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Unidade II - Biotecnologia Diagnóstica-1
Unidade II - Biotecnologia Diagnóstica-1
à Biomedicina
Biotecnologia Diagnóstica
Revisão Textual:
Prof.ª Dr.ª Selma Aparecida Cesarin
Biotecnologia Diagnóstica
• Introdução;
• Como Visualizar o Resultado da Reação de PCR;
• Como Podemos Saber o Tamanho das Bandas;
• Aplicações da PCR;
• Variantes da Técnica de PCR;
• PCR em Tempo Real;
• Proteômica no Diagnóstico de Agentes Patogênicos.
OBJETIVOS DE APRENDIZADO
• Apresentar ao aluno as ferramentas biotecnológicas mais relevantes e eficientes emprega-
das para o diagnóstico de doenças;
• Evidenciar os conceitos chaves da Biotecnologia que embasam os métodos diagnósticos uti-
lizados atualmente.
UNIDADE Biotecnologia Diagnóstica
Introdução
Nesta Unidade, estudaremos uma das aplicações mais importantes da Biotecnolo-
gia: o diagnóstico de doenças genéticas, neoplásicas e infecciosas.
Uma das primeiras técnicas desenvolvidas, e hoje uma das mais utilizadas, é a
chamada Reação em Cadeia da Polimerase, cuja sigla é PCR (do inglês Polymerase
Chain Reaction).
Como o nome sugere, essa enzima é responsável por polimerizar a nova ca-
deia de DNA adicionando nucleotídeos livres à cadeia nascente. Esse processo
é semiconservativo, o que significa que a dupla fita de DNA se separa e cada
fita serve como molde para a síntese de uma nova fita de DNA complementar
à fita original.
Após a ação da DNA polimerase, tem-se duas moléculas de DNA, sendo que cada
uma possui uma fita original e uma fita nova. Essa conclusão foi obtida a partir do
experimento clássico dos cientistas Matthew Meselson e Franklin Stahl, utilizando o
isótopo pesado do nitrogênio (15N) em meio de cultura para bactérias E. coli.
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Figura 1 – Possíveis mecanismos da replicação do DNA propostos por diversos autores antes
da comprovação por Meselson e Stahl de que a replicação acontece de forma semiconservativa
Fonte: Adaptado de WATSON, 2015, p. 31.
Novas fitas de DNA são formadas in vitro pela sucessão de múltiplos ciclos, em
geral de 20 a 40, dependendo do interesse do investigador.
Cada ciclo da PCR é dividido em três etapas distintas, variando entre si em tempo
e temperatura (Figura 2):
• A primeira etapa, chamada de desnaturação, compreende a elevação da tempe-
ratura a 95°C por cerca de 20 segundos. A alta temperatura quebra as pontes
de hidrogênio que ligam as bases nitrogenadas e, consequentemente, separa a
dupla fita de DNA em duas fitas simples (Figura 2A);
• A etapa seguinte é chamada de etapa de alinhamento dos primers (Figura 2B).
A temperatura é reduzida para permitir que os primers anelem na sequência
molde previamente desnaturada e forme uma região de dupla fita. O anelamen-
to se dá pela complementariedade de bases entre o primer e a sequência molde,
obedecendo a Regra de Chargaff, ou seja, Adenina pareando com Timina e
Citosina pareando com Guanina;
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Com o fim dessa etapa, encerra-se o primeiro ciclo da PCR. As moléculas presen-
tes no tubo servirão como molde para o segundo ciclo, no qual haverá a repetição
das etapas de desnaturação, alinhamento dos primers e amplificação.
Como citado acima, a reação completa ocorre entre 20 e 40 ciclos, o que pode
ser finalizado em até três horas. A cada ciclo, ocorre um aumento exponencial no
número de novas moléculas de DNA.
Para melhor visualização desse processo, assista ao vídeo “Aula PCR e animação 3D”,
disponível em: https://youtu.be/ViCYwjzBZGs
Em geral, para a maioria das amostras biológicas, iniciamos a reação com muito
mais do que uma única cópia.
Assim, a técnica de PCR pode ser utilizada para diversas aplicações, tais como
o diagnóstico molecular de agentes patogênicos, identificação de mutações em do-
enças genéticas e neoplásicas, isolamento de genes para o Processo de Clonagem,
Medicina Forense e Sexagem Fetal, dentre outras.
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Teste seu conhecimento
1. O que significa a sigla PCR?
2. O que é e como ocorre a reação de PCR?
3. A técnica de PCR mimetiza qual processo, que ocorre normalmente na célula?
4. DESAFIO: considerando a técnica de PCR como um todo, explique por
que, entre as enzimas que participam do processo de replicação, apenas
a DNA polimerase é utilizada na reação de PCR?
5. Explique por que a replicação de DNA é semiconservativa? Como Meselson
e Stahl chegaram a essa conclusão? (dica: leia o Material Complementar)
6. Quais foram as outras duas hipóteses refutadas pelo experimento de
Meselson e Stahl? Explique;
7. Quais são as etapas da reação de PCR? Explique cada passo. (dica: faça
um Mapa Mental desenhando o que ocorre em cada etapa, para facilitar
a fixação do conteúdo e aprendizado);
8. Explique como ocorre a progressão exponencial do número de molécu-
las de DNA durante a técnica de PCR.
Por ação desse campo elétrico, as moléculas de DNA, que são negativas devido
à presença de fosfato em sua cadeia, são “puxadas” em direção ao polo positivo da
cuba de eletroforese.
Como o gel de agarose forma uma espécie de rede, essa separação se dá por ta-
manho das moléculas. Em outras palavras, moléculas grandes migram menos no gel,
por terem mais dificuldade em migrar por entre a malha da agarose. Já moléculas
pequenas, migram mais.
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A Figura 4 mostra uma imagem real da separação de um produto de PCR por
eletroforese em gel de agarose.
Aplicações da PCR
Agora que entendemos como funciona a reação, vamos estudar sobre algumas
de suas aplicações. Em um Laboratório Clínico, as aplicações da PCR são diversas.
Tudo depende da sequência que se deseja amplificar.
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No diagnóstico de doença causada por uma bactéria, por exemplo, deve-se esco-
lher amplificar uma sequência de DNA que seja exclusiva do microrganismo.
Imagine a seguinte situação: um paciente procura por auxílio médico por apre-
sentar tosse com secreção espessa, falta de ar, cansaço excessivo, perda de peso e
falta de apetite.
São também chamadas de VNTR (do inglês, Variable Number of Tandem Repeats)
e, como o nome sugere, há variações no número de repetições entre indivíduos.
Agora, imagine o seguinte caso: a perícia científica faz a análise de uma cena de cri-
me. Encontram vestígios de amostra biológica e fazem a coleta para posterior análise
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em Laboratório. Decidem amplificar a região de microssatélites da amostra encontrada
no local do crime e comparam com o mesmo lócus de três suspeitos diferentes.
Para realizar tal análise, é necessário utilizar primers específicos que são comple-
mentares especificamente para essa região cromossômica.
500 pb
400 pb
300 pb
200 pb
100 pb
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O DNA sintetizado a partir de um molde de RNA é chamado DNA complemen-
tar (cDNA).
Importante!
cDNA é uma molécula de DNA copiada a partir de um molde de RNA pela enzima Trans-
criptase Reversa. Como os íntrons presentes no DNA genômico são removidos durante o
processamento do RNA, o cDNA não contém íntrons.
Figura 6 – Compreensão das etapas de transcrição de RNA pela célula até a produção de
molécula de cDNA em um tubo de ensaio pela técnica de PCR pela transcriptase reversa
Fonte: Adaptado de TORTORA; FUNKE; CASE
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Importante!
Não confundir
• RT-PCR-, do inglês Reverse Transcriptase PCR: PCR com utilização da enzima Trans-
criptase Reversa;
• RT-PCR-, do inglês Real Time PCR: PCR em tempo real.
Preferencialmente, não utilize essa sigla quando quiser fazer referência a uma dessas
técnicas. Utilize o nome completo para não causar confusão.
Cada vez que uma molécula de DNA é sintetizada, emite fluorescência, ou seja, a
fluorescência aumenta a cada ciclo, já que novas moléculas são sintetizadas a cada ciclo.
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Perceba que, nos primeiros ciclos, especificamente nesse exemplo, até o ciclo 15,
não há a detecção de fluorescência acima da linha de base.
A amostra cuja curva exponencial está à esquerda possui mais DNA que as de-
mais amostras, enquanto a amostra cuja curva exponencial está à direita possui
menos DNA que as demais.
Assim temos que, quanto menor o CT, mais DNA alvo existe na amostra original.
Quais as aplicações da técnica de PCR em tempo real? Entre os diversos exem-
plos, podemos citar a quantificação de genes expressos em determinado tecido,
quantificação de carga viral, detecção de agentes infecciosos e reação do organismo
a determinado tratamento terapêutico entre outros.
Por exemplo, fazer o diagnóstico de pacientes infectados pelo vírus HIV para
determinar a carga viral presente no sangue do paciente e, consequentemente,
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Figura 8
Fonte: Getty Images
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3. O que é como é realizada a técnica de PCR em tempo real?
4. Explique o que é threshold e o que é CT;
5. Analise e explique um gráfico obtido após um PCR em tempo real;
6. O que é fase linear, fase exponencial e platô em uma reação de PCR em
tempo real? O que acontece em cada uma dessas etapas?
7. DESAFIO: a reação de PCR convencional seria equivalente à qual fase
do PCR em tempo real?
8. Como a carga viral de um paciente pode ser detectada pelo PCR em
tempo real?
9. Relacione o Ct com a quantidade de DNA em uma amostra;
10. Quais aplicações do PCR em tempo real?
Proteômica no Diagnóstico
de Agentes Patogênicos
Um dos maiores desafios da Microbiologia Clínica é o tempo para a liberação
do resultado.
MALDI refere-se à forma de ionizar, ou seja, de doar prótons para que a molécula
fique carregada positivamente.
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Um feixe de laser de alta frequência incide sobre o cristal e desorve da placa (retira)
o analito com matriz. Este absorve a energia do laser e transporta as moléculas do ana-
lito para a fase gasosa, transferindo prótons à ela e, consequentemente, ionizando-o.
Agora, a massa do analito carregado positivamente poderá ser medida pelo ana-
lisador de massas chamado ToF.
Uma vez ionizado, o analito “voa” em direção à diferença de potencial (ddp) que
existe ao longo de um tubo (tubo tempo de voo) e é detectada ao final.
Moléculas pequenas levam menos tempo para atingir o detector, enquanto molé-
culas maiores o atingem em mais tempo.
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• Realiza-se a cultura bacteriana em placas de Petri contendo meio de cultura;
• Uma parte da colônia é misturada à matriz (ácido orgânico capaz de absorver
energia do laser) e aplicada à placa para co-cristalização;
• Incide-se o laser sobre o ponto em que há bactérias e matriz;
• Diferentes moléculas da bactéria são dessorvidas, ionizadas e, em seguida, en-
tram no tubo tempo de voo para que suas massas sejam medidas;
• Um espectro de massa, característico dessa amostra, é determinado;
• Compara-se o espectro gerado na amostra com um banco de espectros presen-
te no software de análise.
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Em Síntese
Nesta Unidade, vimos como algumas Técnicas de Biotecnologia podem ser utilizadas no
diagnóstico de doenças genéticas e infecciosas.
Lembre-se de que, para a técnica de PCR, é fundamental um bom desenho dos primers
e este deve reconhecer uma sequência de DNA específica.
A técnica é a mesma (mesmo nas variantes), tudo dependerá qual sequência se
deseja analisar.
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Material Complementar
Indicações para saber mais sobre os assuntos abordados nesta Unidade:
Vídeos
Semi conservative replication
https://bit.ly/39JDraF
PCR em Tempo Real
https://youtu.be/d-wtEfjnjGU
Leitura
Modelo de replicação do DNA: Experimento de Meselson-Stahl
https://bit.ly/2V4ORk5
Aplicação das técnicas de pcr e suas técnicas derivadas em diagnóstico molecular
https://bit.ly/2weZ590
Novas metodologias de identificação de micro-organismos: MALDI-TOF
Espectrometria de massas para identificação de microrganismos.
https://bit.ly/2JHqJyF
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Referências
ALBERTS, B. et al. Biologia Molecular da Célula. Porto Alegre: Artmed,
2011. 1396p.
TORTORA, J., G., FUNKE, R., B., CASE, L., C. Microbiologia. 12.ed. Porto
Alegre: Artmed, 2017.
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