reprovada (método

comprovada pode não ser aceito)
Fonte: (BRASIL, 2017b).
Avaliação estatística do efeito matriz
O efeito matriz é um estudo de seletividade, que tem por sua finalidade investigar
interferências presumíveis, que podem ser provocadas pelos componentes
constituintes da amostra. Tais interferentes podem ocasionar fenômenos de ampliação
ou diminuição da resposta ou sinal que o instrumento proporciona (PORTAL
ACTION, 2018b).
Para que haja a constatação de que não esteja ocorrendo o Efeito Matriz, ou seja,
comprovar sua ausência, de acordo com a RDC nº 166/2017, é preciso que se
apresentem as retas em paralelo das retas de concentração versus resposta analítica
96
da solução da amostra fortificada com a substância química de referência e da solução

apenas com a substância química de referência.
Então, para que seja realizada a constatação de que as retas são realmente paralelas,
utiliza-se a observação dos coeficientes angulares, os quais não devem apresentar
diferença estatística. Outra maneira de comprovar que as retas são paralelas é
comparar as suas inclinações, valendo o mesmo preceito de que não devem ser
estatisticamente diferentes.
Logo, para se averiguar se as inclinações das retas são diferentes, ou não, há algumas
formas para se obter essa resposta. Mas antes de qualquer posicionamento, devemos
nos lembrar de conferir se os pressupostos estão sendo satisfatórios.
Um exemplo de uma das formas de se averiguar se as inclinações das retas são, ou

não, estatisticamente diferentes é avaliar o efeito matriz por meio do teste t. Ressalta-
se que somente poderá ser aplicado o teste t de maneira apropriada se o conjunto de
dados em que se pretende avaliar possibilite determinar corretamente a variância dos
valores contrastados. Sendo assim, deve haver a comparação de um número devido
de curvas. Esse número de curvas deve estar de acordo com a variância dos dados,
de modo que quanto maior for a variância, maior deverá ser o número de curvas
comparadas.
É indispensável que se comparem as variâncias dos grupos individualmente, os quais

se pretende testar para que, desse modo, seja feita a adequada aplicação do teste
t. O método de cálculo do teste t está sujeito ao fato de as variâncias apresentarem
igualdade ou não, por isso as variâncias da curva de solvente contaminado com a
substância química de referência e da curva de amostra também contaminada com a
substância química de referência devem ser comparadas entre si.
Por conseguinte, deve-se realizar a comparação das variâncias por meio do teste F de
Snedecor para que, então, posteriormente, o teste t possa ser aplicado. Para tanto,
será estabelecida uma equação da mesma forma que na linearidade (Equação 26 e 27)
para cada reta da substância química de referência em solvente e amostra fortificada
com substância química de referência (BRASIL, 2017a).
y1= a1 + b1 x1 + ε Equação 26
Onde:
y1= sinal analítico para a curva de calibração obtida com SQR em solvente;
x1= concentração da SQR em solvente (grupo 1).
97
a1 = intercepto da curva de calibração obtida com o SQR em solvente;
b1 = inclinação da curva de calibração obtida com o SQR em solvente;
ε = erro do modelo.
y2= a2 + b2 x2 + ε Equação 27
Onde:
y2= sinal analítico para a curva de calibração obtida com a amostra fortificada com
SQR;
x2= concentração do analito nas amostras fortificadas com SQR (grupo 2);
a2 = corresponde ao intercepto da curva de calibração obtida com a amostra

fortificada com SQR;
b2 corresponde à inclinação da curva de calibração obtida com a amostra

fortificada com SQR;
ε = erro do modelo.
Admite-se que os erros (?) são indepententes e semelhantemente distribuídos

como uma distribuição normal com média 0 e variância (??), N~(0, ??). No teste t, as
inclinações das retas ajustadas de acordo com as Equações 26 e 27, as quais foram
descritas acima, são comparadas por meio do teste da hipótese nula de que as
inclinações da reta são similares, ou seja, que as retas realmente sejam paralelas.
Nessa situação temos, portanto, a seguinte hipótese:
H0 : b1 = b2

 H1 : b1 ≠ b2
No caso em que o teste F revelar que as variâncias são iguais, deve-se aplicar a
Equação 28 para realizar o cálculo do valor T.
b−b
T= 1 2
Equação 28
 
Sb − b
1 2
Onde:
 = estimativa de b , usando as n observações do grupo 1;

b 1 1 1
 = estimativa de b , usando as n observações do grupo 2;

b 2 2 2
98
Sb−b  = estimativa do desvio-padrão da diferença entre os coeficientes angulares

1 2
dos modelos. Este desvio-padrão é igual à raiz quadrada da variância apresentada a

seguir na Equação 29.
 1 1 
=S2b − b SP,y/x
2
 +  Equação 29
 ( n1 − 1 ) S x1 ( n 2 − 1 ) S x2 
1 2
2 2
De modo que, S2P,y/x =

( n1 − 2 ) S2y/x1 + ( n2 − 2 ) S2y/x 2
n1 + n 2 − 4
Onde:
S2y/x1 = quadrado médio do resíduo para o grupo 1;
S2y/x2 = quadrado médio do resíduo para o grupo 2;

S2x1 = variância dos X para o grupo 1;
S2x2 = variância dos X para o grupo 2.
Em seguida, deve-se comparar o valor de T que foi encontrado com o valor de T

crítico, ponderando:
- n1 + n2 – 4 graus de liberdade e;
- Nível de significância de 5%.
Por conseguinte, para a interpretação do resultado, caso o Tcalculado seja maior ou igual
ao Tcrítico, a conduta que se deve ter é de rejeitar a hipótese nula e declarar que existe
efeito matriz significativo, logo o método em questão não pode ser considerado como
satisfatoriamente seletivo.
Ressalta-se que é necessário haver proposições de medidas corretivas que reduzam os

devios existentes no resultado advindo pelo efeito matriz.
Porém, caso a hipótese nula seja aceita, ou seja, se o Tcalculado for menor que o Tcrítico,
pode ser presumido que não haja efeito matriz significativo e, consequentemente,
pode se declarar que as retas de regressão são paralelas e que é possível que a mesma
inclinação seja aplicada em ambos os modelos (BRASIL, 2017b).
Com isso, têm-se então as Equações 30 e 31.
y 1= a1 + b 3 x + ε e Equação 30
y 2= a 2 + b 3 x + ε Equação 31
99
CHECAGEM DA UNIDADE IV
CALIBRAÇÃO
CAPÍTULO 1
Testes de verificação de calibração
Teste geral e individual

Para testes de verificação de calibração de equipamentos que serão utilizados em
experimentos analíticos, é relevante estipular a interferência que o equipamento terá
sobre a análise, em um cenário em que não estejam calibrados. Devem ser delineados
os testes capazes de trazer qual a situação do equipamento quando confrontado com
equipamentos em perfeito estado de uso.
Para a realização dos testes de verificação de calibração, existem duas maneiras para
tal procedimento:
»» Um teste geral; e
»» Testes individuais do equipamento.
Para o teste de verificação da calibração por meio de um teste geral, é muito

interessante que se disponha de valores de referência, como uma análise previamente
padronizada pelo próprio fabricante do equipamento ou um histórico de padrão. Tais
referências são vantajosas no que se relaciona à questão de gastos, além de também
serem mais acessíveis ao responsável pela análise.
A curva de calibração é uma ferramenta utilizada em teste geral para verificações

de calibração, uma vez que proporciona a conferência entre os valores obtidos em
uma análise quantitativa. Para isso, utiliza-se para a sua construção o analito de
interesse na amostra. Conforme visto anteriormente, após a obtenção das medidas e,
consequentemente, dos dados a serem plotados (concentração do analito no eixo x, e
sinal analítico obtido em relação à concentração no eixo y), há a averiguação da faixa
de maior linearidade e posteriormente a aplicação da regressão linear.
100
CHECAGEM DA CALIBRAÇÃO │ UNIDADE IV
Empresas ou organizações idôneas, as quais são certificadas para tal, viabilizam a

prática com a comercialização dessas soluções em concentrações atestadas e, assim
sendo, comumente elas indicam as circunstâncias em que devem ser realizadas as
curvas de calibração. Logo a análise das soluções adquiridas para a construção da
curva de calibração deverá apresentar os valores pré-confirmados pela empresa que a
forneceu.
É recomendada a elaboração da curva de calibração antes de todas as execuções das

análises efetivas, porém é sabido que tal conduta demanda tempo do analista para
a executar, além do padrão e os solventes necessários, portanto, o custo aumentaria
significativamente em todas as análises.
A outra maneira para a verificação da calibração é por meio de teste individual. Testes
individuais consistem, como o próprio nome sugere, em verificar individualmente
determinado parâmetro considerado crítico do equipamento. Para reflexão, pode-
se imaginar que o termostato de um equipamento encontra-se descalibrado e,
consequentemente, há a alteração da temperatura para 5ºC a mais que o ideal
estabelecido para a realização da análise. Essa alteração estaria prejudicando o
produto final, o analista já identificou que o motivo dessa alteração era essa elevação
da temperatura e logo a tomou como ponto crítico para a análise. Dessa maneira,
deduz-se que seria fundamental a realização do teste individual do ponto crítico
indentificado.
No caso do teste individual, aparentemente é atraente tanto quanto o teste geral, e

realmente pode o ser. Porém, pensando em casos em que a análise a ser realizada
apresenta vários pontos críticos, os custos obviamente com a verificação da calibração
pelo teste individual tornam-se sem dúvidas muito mais custosos.
Observações relevantes
Como visto anteriormente, no teste geral utiliza a curva de calibração para a
verificação da calibração. O uso da curva de calibração é viável apenas quando
o equipamento apresenta-se prévia e devidamente calibrado. Dito isso, algumas
observações são fundamentais para sua aplicação, como:
»» Devem ser garantidas as melhores condições analíticas possíveis

(temperatura, pressão, fluxo, dentre outras) para a análise das soluções
e sua posterior elaboração.
101
UNIDADE IV │ CHECAGEM DA CALIBRAÇÃO
»» É importante que a concentração do analito seja a mesma em se

tratando de análises qualitativas, isso porque uma vez alterada (tanto
para mais quanto para menos) a concentração, obviamente o sinal
dectectado pelo equipamento também será diferente.
»» Recomenda-se a constatação do estado efetivo do equipamento por

meio da comparação dos coeficientes angulares, coeficientes lineares
e coeficientes de correlação de curvas anteriormente elaborados com a
curva em evidência.
»» Evidentemente que, para as análises quantitativas, a concentração

do analito nas soluções deve ser meticulosamente semelhante. De
maneira que a comparação entre os valores dos fatores de respostas
obtidos com os valores previamente obtidos em outras análises permita
a constatação de que o equipamento permanece em condições estáveis
para sua utilização.
A seguir, na Figura 18, um resumo das etapas a serem realizadas para o cálculo da
variação dos fatores de resposta.
Figura 18. Esquema das etapas para a variação de resposta.
Definição das Preparação das

concentrações soluções para a curva
de uso (mínimo de 5 pontos)
Cálculo da variação Plotagem dos dados Medições e

dos fatores de (concentração coleta de dados
resposta versus área)
Para o cálculo da variação dos fatores de resposta, é utilizada a Equação 35, descrita a
seguir.
% Variação =
( FR maior − FR menor )  100 Equação 35
Média dos FR
Onde:
FR= fator de resposta.
102
Testes de verificação de calibração

A seguir, serão discutidos alguns exemplos práticos de maneiras de se verificar a
calibração (testes individuais e teste geral) da técnica de cromatografia líquida de alta
eficiência, uma das mais usadas em análises químicas, além de apresentar algumas
de suas particularidades. Obviamente que existem muitas outras técnicas utilizadas
no cotidiano de analistas laboratoriais, como a cromatografia gasosa, infravermelho,
ultravioleta, eletroforese capilar, entre outras que necessitam de testes de verificação
de calibração e que cada uma deve ser analisada com suas particularidades.
Cromatografia líquida de alta eficiência
A cromatografia líquida de alta eficiência é uma das técnicas de identificação e

quantificação mais utilizadas em testes analíticos no ramo das indústrias químicas e
farmacêuticas. O nome cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) foi derivado do
Inglês, high performance liquid chromatography (HPLC) (SILVA; COLLINS, 2011).
Toda essa notoriedade da técnica, segundo COLLINS (1997, p. 17) é:
Devido a facilidade em efetuar a separação, identificação e

quantificação de espécies químicas, a cromatografia ocupa um lugar de
destaque entre os métodos analíticos modernos, podendo ser utilizada
isoladamente ou em conjunto com outras técnicas instrumentais de
análise.
A CLAE tem como fundamento a compartimentação de uma mistura de fases

imiscíveis entre si, as quais são chamadas de fase móvel e fase estacionária. A
fase móvel é um solvente líquido que elui perante alta pressão no interior da fase
estacionária, a qual é uma coluna cilíndrica recheada com partículas finamente
divididas (BRAGA, 2018; SOUZA, 2017; COLLINS; GUIMARÃES, 1988).
Com a aplicação dessa técnica analítica, pensando como uma análise qualitativa,
possibilita-se a separação de compostos análogos, contidos em amostras complexas e
também a sua posterior identificação. Ademais, é possível realizar a quantificação dos
tais compostos, uma vez já estabelecido e validado o método, com alto desempenho.
O tempo de análise também é uma característica atraente da técnica, além da alta
sensibilidade e resolução (SOUZA, 2017; COLLINS et al., 2006).
Vale também citar a cromatografia líquida de ultraeficiência, do Inglês ultra-high

pressure liquid chromatography ou ultra-high performance liquid chromatography
(UHPLC), que segue o mesmo embasamento que CLAE, porém possibilita análises
muito mais rápidas e eficientes. Sua agilidade e eficiência foram alcançadas
103
basicamente com a utilização de fase estacionária contendo partículas reduzidas e

com dimensões menores da própria coluna cromatográfica (MALDANER e JARDIM,
2012).
Princípios da técnica
O sistema cromatográfico é composto resumidamente por um solvente, ou mistura de

solventes, que conta com a cooperação de uma bomba de alta pressão e é conduzido
para o interior da coluna cromatográfica, de modo que a amostra a ser analisada é
concomitantemente injetada por meio do injetor, juntamente com a fase móvel, e
arrastada para a coluna. Dessa maneira, a evolução da separação dos compostos
presentes na amostra é iniciada e, após a saída da coluna, é conduzida para o
detector que, por sua vez, capta o sinal emitido pelos compostos. Assim, o software
organiza o sistema de dados depois de receber o sinal do detector. Nesse sistema de
dados, é possível observar todo o desempenho durante a análise, além do próprio
cromatograma obtido. Na Figura 19, é possível observar o esquema de maneira
ilustrada.
Figura 19. Ilustração breve de um sistema de cromatografia líquida de alta eficiência.
Sistema
de dados
Injetor de
amostra
Detector
Bombas
Coluna
Solvente
Descarte
Fonte: Bernegossi (2019) com base em Ibsen Photonics (2019).
O mecanismo que rege a separação de fases, ou também pelo tipo de fase estacionária
e fase móvel utilizada (partição, adsorção, troca iônica, exclusão, por afinidade e quiral
entre outros), define o tipo da cromatografia. Pode-se dizer que as fases estacionárias
habitualmente utilizadas são as colunas de fase reversa e as colunas de fase normal. A
fase estacionária normal é convencionalmente formada por grupamentos polares, e a
fase estacionária reversa, por grupamentos apolares. As fases estacionárias normais
104
demandam o uso da fase móvel (solventes) menos polares, e as fases estacionárias

reversas, mais polares.
Dito isso, é importante ressaltar que depois do reconhecimento das particularidades

da amostra a ser analisada, por exemplo, a sua polaridade, é possível determinar quais
as características que a fase estacionária e a fase móvel idealmente devem ter. Em um
cenário no qual a amostra for polar, deve-se almejar o uso de uma fase estacionária
normal e de uma fase móvel menos polar. E pensando no oposto, em posse de uma
amostra apolar, investe-se em fase estacionária reversa, e fase móvel polar (SOUZA,
2017).
Testes de verificação de calibração de cromatografia

líquida de alta eficiência
Por se tratar de uma técnica altamente sensível, quaisquer pequenas variações têm o
potencial de alterar significativamente o resultado final. Umas das mais influentes são
a temperatura e o fluxo constante da fase móvel.
Nos casos em que há oscilações na temperatura, sugerem-se algumas verificações

imediatas para sua estabilização:
»» Temperatura do recinto em que o equipamento está em funcionamento;
»» Checagem da temperatura da coluna cromatográfica;
»» Verificação do detector.
»» As consequências acarretadas com a queda na temperatura durante a

análise podem ser observadas:
»» O arredondamento do pico cromatográfico;
»» Atraso no tempo de retenção;
»» Transtorno na integração da área do pico;
»» Prejuízo na capacidade de separação dos analitos.
Tempo de retenção é o tempo percorrido desde a injeção da amostra contendo o

analito no cromatógrafo até a saída do ponto máximo do pico dessa substância.
Já quando a questão do inconveniente é decorrente do fluxo constante da fase móvel,

deve-se estar atento aos solventes de alta volatilidade. Em casos nos quais o solvente
105
ou a mistura de solventes são muito voláteis, pode haver o desequilíbrio do fluxo da

fase móvel prejudicando diretamente o resultado final.
Nas ocasiões em que há a variabilidade no fluxo constante da fase móvel, é indicado

que se faça a averiguação de alguns pontos para que seja realizada sua regularização.
Dentre esses pontos, podem ser citados:
»» Possíveis vazamentos nos tubos capilares.
»» Conectores mal encaixados e/ou rosqueados.
»» Vedação dos recipientes que acondicionam os solventes.
»» Perda pela volatilização de um dos solventes (ocasionando o

desalinhamento das bombas).
»» Caso haja a inconstância de fluxo da fase móvel durante a análise, as

principais repercussões observadas são:
›› Adiantamento ou atraso no tempo de retenção;
›› Queda da linha de base;
›› Não arraste do(s) analito(s) pela coluna cromatográfica, ficando nela

retido(s).
Teste individual de verificação da calibração
A seguir, serão contemplados alguns elementos como injetores, forno, fluxo

constate da fase móvel, temperatura do ambiente, volume do looping de injeção,
sistema isocrático ou gradiente, eluição, sensibilidade e detectabilidade do detector,
gradiente e linearidade do detector ultravioleta para o aclaramento quanto ao teste de
verificação da calibração, de forma individual (LEITE, 2008).
»» Injetor de amostra: um dos itens que normalmente passa despercebido,

mas que merece uma atenção especial quando a temperatura do sistema
é considerada como ponto crítico da análise. Logo a temperatura do
injetor, caso necessário, pode ser regulada com a instalação do sistema
de encamisamento.
»» Forno: a calibração da temperatura desse item é de extrema

importância, uma vez que é responsável pelo comando da temperatura
da coluna cromatográfica. Dessa maneira, qualquer descalibração
106
interferirá diretamente no tempo de retenção e na resolução

cromatográfica como já comentado anteriormente, de modo, então, que
se faz necessária a verificação de sua calibração rotineiramente.
»» Fluxo contínuo de solventes: tal como apresentado anteriormente, a

evaporação do(s) solvente(s), o desalinhamento de bombas, possíveis
vazamentos por conectores podem interferir no fluxo de solventes. Além
desses fatores, pode-se mencionar que a temperatura do fluxo pode ser
aferida.
»» Verificação da variação da temperatura da fase móvel, Equação 36:
t ×∆ Tr Equação 36
Onde,
t= temperatura
Tr= tempo de retenção
∆Tr = sob condições analíticas previamente exploradas, essa variação

pode ser calculada pela subtração dos tempos de retenção entre os
picos.
»» Verificação da variação da vazão do fluxo contínuo de solventes de

acordo com o número de pratos teóricos da coluna cromatográfica,
Equação 37:
2
 Tr 
N = 16   Equação 37
 Wb 
Onde,
N= número de pratos teóricos;
Tr= tempo de retenção;
Wb= Largura da base do pico.
»» Verificação da variação da vazão do fluxo contínuo de solventes de

acordo com a resolução cromatográfica, Equação 38:
2∆t
R= Equação 38
Wb1 + Wb2
107
Onde,
∆Tr = variação da subtração dos tempos de retenção entre os picos;
R= Resolução entre dois picos;
Wb1= Largura da base do pico 1;
Wb2= Largura da base do pico 2.
A faixa apontada como satisfatória é de 1, 0 ou 4σ
»» Looping de injeção = a verificação da calibração do looping de injeção

é mais um dos itens considerados importantes. Nos casos em que o
looping de injeção apresentar variações do volume injetado, terá como
reflexo a modificação do sinal emitido pelo detector, obviamente por
haver a alteração da quantidade da massa no analito injetada. Para que
seja possível a verificação do looping, o procedimento a ser realizado
é removê-lo da válvula de injeção e adicionar em seu interior, com o
auxílio de uma seringa, solução de NaOH 0,01N fatorado. Após esse
procedimento, aconselha-se a realização da titulação do volume
introduzido no interior do looping com HCl 0,01N fatorado. Dessa
maneira, é possível se obter o volume do looping.
»» Bombas: tanto para o sistema isocrático como para o sistema gradiente,

é primordial que a(s) bomba(s) estejam constantemente estáveis. Caso
haja variações no compasso das bombas ou a mistura de solventes
ineficiente, fatores como a alteração no tempo de retenção serão
constatados. Logo, para a verificação da calibração da(s) bomba(s), é
executável com checagem da repetitividade do tempo de retenção do
analito ou de uma amostra padronizada.
»» Eluição dos analitos: a eluição pode ser afetada durante a análise com
oscilação da polaridade do solvente e amostra. Observa-se o cenário,
caso ocorra a oscilação, e uma amostra polar penda para apresentar
maior afinidade pela coluna cromatográfica normal (polar), certamente
será observada a retenção do analito no interior da coluna. Para
a verificação da ocorrência de tal situação, aguarda-se o tempo de
análise previamente designado para a total iluição do(s) analito(s)
e após o tempo teórico da análise ter passado, ao se permanecer com
o fluxo contínuo de solvente, ainda assim será possível a observação
de vestígios do analito. Como restabelecimento da situação, deve-se
108
realizar a lavagem do sistema até total arraste do analito do interior da

coluna cromatográfica e, posteriormente, inciar nova análise.
»» Detector: a verificação da calibração do detector do cromatógrafo líquido

de alta eficiência deve ser estimada. Sua variação de sensibilidade e
detectabilidade pode ser analisada por meio da temperatura, da relação
sinal-ruído e também pela observação da formação de resíduo.
»» Temperatura: deve-se estar atento à variação da temperatura do

detector, pois ela reflete propriamente na viscosidadade da mistura
de fase móvel e analito(s). Vale ressaltar que detectores de índice
de refração devem ter o controle da temperatura assegurada para a
conferência com o padrão.
»» Formação de resíduo: esse fenômeno pode ser ocasionado pela

cristalização da amostra ou caso o sistema de filtração não tenha sido
competente para a eliminação de partículas, de maneira que ocasione a
retenção de tais partículas no detector. Eventualmente, quando ocorre
a retenção de partículas, haverá repercussão na diminuição do sinal
detectado, ou mesmo na interdição da execução da análise em si. Nos
casos de detectores UV/VIS, é possível a conferência se houver formação
de resíduo, interferindo na detectabilidade por meio da análise de uma
solução padrão.
»» Relação sinal/ruído: pode-se avaliar a variação da sensibilidade e

detectabilidade do detector, conferindo a relação do sinal/ruído.
Para isso, deve-se realizar a análise de um padrão e de seu branco, e
posteriormente, por meio da Equação 39, determinar a relação.
S 2h
= Equação 1
R bR
Onde,
S= sinal;
R= ruído;
h= altura;
bR= ruído da linha de base.
109
Deve-se salientar que para a realização do cálculo do ruído da linha de

base, é preciso que seja determinada uma faixa do cromatograma que
não apresente nenhum pico cromatográfico e, além disso, essa faixa
corresponda no mínimo trinta vezes à largura da meia altura do pico.
»» Detector ultravioleta: é sabido que em algumas análises por CLAE,

se faz necessária a utilização de uma rampa do gradiente. Com isso,
é importante verificar se tal rampa pode ser considerada linear,
conferindo, dessa maneira, credibilidade à análise realizada. Leite
(2008) sugere que para a averiguação da linearidade do detector
ultravioleta, deve-se substituir a coluna cromatográfica por um capilar
de teflon e, em seguida, no comprimento de onda de 254nm, realizar
a análise com a mistura de solvente A (água) e solvente B (acetona
0,01%), aplicando o gradiente conforme a Tabela 8.
Tabela 8. Porcentagem de solventes A e B para o gradiente.
Solvente A (%) Solvente B (%)

100 0
80 20
50 50
20 80
0 100
Fonte: Leite (2008).
Seguindo tais instruções, espera-se que seja permitida a verificação da linearidade do

gradiente e, de modo consequente, pode-se constatar a linearidade do detector.
Teste geral de verificação da calibração
CLAE é uma técnica que contém um conjunto de fatores que comanda o seu perfeito
desempenho e que interfere de maneira geral e direta na análise, caso um desses
fatores sejam desarranjados. Por isso há uma preocupação exacerbada com a
temperatura, com o fluxo contínuo de solventes e com a detecção dos sinais emitidos
pela amostra, que são as principais condições que regem o todo.
Para uma análise considerada apenas como qualitativa em CLAE, tem-se como
apreciação de dado para a identificação do componente de interesse o tempo de
retenção do próprio analito no cromatograma. Realizada a exploração da amostra nas
mesmas condições analíticas, deve-se obter obrigatoriamente sempre o mesmo tempo
de retenção dos analitos, servindo como uma forma de identidade para. Vale lembra
110
que as análises qualitativas não são conclusivas e também é importante enfatizar a

necessidade de se ter um palpite quanto ao analito em estudo, pois obviamente que
terão outros analitos com tempo de retenção muito próximo entre si.
Procedimentos como a padronização externa em mesmo solvente ou também a

padronização externa por adição da amostra podem ser realizados como testes de
verificação geral para as análises quantitativas, que são os que mais se destacam.
Adicionalmente, presume-se que se confirmem indiretamente todos os elementos
que constituem o cromatógrafo líquido de alta eficiência e que estejam em excelentes
condições de uso no geral (sistema de detecção, bombas, injetor de amostra, coluna
cromatográfica), pode-se realizar a construção de uma curva de calibração com padrão
para a sua verificação.
É válido, ainda neste momento, a significação dos termos “padrão externo” e “padrão
interno”. Em análises químicas, padrão interno representa uma amostra modelo, a
qual é adicionada em concentração previamente estabelecida do analito, em padrões
e na amostra a ser analisada. Já o termo padrão externo é usado quando o padrão
e a amostra de interesse são comparados, dependendo da técnica de análise (em
CLAE, por exemplo, pelo tempo de retenção do analito), após serem analisadas
separadamente, possibilitando a sua identificação (LEITE, 2008).
111
INCERTEZAS UNIDADE V
CAPÍTULO 1
Incertezas de medição
Segundo Oliveira (2017, p. 52), o que se entende por incerteza de medição é:
um valor que se origina da combinação de vários componentes

que podem ser estimados com base na distribuição estatística
dos resultados de séries de medições, caracterizadas pelo desvio
padrão experimental e através de distribuições de probabilidades
consideradas, com base em informações e na experiência adquirida.
A incerteza das medições está intimamente relacionada com o termo variabilidade

dos resultados, erros ocasionados no decorrer da análise como, por exemplo, a
amostragem; procedimentos quantitativos, como a transferência de volumes (por
provetas, balões volumétricos, buretas, pipetas), realização da pesagem, entre outros.
Todas as operações envolvidas trazem incorporadas algumas variações, que podem
ser acumuladas, resultando, então, nas incertezas.
Algumas outras percepções de incerteza são feitas por Leite (2008), tais como:
»» a faixa de valores aceitável em relação ao seu valor central, emitida por

algarismos significativos;
»» o parâmetro calculado da dispersão dos valores obtidos, os quais

acompanham o resultado;
»» a estimativa do desvio-padrão, desde que originada num intervalo de

confiança.
As incertezas relacionadas à medida obtida são valores que dão significância ao

processo de análise estatística. Elas podem ser obtidas por meio de medidas diretas e
indiretas.
112
INCERTEZAS │ UNIDADE V
Determinações diretas
Em algumas determinações, as incertezas podem ser avaliadas diretamente, como
uma medida realizada para aferição do pH de uma determinada solução (LEITE,
2008).
»» Temperatura;
»» Agitação;
»» Limpeza do eletrodo;
»» Valor do potencial hidrogeniônico.
Determinações indiretas
Já nos casos em que o valor da incerteza não permite ser determinado de maneira
direta, estima-se com base em sinais emitidos pelo instrumento operado e seus valores
extremos. Ainda seguindo o exemplo dado da aferição do pH de uma determinada
solução, têm-se como exemplos de incertezas de medição indireta:
»» Variação da corrente elétrica;
»» Temperatura do ambiente;
»» Ruído eletrônico;
»» Robustez do equipamento.
É necessário que os fatores que emitem a incerteza sejam passíveis de serem

quantificados mesmo que indiretamente. Ainda, são classificados em dois tipos
de possíveis fontes de erro, como fator de efeito sistemático, quando não são
reconhecidos, e de fator de efeito aleatório, quando sua estimativa é realizada
por meio do desvio-padrão. Além disso, a incerteza pode ser considerada como
padronizada, a qual é derivada por uma fonte de erro (faixa de dispersão em torno
do valor central). A incerteza combinada é a união de todas essas incertezas, quando
ponderadas. A seguir, serão comentadas a incerteza padronizada por repetição, a
incerteza padronizada por informações e a incerteza combinada (LEITE, 2008).
113
UNIDADE V │ INCERTEZAS
Incertezas padronizadas repetição
Também é chamada de incerteza tipo A a incerteza padronizada por repetições, de

maneira aleatória. Como sua denominação já sugere, é obtida por meio de repetidas
medidas do mensurado (LEITE, 2008).
Incertezas padronizadas informações
É denominada de tipo B, também caracterizada como aleatória, e é fundamentada em

constatações de dados como de histórico de medidas já realizadas ou também outros
documentos que permitam estimar a incerteza. Por intermédio do cálculo de diversas
fontes de erros, ainda assim é preciso que seja estimado apenas um valor centralizado.
Ainda quanto às incertezas padronizadas de informações, pode-se considerar duas
variáveis, a dependente e a independente, em que na dependente há uma incerteza
relacionada a outra e na independente, em que a correlação entre uma incerteza e
outra é igual a zero.
Então, obviamente que a incerteza padronizada deve apresentar a mesma unidade de

medida. (LEITE, 2008).
Incerteza combinada
A incerteza combinada pode ser obtida, nos casos em que os erros forem dependentes,
apenas pela soma das incertezas, e nos casos em que os erros forem independentes,
por meios estatísticos (LEITE, 2008). Para a sua ponderação, aplica-se a Equação 40,
descrita a seguir.
uc= u12 + u 22 +  + u 2n Equação 40
Onde,
uc= Incerteza combinada;
u = Incerteza;
n = número total de fontes de incertezas analisadas.
Vale ressaltar que é preciso ter domínio da técnica e das variáveis relacionadas para
que seja possível o cálculo da incerteza. É importante também saber que em análises
químicas é comumente aplicado um nível de confiança de 95%, mas, especificamente,
a incerteza combinada cumpre 68% da distribuição normal dos dados. Desse modo, é
114
necessário que se aplique a incerteza expandida, a qual pode ser obtida por meio da
Equação 41, para que então seja multiplicado e atingido o nível de confiança de 95%
(LEITE, 2008).
U = k.u c Equação 41
Onde,
U= incerteza expandida;
K= fator de abrangência para um nível de confiança aproximado de 95%, em que

K=2;
uc = incerteza combinada.
O fator de abrangência para um nível de confiança aproximado está relacionado de

maneira direta ao grau de probabilidade de acerto. Como exposto na Equação 41,
K=2, pois a probabilidade é de 95%; já para uma probabilidade de 68%, K=1; e para a
probabilidade de 99%, K=3.
Então, para que seja realizado o cálculo de incerteza combinada, Leite (2008) sugere
seguir a ordem das etapas:
»» Definir o que será medido.
»» Observar e analisar as possíveis origens de incertezas.
»» Realizar a divisão entre grupos conforme a similaridade das incentezas.
»» Obter a incerteza combinada.
»» Conferir os valores e se preciso for, modificar o sistema.
»» Obter a incerteza expandida.
»» Emitir resultado.
Utilização do branco
Todo experimento deve ser delineado e ter estipulado o número adequado de

repetições a se realizar, chamado de “n”. Após a obtenção dos resultados oriundos de
várias repetições de uma mesma amostra, esses resultados apresentam um desvio-
padrão. A média dos resultados das repetições é acompanhada pelo desvio-padrão,
expresso da seguinte maneira:
115
Médiaamostra ± Desvio-padrãoamostra
Em se tratando de análises de concentrações muito baixas, como exemplo a de apenas

traços do analíto, deve ser ponderado o valor do branco para a obtenção final do
resultado do experimento. Vale ressaltar que é necessário que se tenha muita cautela
durante o preparo do branco, pois é o momento em que há maiores probabilidades de
sua contaminação e/ou perdas.
Da mesma maneira que há a verificação da medida da amostra por várias repetições,

o mesmo deve ser feito na análise do branco. Desse modo, após a obtenção dos
resultados, realizam-se o cálculo da média e, consequentemente, seu correspondente
desvio-padrão.
Médiabranco ± Desvio-padrãobranco
Por final, deve-se realizar a subtração do resultado da média do branco, da média

obtida da amostra e o desvio-padrão, que deve ser a raiz quadrada da adição dos
desvios-padrão.
Médiaamostra – médiabranco ± (Desvio-padrãoamostra2 + desvio-padrãobranco2)1/2
Segundo Krug (2006), o branco pode ser diminuído de maneira efetiva quando houver
o domínio positivo de alguns fatores como:
»» Pureza de todos os reagentes envolvidos na análise.
»» Qualidade de todos os componentes, materiais, equipamentos e/ou

acessórios envolvidos na análise.
»» Qualidade do ar do laboratório.
116
CAPÍTULO 2
Impurezas e produtos de degradação
A pesquisa de impurezas e de produtos de degradação é util no desenvolvimento de

métodos analíticos, uma vez que possibilita a previsão e/ou detecção dos tais eventos
durante as análises químicas, caso ocorram. Durante a validação do método analítico,
é necessário que, para os métodos quantitativos, seja constatado que não esteja
ocorrendo qualquer tipo de interferência na resposta analítica por conta de impurezas
e produtos de degração, como também de possíveis prejuízos advindos do diluente do
analito ou da matriz.
Para a análise dessas impurezas e produtos de degradação advindas da degradação

forçada, é utilizado o conhecido stability indicating analytical method (SIAMS), em
português, método analítico indicativo de estabilidade. Segundo BRASIL, (2015, p.
8), no Guia nº 4, para obtenção do perfil de degradação, identificação e qualificação
de produtos de degradação em medicamentos, o método analítico indicativo de
estabilidade:
É aquele adequado para analisar amostras de estabilidade, validado,

capaz de detectar, ao longo do tempo, mudanças nas propriedades
físicas, químicas e/ou microbiológicas de uma substância e só
é possível de ser desenvolvido se forem realizados estudos de
degradação forçada das amostras farmacêuticas
Muitas podem ser as impurezas e produtos de degradação decorrentes do teste de

degradação forçada, por isso deve-se optar por uma ou mais técnicas analíticas que
sejam capazes de separar e identificar tais compostos. A técnica mais utilizada para
desenvolvimento de métodos indicativos de estabilidade é a cromatografia líquida de
alta eficiência com detecção de arranjos de fotodiodos (CLAE-DAD/ HPLC-PDA).
Já anteriormente citada, a RDC 166/2017 compreende como componente integrante

da validação da metodologia analítica o estudo de degradação forçada. Pode-se
afirmar que são imprescindíveis para as indústrias químicas e farmacêuticas o teste de
degradação forçada assim como o desenvolvimento do método analítico que permita
a indentificação e a quantificação dos produtos advindos do teste da degradação que
fora ocasionada (ALCÂNTARA et al., 2013).
Para obter informações quanto ao estudo de produtos de degradação em

medicamentos, a Resolução de Diretoria Colegiada nº 53, de 4 de dezembro de
117
2015, elucida e apresenta quais os critérios a serem seguidos para tal. E quanto
à quantificação de produtos de degradação nos estudos de estabilidade de
medicamentos, pode-se consultar a Resolução nº 1, de 29 de julho de 2005 (BRASIL,
2015).
A RDC 53/2015 traz como a definição de impureza: “Qualquer componente presente

no insumo farmacêutico ou no produto terminado que não seja o insumo farmacêutico
ativo nem o(s) excipiente(s).”
E também aponta o conceito de produtos de degradação como: “Impurezas resultantes

de alterações químicas que surgem durante a fabricação ou armazenamento do
medicamento.”
A degradação forçada normalmente é realizada no começo do desenvolvimento do

medicamento, mas também pode ser executada no progresso do desenvolvimento
de fármacos. Para a efetuação do processo de degradação forçada, o fármaco ou o
medicamento é exposto a condições extremas com o objetivo de acelerar a formação
de subprodutos decorrente da degradação e. assim, consequentemente possibilitar sua
análise (ALCÂNTARA et al., 2013).
A descrição feita pela RDC 53/2015, quanto ao estudo de degradação forçada é:
“O estudo que permite a geração de produtos de degradação através

da exposição do insumo farmacêutico ativo e produto acabado a
condições de estresse, como por exemplo, luz, temperatura, calor,
umidade, hidrólise ácida/ básica e oxidação, entre outras.”
Ainda quanto à quantificação dos produtos de degradação nos estudos de estabilidade

de medicamentos, exige-se que o medicamento seja submetido a situações que
provoquem oxidação, também circunstâncias como sua exposição a diferentes valores
de pH e fontes de calor e luz, para que posteriormente possa ser comprovado que não
há qualquer produto derivado de degradação. Alguns casos são dispensados dessa
comprovação da ausência de produtos de degradação, como:
»» quando se tratar de métodos de desempenho;
»» métodos que não sejam cromatográfico;
»» produtos que já passaram pelo crivo das exigências da RDC 53/2015 e

tiveram sua adequação apresentada (BRASIL, 2015).
A Anvisa (Guia no 04/2015 e RDC 53/2015) e o International Council for

Harmonisation (Q1A/2003) recomendam para o teste de degradação forçada a
118
realização da degradação das amostras por meio das seguintes situações com suas
variações intrínsecas:
»» Aquecimento.
»» Umidade.
»» Hidrólise em uma ampla gama de valores de pH.
»» Oxidação.
»» Fotólise.
»» Íons.
Alcântara e colaboradores (2013) apresentaram, de modo sucinto, alguns dos

propósitos que o estudo de degradação forçada traz e a razão pela qual sua aplicação é
imprescindível. A seguir estão listadas tais considerações:
»» Demonstrar a possíveis vias de degradação de fármacos e

medicamentos.
»» Evidenciar quais produtos de degradação são originados pelo fármaco

em estudo e quais produtos de degradação são originados por
componentes contidos na matriz.
»» Para permitir que as estruturas químicas dos produtos de degradação

sejam passíveis de serem conhecidas e explanadas.
»» Estabelecer a estabilidade intrínseca do fármaco em contato com os

demais compostos incluídos na formulação.
»» Conhecer os mecanismos de degradação do medicamento ou fármaco

decorrentes da hidrólise, oxidação, termólise ou fotólise.
»» Produzir conhecimento prévio para orientação no desenvolvimento de

um método analítico que seja apropriado para indicar a estabilidade do
fármaco ou medicamento.
»» Entender as particularidades da molécula em estudo, assim como suas

propriedades físico-químicas.
119
»» Viabilizar o desenvolvimento de formulações mais estáveis, uma vez

que será possível prever e contornar algumas possíveis dificuldades
apresentadas pelo fármaco.
E segundo Mattos (2017):
»» Solucionar inconvenientes referentes à estabilidade do fármaco

ou medicamento. Algumas observações podem ser feitas para a
determinação da exatidão em métodos analíticos para a avaliação de
impurezas, como:
»» Deve-se empregar o método de adição de padrão, para isso são

adicionadas à amostra a ser analisada quantidades previamente
estabelecidas de impurezas ou mesmo produtos de degradação.
»» É permitida a comparação dos resultados advindos de um outro método

de validação e a aplicação do fator de resposta relativo ao insumo
farmacêutico ativo, se acaso não houver amostras disponíveis de
quaisquer impurezas ou produtos de degradação como é o indicado.
»» No caso de impurezas que sejam ainda desconhecidas, para determinar

a exatidão do método analítico, deve-se comparar com a resposta da
substância química de referência do insumo farmacêutico ativo, ou
também de impureza conhecida, em conformidade com o método em
questão. Vale ressaltar que essa comparação deve ser feita em uma
faixa de concentração que contemple o intervalo de trabalho do método
analítico, de maneira que seja considerado o mesmo fator de resposta.
Para que o desenvolvimento e a validação de um método analítico indicativo de

estabilidade sejam realizados, Brummer (2011) sugere uma sequência lógica a ser
praticada, listada a seguir:
1. Primeiramente, deve-se realizar uma análise pormenorizada da

estrutura do fármaco a ser analisado pelo método que está se
pretendendo desenvolver, para, dessa maneira, esboçar a(s) possível(is)
via(s) de decomposição, ou seja, estipular um delineamento de
degradação.
2. Em seguida, pesquisar e fazer um levantamento de dados quanto às

propriedades físico-químicas do fármaco.
120
3. Realizar o estudo de degradação forçada, procedendo ao estresse das

amostras de fármaco em diferentes condições.
4. Iniciar, de fato, o desenvolvimento do método analítico indicativo

de estabilidade, por meio de análises preliminares das amostras
estressadas, aplicando as condições variadas.
5. Aprimorar as condições iniciais de modo a concluir o desenvolvimento

do método.
6. Em seguida, analisar todas as amostras advindas da degradação forçada,

identificar e caracterizar os possíveis produtos de degradação gerados, e
adicionalmente preparar os padrões dos produtos de degradação.
7. E, então, depois de todas essas etapas, finalmente proceder à validação

do método analítico indicativo de estabilidade; (BRUMMER, 2011).
Para a validação de métodos analíticos indicativos de estabilidade, a Farmacopéia

Americana e ICH estabelecem a avaliação dos seguintes parâmetros:
»» Exatidão.
»» Precisão.
»» Seletividade/especificidade.
»» Linearidade.
»» Limite de detecção.
»» Limite de quantificação.
»» Robustez.
Nos casos em que o método em validação não apresentar as especificações dentro do

estabelecido, este deve ser reanalisado para que sejam feitas as alterações necessárias
para seu aprimoramento e, então, ser revalidado (BLESSY et al., 2014).
Depois do desenvolvimento e validação, o método analítico indicativo de estabilidade

pode abranger outras vertentes como formulações, matrizes, entre outras. A seguir, na
Figura 20, pode ser observado um resumo esquemático do teste de degradação e sua
conduta.
121
Figura 20. Esquema do teste de degradação forçada.
Fármaco
Hidrólise ácida Fotólise
Hidrólise básica Oxidação

Hidrólise neutra
Ocorreu de 10 a 20%
de degradação?
Não Não Sim
Alterar as condições
Fotoestável aplicadas (concentração Teste de
de solventes, tempo de degradação
exposição, temperatura) finalizado
Como observado na Figura 20, depois da aplicação das diferentes situações, com suas
variações intrínsecas, recomenda-se que seja ocasionada de 10 a 20% de degradação
do fármaco, contudo, é importantíssimo que se evite exageros nas variações das
diferentes condições aplicadas, de forma que seja impedida a formação de produtos de
degradação secundários.
A Anvisa, na RDC 53/2015, preconiza a promoção de uma degradação superior a 10%

do pico do fármaco, porém que seja inferior à que resultasse em degradação integral
da amostra (sendo sugerido até 30% de degradação). Na mesma normativa, traz como
obrigatoriedade a necessidade de se apresentar uma justificativa técnica respaldada,
nos casos em que o teste de degradação forçada tenha atingido valores menores de
10%.
Para a realização preliminar da degradação, costuma-se iniciar com condições tais

como a hidrólise ácida, com a utilização o ácido clorídrico 0,1M, a hidrólise básica,
comumente o hidróxido de sódio 0,1M e em ambas as situações, sob refluxo, em
média 8 horas. Caso a degradação total do fármaco seja obtida já de início com
122
essas condições, pode-se buscar novas tentativas como, por exemplo, a redução da
temperatura de reação.
Ainda, para a promoção da hidrólise neutra, usualmente a amostra contendo o

fármaco é mantida sob refluxo em água por 12 horas. Em situações que a degradação
do fármaco tenha ocorrido de maneira total, deve-se reduzir a temperatura e/ou
o tempo do ensaio. E, obviamente, caso não seja observada a degradação almejada,
indica-se o prolongamento da exposição ao refluxo e/ou o aumento da temperatura.
A oxidação do fármaco é frequentemente sucedida com a aplicação de peróxido de

hidrogênio 0,3 a 3%, deixando permanecer em contato com a amostra, em média
de 1 a 7 dias. As mesmas observações realizadas, quanto ao tempo de exposição nas
condições já citadas acima, são válidas para a análise oxidativa (SEHRAWAT et al.,
2010; BAERTSCHI, 2005).
Para a realização do teste de fotólise, a amostra em geral fica exposta à luz emitida
por lâmpadas fluorescentes brancas e ultravioleta, ou pode também utilizar uma das
lâmpadas de xenônio e de halogenetos metálicos. As amostras contendo o fármaco
devem receber luz, com pelo menos 1,2 milhões de lux húmica e energia de 200 watt
h/m². Caso essas condições ainda não sejam suficientes para causarem qualquer
degradação da amostra, pode-se multiplicar tais condições em cinco vezes mais e se
ainda assim permanecer sem a geração de produtos de degradação, a amostra pode
ser considerada fotoestável (ICH-Q1B, 1996).
Para a realização do teste de degradação forçada, deve ser observada a classe da

amostra a ser analisada, podendo se tratar de uma amostra relativamente mais
simples, contendo apenas a matéria-prima (fármaco) ou também uma amostra de
um produto acabado. A seguir, na Figura 21, estão ilustradas as amostras a serem
preparadas para o estudo de degradação forçada para matérias-primas.
Figura 21. Representação das amostras a serem testadas para o teste de degradação forçada de matéria-prima.
Branco Branco exposto às Fármaco Fármaco exposto

armazenado em condições de armazenado em às condições de
condições normais estresse condições normais estresse
123
É recomendado, para o início dos estudos de degradação forçada, que se utilizem

soluções do fármaco na concentração de 1mg/mL, com essa concentração de estudo,
provavelmente os produtos de degradação estarão dentro da faixa de detecção
desejada (SINGH; BAKSHI, 2000; BLESSY et al., 2014). Nos casos de fármacos que,
nessa concentração, apresentem dificuldade de serem solubilizados, indica-se a adição
do solvente metanol.
Como é possível observar na Figura 21, deve-se utilizar pelo menos quatro soluções
para cada amostra a ser degradada, em geral, a amostra de interesse em condições
normais (tempo zero) e depois da aplicação de uma determinada condição
estabelecida, como, por exemplo, hidrólise ácida) e também a solução do branco
dessa amostra (também em condições normais e após a aplicação da mesma condição
estabelecida aplicada na amostra contendo o fármaco).
Como há pouco citado, há algumas particularidades para a análise de produtos

acabados. Além da solução do branco preparada e da análise de matérias-primas para
produtos acabados, deve-se realizar o teste também com a solução com o fármaco,
outra com excipientes e outra com a formulação total (Figura 22).
Figura 22. Representação das amostras a serem testadas para o teste de degradação forçada de produtos
acabados.
Branco Excipientes Excipientes

armazenado em Branco exposto às
armazenados em expostos às
condições condições de
condições condições de
normais estresse
normais estresse
Fármaco Fármaco Formulação Formulação

armazenado exposto às armazenada em exposta às
em condições condições condições condições
normais de estresse normais de estresse
124
Segundo a RDC 53/2015, ressalta-se também que alguns requisitos, quanto ao estudo
de degradação forçada, devem ser acatados:
»» Deve ser conduzido em um lote, em escala laboratorial, piloto ou

industrial do medicamento.
»» É necessário que seja realizado o estudo com a formulação, com

o placebo e o(s) insumo(s) farmacêutico(s) ativo(s) isolado(s) e
associado(s) no caso de associações em dose fixa, para que seja possível
a comparação entre si.
»» O estudo do perfil de degradação forçada deve ser realizado em todas as

concentrações do medicamento.
»» Deverão ser realizados também os estudos de degradação forçada, no

caso das associações em dose fixa, com os insumos farmacêuticos ativos
isolados, associados e na formulação (BRASIL, 2015).
»» Existem alguns problemas durante a detecção dos produtos de

degradação que podem ser normalmente deparados e que dificultarão o
proceder do teste, aos quais se devem ficar atentos.
»» Formação de produtos que não possuem grupamentos cromofórico.
»» Formação de produtos que não são absorvidos no comprimento de onda

selecionado para a análise.
»» Fármaco e produtos de degradação com valores de absortividade molar

muito diferentes.
»» Os produtos de degradação apresentarem concentração muito baixa.
»» Formação de produtos de degradaçao que são altamente voláteis.
»» Baixa solubilidade total do produtos de degradação nas soluções de

reação.
125
QUÍMICA VERDE UNIDADE VI
CAPÍTULO 1
Conceitos da química verde
Como sabemos, a química está presente em inúmeros processos e produtos

fundamentais do cotidiano. Embora seja de extrema importância para o
desenvolvimento de diversos produtos e medicamentos, também é responsável
pela geração de alguns inconvenientes, como a liberação de subprodutos tóxicos,
que causam a contaminação de rios, ar e solo. Nos últimos anos, a pressão sobre as
indústrias químicas no sentido de diminuir a liberação de resíduos tóxicos ao meio
ambiente aumentou, levando à necessidade de implementação de alternativas aos
métodos químicos analíticos e de produção frequentemente utilizados. Frente a esse
cenário, a busca por métodos que tivessem menores prejuízos possíveis ao meio
ambiente começou a ser mais comumente vista.
O conceito de química verde surgiu nos Estados Unidos, depois do acidente ocorrido
em Bopal, Índia, em 1984. Seguidamente ao ocorrido, as leis estabelecidas pela
Agência de Proteção Ambiental sobre as indústrias químicas se tornaram mais rígidas.
Os químicos norte-americanos Paul Anastas e John Warner (1998) criaram etapas

para o desenvolvimento de reações químicas menos tóxicas, devido à preocupação
com o meio ambiente e à qualidade de vida, chamadas de “Doze princípios da Química
Verde”, que consistem em:
I. Prevenção: é melhor prevenir e evitar ao máximo possível a formação de

subprodutos do que tratá-los posteriormente.
II. Economia de átomos: os métodos de síntese ou análises devem ser

desenvolvidos com a finalidade de maximização na incorporação de
átomos dos reagentes nos produtos finais desenvolvidos.
126
QUÍMICA VERDE │ UNIDADE VI
III. Sínteses utilizando compostos de menor toxicidade: deve-se substituir

os compostos de alta toxicidade por compostos de menor toxicidade
nas reações químicas, que não interfiram na obtenção do produto final
desejado, sempre que possível.
IV. Desenvolvimento de compostos seguros: os produtos químicos deverão,

inicialmente, ser desenvolvidos com a menor toxicidade possível, não
interferindo na função desejada.
V. Diminuição de solventes e auxiliares: neste tópico, incluem-se, além dos

solventes, também os agentes de separação. Estes deverão ser evitados,
sempre que possível, ou utilizados de maneira que não causem prejuízo
ou danos para o homem ou o meio ambiente.
VI. Eficiência energética: os métodos de síntese deverão ser realizados,

sempre que possível, em condições de temperatura e pressão ambientes.
Este ato seria responsável pela diminuição da energia gasta durante os
processos químicos, amenizando os impactos econômicos e ambientais.
VII. Utilização de substâncias recicladas: sempre que possível, os produtos e

subprodutos dos processos químicos deverão ser reutilizados, por meio
do reprocessamento das substâncias. Dessa maneira, há a reintrodução
dos mesmos produtos e subprodutos no ciclo de síntese, diminuindo a
quantidade de novos agentes nocivos utilizados e, consequentemente,
descartados.
VIII. A utilização de reagentes bloqueadores ou modificadores temporários

deve ser evitada, ou, pelo menos, minimizada sempre que possível.
Isto porque esses passos reacionais necessitam de maior quantidade
de reagentes. Sendo assim, ocorre a maior produção de subprodutos
indesejáveis.
IX. Catálise: a utilização de catalisadores em reações químicas deve ser feita

sempre que possível, pois são responsáveis pelo aumento da velocidade
das reações, e, além disso, pelo aumento do rendimento dos processos
químicos.
X. Estudos para o desenvolvimento de novos compostos degradantes: o

investimento em estudos e o incentivo para a utilização de compostos
degradantes devem ocorrer visando à degradação inócua dos produtos
127
UNIDADE VI │ QUÍMICA VERDE
tóxicos liberados depois das sínteses químicas, diminuindo, assim, o

despejo em meio ambiente.
XI. Análise em tempo real, com a finalidade de prevenção da poluição:

é necessário o desenvolvimento de metodologias que viabilize o
monitoramento e o controle em todas as etapas químicas. Dessa
maneira, haveria o controle da formação de compostos tóxicos.
XII. Química segura, para a prevenção de acidentes: todos os compostos e

substâncias químicas utilizadas durante os processos de síntese e análise
deverão ser escolhidos cuidadosamente, com a finalidade de minimizar
potenciais acidentes, como por exemplo explosões e incêndios.
Substituindo solventes
Além da aplicabilidade nas indústrias em geral, a química verde pode (e deve) ser
empregada dentro da área de validação de métodos analíticos, no desenvolvimento de
novas técnicas e métodos acessíveis e de fácil execução, com a finalidade de diminuir
ou eliminar os potenciais danos à saúde e ao meio ambiente causados pela liberação
dos subprodutos gerados nas reações. A diminuição dos impactos ambientais viria
pela minimização ou eliminação do uso de solventes tóxicos e, consequentemente,
pela diminuição da geração de resíduos. O não uso de soluções tamponantes também
é recomendável. Essas substituições devem ser realizadas sem afetar a precisão,
sensibilidade e reprodutibilidade dos métodos analíticos.
Um dos métodos de análise quantitativa de fármacos que se enquadra nas diretrizes

da química verde é o ensaio por espectrofotometria na região do infravermelho
médio. Esse método tem estado em destaque na literatura como uma alternativa para
doseamento de fármacos e, além disso, é uma técnica vantajosa por não produzir
resíduos ambientais, além de suas análises serem realizadas rapidamente e com
baixo custo. Assim, essa técnica pode ser adotada por indústrias do setor químico-
farmacêutico.
Durante análises por meio de cromatografia líquida de alta eficiência, os princípios

da química verde podem ser aplicados durante a escolha do solvente para compor as
soluções de amostra e solução padrão do fármaco a ser avaliado. Quando o fármaco
apresentar solubilidade em água, esta deve ser a escolha, visando à geração de
resíduos menos tóxicos.
128
QUÍMICA VERDE │ UNIDADE VI
Várias pesquisas têm estudado o desenvolvimento de técnicas de validação de método

analítico baseado na química verde. Rebouças e colaboradores (2018) desenvolveram
e validaram um método analítico para a quantificação do antibiótico enrofloxacino,
com base nos princípios da química verde. O método analítico para a quantificação
do fármaco em comprimidos foi por espectrometria na região do infravermelho (IV),
para análise de rotina, de acordo com os parâmetros (precisão, precisão, seletividade,
robustez e linearidade) especificados International Conference on Harmonization
(ICH, 2005). Com a obtenção desse método analítico, considerado de baixo custo
e rápido, é possível sua aplicação em controle de produções do enrofloxacino em
indústrias farmacêuticas. Dessa forma, esse estudo contribuiu para a geração de
métodos alternativos, priorizando a menor geração de resíduos e, consequentemente,
menores danos ao meio ambiente e operador.
Recentemente, Pedroso e colaboradores (2019) se empenharam em desenvolver

e validar um método inovador por eletroforese capilar, o qual teve como objetivo a
análise de ertapeném sódico, com a atenção voltada para os princípios da química
analítica verde. Embora não seja utilizada tanto quanto as técnicas cromatográficas, a
eletroforese capilar se destaca pelo alto poder de separação com pequenas quantidades
de amostra e reagentes. Conforme recomendado nas diretrizes internacionais, os
parâmetros da seletividade, linearidade, precisão, exatidão, limite de quantificação
e limite de detecção foram avaliados. O método apresenta vantagens de utilizar
quantidades reduzidas de amostra na análise, pouco tempo de análise e não utilizar
qualquer tipo de solvente orgânico ou tóxico, sendo, então, seguro para o analista.
Rodrigues e Salgado (2016), pensando em métodos voltados à química verde,

desenvolveram e validaram um método analítico para a determinação de cloridrato
de cefepima. Eles desenvolveram e validaram o método analítico de acordo com
as diretrizes da ICH (2005), usando cromatografia líquida de alta eficiência de fase
reversa (RP-HPLC), tendo como como fase móvel uma mistura de etanol e água
(55:45, v/v). Os pesquisadores concluíram que o método desenvolvido e validado se
apresentou dentro dos parâmetros estabelecidos, uma vez que o método utiliza menor
quantidade de solvente orgânico, produz baixo nível de resíduos e não utiliza solução
tampão, minimizando o tratamento de efluentes, contribuindo com o meio ambiente
e implementando métodos voltados à química verde, tornando-os econômicos para o
setor.
É de extrema importância a realização de estudos sobre desenvolvimento de novos

métodos analíticos, visando seguir as diretrizes da química verde. Porém esses novos
métodos devem fornecer resultados semelhantes aos métodos já consagrados, não
comprometendo, assim, as análises químico-farmacêuticas.
129
UNIDADE VI │ QUÍMICA VERDE
Em um futuro muito próximo, o desenvolvimento e a validação com o foco em

métodos verdes serão tidos como essencial e prioritário, com esforços centrados em
métodos que tragam resultado eficaz, barato, rápido e verde, protegendo, ainda, as
gerações futuras, animais e nosso planeta (KOGAWA; SALGADO, 2017).
RDC 166/2017 na íntegra. BRASIL. Agência Nacional de Vigilância Sanitária

(ANVISA). RDC Nº 166, de 24 de Julho de 2017. Dispõe sobre a validação de
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140

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Dra. Jéssica Bernegossi

Equipe Técnica de Avaliação, Revisão Linguística e Editoração

A proposta editorial deste Caderno de Estudos e Pesquisa reúne elementos que se

Pretende-se, com este material, levá-lo à reflexão e à compreensão da

Elaborou-se a presente publicação com a intenção de torná-la subsídio valioso, de

Para facilitar seu estudo, os conteúdos são organizados em unidades, subdivididas em

A seguir, apresentamos uma breve descrição dos ícones utilizados na organização

Sugestão de estudo complementar

Sugestões de leituras adicionais, filmes e sites para aprofundamento do estudo,

Chamadas para alertar detalhes/tópicos importantes que contribuam para a

Informações complementares para elucidar a construção das sínteses/conclusões

Trecho que busca resumir informações relevantes do conteúdo, facilitando o

Para (não) finalizar

Texto integrador, ao final do módulo, que motiva o aluno a continuar a

Quando se fala em “análises químicas”, automaticamente assimila-se a ideia de

Na prática, pensando na validação de um método, por exemplo, diversos são os fatores

Há basicamente alguns tipos de validação, os quais são chamados de prospectiva:

Diretrizes são usadas como fonte de recomendações e orientação quanto aos

Existem agências que, por meio de normas e orientações, direcionam o

Atualmente, o analista deve ter como conceito sedimentado a química verde. O

A seguir, serão abordadas detalhadamente as bases e aplicações de validação em

»» Reconhecer a função das agências regulatórias.

»» Avaliar os critérios dos processos de uma validação.

Pode-se classificar os métodos como clássicos ou instrumentais.

Os métodos clássicos estabelecem resultados por meio de massas ou volumes,

Figura 1. Exemplos de métodos clássicos.

Análise gravimétrica Titulações

Fonte: (CAZEDEY, 2017).

Pode-se observar algumas vantagens em se utilizar métodos clássicos de análise,

»» A simplicidade na sua execução;

»» Baixo tempo de análise;

»» Baixa geração de resíduos.

E, ainda, devem ser consideradas algumas desvantagens como:

»» Ponto de viragem de uma titulação.

»» Consumo de maior quantidade de amostra para a realização das

Já os métodos instrumentais são caracterizados capazes de detectar, por meio de um

Figura 2. Exemplos de métodos instrumentais.

Técnicas de Técnicas Técnicas

Fonte: (MATOS, 2013a).

Algumas vantagens que podem ser observadas ao se utilizar métodos instrumentais:

»» Menor quantidade de amostra.

E também é possível observar algumas desvantagens:

»» O tempo de análise é considerado de médio a alto;

»» Necessidade de treinamento do analista;

»» Maior geração de resíduo.

A importância da validação de métodos

Métodos, em geral, podem apresentar disfunções sob diferentes situações, como,

Essa consolidação por meio de dados e informações documentadas favorece

O planejamento da validação do método analítico é essencial para se obter os

»» Objetivo e finalidade do método.

»» Quais princípios que serão acordados para aprovar a confiabilidade de

»» Conferir a compatibilidade requerida do equipamento de acordo com o

»» A avaliação de todos os componentes que serão utilizados.

»» Execução de todos os ensaios planejados.

»» Aplicar a análise estatística, memorando os princípios acordados para

»» Avaliar os resultados obtidos (os quais devem estar documentados e

I. Procedimentos operacionais padrão;

III. Plano Mestre de Validação (PMV);

IV. Protocolos e relatórios de qualificação, e;

V. Protocolos e relatórios de validação (BRASIL, 2010).

Validação de métodos analíticos

A adequação e a confiabilidade dos dados obtidos necessitam ser garantidas na