Microbiologia

Professora: Alessandra Teixeira

COPROCULTURA
 Coprocultura (Cultura de fezes)
Cultura microbiológica das fezes, tem como objetivo identificar o agente infeccioso
responsável por alterações gastrointestinais, adquiridos através de intoxicação alimentar ou
infecção intestinal, sendo normalmente solicitado pelo médico quando há suspeita de infecção
por Salmonella spp., Escherichia coli ou Shigella spp (Gram -).

Sintomas: Desconforto abdominal; Diarreia; Náuseas e vômitos; Febre; Mal estar geral;
Presença de muco ou sangue nas fezes; Diminuição do apetite.

Para realizar esse exame é recomendado que a pessoa evacue e leve a amostra de fezes ao
laboratório para que seja a corpocultura e identificação da bactéria responsável pela alteração
gastrointestinal. As fezes devem ser coletadas em até 24 horas, e devidamente armazenadas,
preferencialmente, antes da antibioticoterapia .
 Coprocultura (Cultura de fezes)
Como é feita a coprocultura?

É recomendado que a pessoa colete as fezes, sem que esta entre em contato com a urina ou com o vaso
sanitário. Além disso, caso seja visualizado sangue, muco ou outras alterações nas fezes, é recomendado que
essa parte seja coletada, pois há maior probabilidade de serem identificados os microrganismos possivelmente
responsáveis pela infecção.

Em alguns casos, pode ser sugerido pelo médico que a coleta seja feita utilizando um swab diretamente do reto
da pessoa, sendo essa coleta mais frequente em pessoas que estão hospitalizadas.

 Além de fezes frescas o laboratório pode receber

 Os frascos não devem ter volume
SWABS RETAIS (em último caso) acondicionados em
excessivo, nem encostar na tampa.
meios de transporte.

Meio: Cary Blair Meio: Stuart

• Preparar solução salina a 10% • Semear diretamente nas placas
 Coprocultura (Cultura de fezes)
Como é feita a coprocultura?

No laboratório, as fezes são colocadas em meios de cultura específicos que permitem o crescimento das bactérias,
que são aquelas que não fazem parte da microbiota normal ou que fazem mas que estão produzindo toxinas e
levando ao aparecimento de sintomas gastrointestinais.

Na rotina laboratorial, a diferenciação inicial dos bacilos Gram-negativos pode ser realizada através das
características observada após crescimento bacteriano no agar Mac Conkey,.

(E.coli)
(Acinetobacter
spp)
 Coprocultura (Cultura de fezes)
 Meio de cultura mais utilizados para cultura de fezes

Ágar Salmonella-Shigella (SS): Possui componentes

que inibem o crescimento de bactérias Gram-
positivos. Finalidade: seleção e isolamento de
espécies de Salmonella e Shigella.

Ágar Hektoen enteric (HE): Fornecem carboidratos

fermentáveis ​para incentivar o crescimento e diferenciação
de enterobactérias. Finalidade: Isolamento e diferenciação
dos membros da espécie Salmonella e Shigella de
Salmonela-Shigela E. coli
outros Enterobacteriaceae

Ágar Eosina Azul de Metileno (EMB): Possui uma combinação de

substancias que promove a diferenciação entre colônias de lactose positivas
e negativas. Finalidade: isolamento de bacilos Gram-negativos e verificação
da fermentação ou não da lactose e sacarose
E. coli
UROCULTURA
 Urocultura (Cultura da urina)
O aparelho urinário é formado pelos rins, ureteres, bexiga e uretra (esta última possui uma
microflora residente). Acima da uretra, todas as áreas do aparelho urinário são estéreis num
ser humano saudável, o que faz com que a urina seja habitualmente estéril. Contudo, as
bactérias podem invadir a bexiga e causar infecção, que também pode ocorrer devido
higiene inadequada, retenção urinária, ato sexual, etc.

Ao introduzir um cateter urinário por exemplo, as bactérias podem ser

introduzidas diretamente na bexiga ou, mover-se através deste
instrumento da uretra até à bexiga, aumentando desta forma o risco de
infecção.
Rins
Qualquer infecção sistêmica pode provocar infecção urinária mas certos
microrganismos, como S. aureus ou espécies de Salmonella, são
particularmente invasivos. As infecções urinárias são uma das infecções
Bexiga mais frequentemente encontradas.
Microbiota residente
 Urocultura (Cultura da urina)
A urocultura é indicada quando a pessoa apresenta sinais e sintomas de infecção urinária,
como dor e ardor ao urinar e vontade frequente de urinar, no entanto pode ser também
solicitado quando após exame de urina do tipo I (EAS), são identificadas bactérias e
numerosos leucócitos na urina, isso porque essas alterações são indicativas de infecção
urinária, sendo importante identificar o microrganismo responsável.

A urocultura com antibiograma tem o objetivo de identificar o microrganismo causador da

infecção (Cistites-infecção na bexiga e pielonefrite- infecção no rim), e qual o seu perfil de
sensibilidade e de resistência aos antibióticos normalmente utilizados para tratar a infecção.
Assim, a partir do resultado do exame, o médico pode indicar o antimicrobiano mais
adequado para a pessoa.
 Urocultura (Cultura da urina)
Como é feito?

O exame de urocultura é um exame simples e que é feito a partir de uma amostra de urina,
que deve ser coletada e armazenada em um recipiente adequado fornecido pelo laboratório.
Para realizar a coleta, é necessário primeiro realizar a higienização da região íntima com água
e sabão e fazer a coleta da primeira urina do dia, devendo a pessoa desprezar o primeiro jato
de urina e colher o jato intermediário.
 Cultura de urina

CLED

Infecção positiva: ≥
Ou Manitol ou MacConkey 100.000 UFC/ml
(~80% dos casos)

Antibiograma
O crescimento em meio SÓLIDO (placa), permite a obtenção de COLÔNIAS BACTERIANAS. Cada colônia é formada a partir de
apenas uma bactéria ( 1 UFC). A Unidade Formadora de Colónias (UFC; em inglês, colony forming unit, CFU) é uma unidade
de medida, usada em microbiologia para estimar o número de bactérias (ou fungos) viáveis, isto é, capazes de se multiplicar
mediante fissão binária. O método é geralmente utilizado para a enumeração de microrganismos em alimentos, solo, água e
em análises clínicas. Geralmente o resultado da contagem é expresso em UFC/mL ou UFC/g.

(100)

(1.000.000)

(100.000

(100.000.000)

(100.000.000)

Contador de colônia: Permite a contagem de

colônias através de impulsos registrados em
display LCD com até 999 unidades, e 99
memórias para alocar as contagens.
HEMOCULTURA
 Hemocultura (Cultura do sangue)
A invasão microbiana da corrente sanguínea pode ter consequências graves, como choque,
insuficiência de múltiplos orgãos, coagulação intravascular disseminada e morte. Perante a
suspeita de infecção da corrente sanguínea deve ser realizado a hemocultura com sangue
colhido de veia periférica ou de outro acesso venoso.

A Hemocultura é um exame laboratorial que pesquisa microrganismos patogênicos no sangue

por meio da utilização de meios de cultura específicos. Este é um exame auxiliar de grande
relevância, uma vez que seu resultado projeta-se na terapêutica.

O exame deve ser solicitado em certos quadros infecciosos, como: Suspeita de endocardite;
sepse; infecções hospitalates; Febre de origem não definida; Infecções em pacientes
imunodeprimidos; meningites;pneumonia graves e bacteremia.
 Hemocultura (Cultura do sangue)
A amostra de sangue venoso é colhida e inoculada diretamente no meio líquido para hemocultura. Depois de
24h, é possível observar se há ou não a presença de bactérias. Caso haja, coloca-se o material em outros meios
de cultura para identificar a espécie e, por conseguinte, realiza-se também um antibiograma, para identificar
qual o antibiótico adequado para combater a bactéria em questão. Para o resultado final, são necessários
cerca de 5 dias.

Dentre as bactérias mais comumente encontradas na corrente sanguínea estão o Staphylococcus

sp., Streptococcus sp.e bacilos gram-negativos (E. coli).
As garrafas para hemocultura apresentam-se como
aeróbicas ou anaeróbicas. Possuem uma tampa de
borracha onde deve ser colocado o adaptador (coleta em
sistema fechado) para que o sangue seja transferido do
escalpe para a garrafa de forma estéril. Para o exame
devem ser colhidas duas amostras de hemoculturas, e de
pelo menos duas regiões distintas do corpo, e deve ser
realizado antes do início do tratamento com antibióticos
 Hemocultura (Cultura do sangue)

Semear em outros meios de cultura Antibiograma para identificar

Depois de 24h, é possível observar seletivo e diferencial para qual o antibiótico adequado para
se há ou não a presença de bactérias identificar a espécie tratamento
(TURVAÇÃO DO MEIO).

Para o resultado final, são necessários cerca de 5 dias.

Dentre as bactérias mais comumente encontradas na corrente sanguínea estão: Staphylococcus sp e bacilos
gram-negativos.
 Isolamento bacteriano
__________________________________________________________________________________________

(Técnicas de Semeadura)
 Isolamento Bacteriano
O objetivo é diminuir a população bacteriana, assim, as células bacterianas individuais estarão
localizadas a certa distância umas das outras.

Todas as células em uma colônia têm o mesmo parentesco. Para isolar uma cultura pura, uma
colônia individual é transferida do cultivo inicial para um novo meio de cultura.
 Isolamento Bacteriano
 Técnica de esgotamento por meio de estrias superficiais

A amostra é semeada na superfície do meio solido com alça bacteriológica, em movimentos de zigue-zague,
para esgotar a população, assim, em algumas regiões do
meio após a incubação, colônias individualizadas estarão presentes.
Meios de cultivo bacteriano
 Meio de cultivo bacteriano
A duplicação do material genético seguido pela divisão bacteriana só ocorrerá caso ocorra o ACESSO A
NUTRIENTES. É importante conhecer as necessidades nutricionais das bactérias para seu correto cultivo. Meio de
cultivo, é qualquer substância sólida (Àgar-àgar), semissólida ou líquida que possua um conjunto de fontes de
nutrientes que possibilita o crescimento in vitro das bactérias, e consequentemente auxilia na sua análise e
identificação. Por causa da grande diversidade bacteriana e suas exigências nutricionais, existem grandes
diferenças na composição dos meios utilizados, e desta forma diferentes componentes poderão ser adicionados
ao meio. Por isso, os meios de cultivos são classificados como:

• ENRIQUECIDO • SELETIVO

• DIFERENCIAL • INDICADOR
 Meio de cultivo bacteriano
 Meios de Cultivo Enriquecido
Um meio de cultura enriquecido corresponde a um meio (caldo ou meio sólido) contendo um grande
suprimento de nutrientes que promove o aumento do número de bactérias. São meios que foram
suplementados com materiais altamente nutritivos

Ágar Chocolate: Ao ágar é adicionado sangue de cavalo, carneiro ou coelho

em temperatura alta, o que faz com que as hemácias lisem liberando
hemina e hematina, compostos fundamentais para o crescimento dos
microrganismos exigentes (fastidiosos), ex: Neisserias pp.
 Meio de cultivo bacteriano
 Meios de Cultivo Diferencial
Promove uma mudança na coloração das colônias de bactérias, possibilitando a distinção de vários gêneros e
espécies de microrganismos. O Àgar MacConkey e CLED são frequentemente utilizados para diferenciar
bactérias Gram - isoladas de amostras de fezes e urina. As bactérias que são capazes de metabolizar
(fermentar) substâncias presentes neste meios, induzem mudança de cor. Colônias rosa no Àgar MacConkey e
colônias amarelas no CLED, indicam presença de bactérias fermentadoras (G-) enquanto que aquelas incapazes
de fermentar a lactose produzem colônias incolores. são amplamente utilizado na COPROCULTURA e
URINOCULTURA

As colônias rosas no MacConkey e

amarelas no CLED indicam presença de
bactérias que fermentam lactose
(Produzem ácido e diminuem o pH do
meio)

Colônias incolores – Não fermentam CLED (urina)

MacConkey (fezes) lactose
 Meio de cultivo bacteriano
 Meios de Cultivo Diferencial
ÁGAR-SANGUE: É utilizado para o cultivo da grande maioria das bactérias Gram positivas e Gram negativas
(microorganismos não fastidiosos), e verificação de hemólise por Streptococcus spp e Staphylococus spp.

Gênero STaphylococcus Gênero Streptococcus

S. aureus: Colônias S. epidermidis:

S. saprophyticus:
brancas , produzem Colônias branca-
Colônias branca, S. agalactiae S. Pneumoniae
β-hemólise em ágar acinzentadas
γ-hemólise= S. pyogenes
sangue γ-hemólise=
não-hemolíticos
não-hemolíticos
 Meio de cultivo bacteriano
 Meios de Cultivo Seletivo (muito utilizado na coprocultura)
Estimula o crescimento de algumas bactérias, enquanto inibe o crescimento de outras. Podem conter
inibidores como por exemplo antibióticos.

Hektoen: Especialmente para

EMB (eosina-azul de Metileno: *Também é um meio DIFERENCIAL
isolamento de Shigella e Salmonella.
Diferenciação entre populações SS: Colônias escuras- Salmonela
Estas espécies não fermentam os
de Gram-negativas. Distingue Colôniaas incolores- Shigela
compostos do meio, e por isso não
fermentadores de lactose (E.
provocam alteração da cor do sistema
coli), dos não fermentadores.
de indicação do pH. Outras bactérias
que fermentam os compostos do meio
*Também é um meio DIFERENCIAL
(E. coli), provoca alteração da cor para
laranja. *Também é um meio DIFERENCIAL
 Meio de cultivo bacteriano
 Meio Indicador
Possibilita a análise das propriedades bioquímicas dos microrganismos, facilitando sua identificação. Utiliza-se
Àgar Triple Sugar Iron (TSI) e Àgar Citrato de Simmons.
+ -
a) b) d) -

Citrato azulado = positivo

Citrato verde = negativo

c)
Presença de gás CO2

TSI: Permite avaliar a fermentação de Citrato de Simmons

açucares (a,b) e produção de gás (c), produção Citrato de Simmons: Determina se a bactéria é
de H2S - Gás sulfídrico (d) (d). capaz de utilizar o citrato como única fonte de
carbono em seu metabolismo, resultando em
mudança de pH do meio.
 Fases de crescimento bacteriano

Uma cultura bacteriana, em condições ADEQUADAS de cultivo, apresenta 4 FASES.

Fase Lag: Fase imediatamente após a inoculação, NÃO HÁ DIVISÃO, apenas SÍNTESE PROTÉICA. Preparam-
se para a divisão.

Fase Logarítmica ou Exponencial: DIVISÃO BACTERIANA regular, aumento EXPONENCIAL o número de

indivíduos. Faz a população crescer até o limite (nutricional).

Fase Estacionária: Diminuição do ritmo de crescimento (a população se mantém), Relação DIVISÃO X

MORTE, se torna EQUILIBRADA.

Fase de Declínio ou Morte: Encontramos nesta fase a taxa de MORTE superando a taxa de REPRODUÇÃO,
encontramos o acúmulo de substâncias TÓXICAS (excretadas pelas bactérias) e drástica REDUÇÃO da
disponibilidade de nutrientes no meio.
 Fases de crescimento bacteriano

Uma cultura bacteriana, em condições ADEQUADAS de cultivo, apresenta 4 FASES.

Fase Lag: Fase imediatamente após a inoculação, NÃO HÁ DIVISÃO, apenas SÍNTESE PROTÉICA. Preparam-
se para a divsão.
Quantidade de bactéria

Fase de manutenção da
Fase Logarítmica ou Exponencial: DIVISÃO BACTERIANA regular, aumento EXPONENCIAL o número de
população
indivíduos. Faz a população crescer até o limite (nutricional).

Fase Estacionária: Diminuição do ritmo de crescimento (a população se mantém), Relação DIVISÃO X

Fase de intensa multiplicação
MORTE, se torna EQUILIBRADA. bacteriana

Fase de Declínio ou Morte: Encontramos nesta fase a taxa de MORTE superando a taxa de REPRODUÇÃO,
encontramosAdaptação
o acúmulo
ao meiode substâncias TÓXICAS (excretadas pelas bactérias) e drástica REDUÇÃO da
disponibilidade de nutrientes no meio.
Classificação bacteriana quanto a forma
 Classificação bacteriana quanto a forma
Embora existam milhares de espécies bacterianas, elas podem ser agrupadas em três tipos morfológicos gerais:

Bastonetes ou bacilos:
Bastonetes longos ou curtos com Cocos: Podem ser esféricos ou Espirilo: Forma de hélice,
extremidade reta ou de ponta elípticos sacarrolha, ou espiralar
arredondada, ou ainda curvos, em
forma de vírgula
 Morfologia bacteriana
Formas de cocos (esféricas): é o grupo de bactérias mais homogêneo em relação ao tamanho. Os cocos tomam
denominações diferentes de acordo com o seu arranjo

Diplococos: Cocos agrupados de dois em dois (ou cocos isolados)

Tétrades: Cocos agrupados de quatro em quatro

Sarcinas: agrupamentos de oito cocos em forma cúbica

Morfologia bacteriana

Streptococos: Vários cocos dispostos em cadeia, similar a um cordão de pérolas.

(divisão em um único plano).

Estafilococos: Cocos agrupados de forma aleatória, semelhante ao formato de um

cacho de uvas (divisão em muitos planos).
 Morfologia bacteriana
Espirilos: Célula em espiral que movem-se geralmente por contrações do citoplasma, podendo dar várias
voltas completas em torno do próprio eixo.

Ex: Treponema pallidium (sifilis)

 Morfologia bacteriana

Bastonetes ou bacilos: Não se dispõem em tantos arranjos como os cocos, sendo que, na sua grande maioria,
se apresentam de forma isolada. Porém, ocasionalmente podem ocorrer aos pares (diplobacilos) ou em cadeias
(estreptobacilos).

Bacilos isolados Diplobacilos Estreptobacilos

Coloração de Gram
 Estrutura Bacteriana
ESTRUTURAS ESSENCIAIS PRESENTES EM TODAS AS BACTÉRIAS
Parede celular: Envoltório externo responsável pela forma, rigidez e proteção da célula. PEPTIDOGLICANO É O
PRINCIPAL COMPONENTE (PROTEÍNA) DA PAREDE CELULAR. É baseado na parede celular que as bactérias são
classificadas em dois grupos:
a) Gram positivas: Membrana interna + camada espessa de peptidoglicano .
Ex: Staphylococcus e Streptococcus

b) Gram negativas (mais complexa): Membrana externa + fina camada de peptidoglicano + membrana
interna Ex: Escherichia coli
a) Gram positiva b) Gram negativa

cromossomo

Parede celular

Estrutura da célula procariota (bacteriana)

 Estrutura Bacteriana
ESTRUTURAS ESSENCIAIS PRESENTES EM TODAS AS BACTÉRIAS

Parede celular
b) Gram negativa
a) Gram positiva
*LPS
Proteção extra
(ex: enzimas digestivas)
Àcido teicoico Membrana externa
Peptídoglicano

Membrana interna
Proteína

*Informação a respeito da bactéria pertencer ao grupo das G+ ou G– é muito importante do ponto de vista
clínico, pois o tratamento de uma infecção por G+ e diferente do tratamento para G –.
* G+ são mais sensíveis aos antibióticos (Penicilinas).
* LPS/endotoxina (G-): obstrução intravascular, podendo resultar em septicemia. Manifestações semelhantes
podem ser observadas em G+ devido a composição da sua parece celular.
 Estrutura Bacteriana
ESTRUTURAS ESSENCIAIS PRESENTES EM TODAS AS BACTÉRIAS

Parede celular
Gram - Gram +
 Coloração de Gram
 Técnica de coloração de Gram
Principio da técnica: Baseada na estrutura da parede celular das bactérias (PEPTIDEOGLICANO), diferenciar
espécies bacterianas pertencentes aos grupos Gram-positivo e Gram-negativo.
A técnica de coloração de Gram, é um passo muito importante na caracterização e classificação inicial das
bactérias. Esse método de coloração permite que as bactérias sejam visualizadas no microscópio, uma vez que
sem a coloração é impossível observá-las ou identificar sua forma. As bactérias podem ser divididas em dois
grupos baseado na composição de suas paredes, sendo elas: Gram-positivas e Gram-negativas.
Àcido teicoico
LPS
Coloração Gram Gram-positiva Gram-negativa
Gram-positiva
Coloração Gram
Coram-se de roxo

Coram-se de rosa
 Coloração de Gram
 Técnica de coloração de Gram  Princípio da técnica:

O procedimento de coloração de Gram permite que as bactérias

retenham a cor com base nas diferenças nas propriedades
químicas e físicas da parede celular. O uso dos corantes permite
aumentar o contraste e evidenciar a estrutura bacteriana. A
coloração envolve as seguintes etapas:
1) Fixar a amostra
2) Aplicar o cristal violeta (1 minuto)
3) Lavar com água destilada
4) Aplicar Iodo (1 minuto)
5) Lavar com água destilada
6) Aplicar álcool absoluto (15 segundos)
As bactérias Gram-positivas retém o cristal violeta devido à presença de uma
espessa camada de peptidoglicano, enquanto as bactérias Gram-negativas que 7) Safranina (15 segundos)
possuem uma parede de peptidoglicano mais fina, não retém o cristal violeta
durante o processo de descoloração e recebem a cor vermelha 8) Lavar com água destilada
 3
Cristal violeta
Aplicação do Lugol
(Solução fixadora)

Fixar o material Lugol

4 5 6
Aplicação do Lugol
Aplicação da Fucsina

Fucsina Células Gram-positivas: Roxo

Células Gram-negativas: vermelho
(contra corante)
_
  Técnica de coloração de Gram

 O processo de coloração de Gram consiste basicamente em tratar bactérias sucessivamente com cristal
violeta, lugol, álcool e fucsina.

 O cristal violeta e o lugol penetram tanto nas bactérias Gram-positivas quanto nas Gram negativas, formando
um complexo de cor roxa.

 O tratamento com álcool é a etapa diferencial: nas Gram-positivas, o álcool não retira o complexo cristal
violeta + lugol, da espessa camada de peptideoglicano, tornando-a menos permeável, retendo o corante. Nas
Gram-negativas, devido à pequena espessura da camada de peptideoglicano, o complexo corado é extraído
pelo álcool, deixando as células descoradas.

 O tratamento com fucsina não altera a cor roxa das Gram-positivas, ao passo que as Gram negativas
descoradas pelo álcool se tornam avermelhadas. Essa classificação é importante, pois as bactérias Gram-
positivas são mais sensíveis à penicilina.
Coloração de Gram

Gram - Gram +