[enzimas] soro é geralmente baixa.

Aumenta significativamente com o aumento da

permeabilidade da membrana por lesão ou necrose celular. As enzimas difunden-se para os
capilares e atingem a corrente circulatória.
A determinação de enzimas no Laboratório Clínico estabelece a causa, localização e grau de
extensão da lesão, fazer controle do tratamento e ainda determinar a cura.

De maneira geral, as enzimas são medidas através de suas atividades catalíticas e os

resultados são expressos em termos da quantidade de atividade presente em determinado
volume da amostra.
Atividade Enzimática (expressa em unidades por litro de soro U/L) é a quantidade de enzima
que catalisa a reação de 1,0 micromole de substrato/minuto/litro de soro (em condições
padronizadas de pH e temperatura).
A velocidade da reação depende: [enzima]; [substrato]; temperatura reação; pH; força iônica;
presença de ativiadores/inibidores, tempo;
Enquanto a concentração do substrato exceder a concentração da enzima, a velocidade da
reação será proporcional à concentração da enzima na amostra.

Uma unidade de uma enzima (U) - é a quantidade de enzima que catalisa a transformação de 1
micromol de substrato por minuto e por litro de soro, nas condições padrão de pH e
temperatura.
Formas de avaliar a atividade enzimática (sob condições controladas de pH e temperatura):
1. Pelo desaparecimento do substrato (quantifica substrato não consumido);
2. Pela aparição dos produtos (já corado ou transformado em um composto corado);
3. Variação de absorção da coenzima (forma reduzida das coenzimas NADH e NADPH
absorvem energia na faixa UV, formas oxidadas NAD+ e NADP+ não)
Principais causas de erros nas determinações enzimáticas:
Cuidados na coleta, manuseio, armazenamento e transporte da amostra biológica;
Anticoagulante (inibem enzimas); Hemólise (Inibição e liberação de algumas enzimas);
Estase venosa (provoca hipóxia, liberando conteúdo das células para o soro); Coagulação
(provoca desintegração de hemácias e plaquetas); Lipemia (deixa soro turvo, provoca erro
fotométrico)
A velocidade aumenta com aumento da [substrato] até o ponto em que a enzima presente
encontra-se combinada com o substrato, na forma de E-S.

Ao se representar graficamente 1/V em função de 1/[S], se a cinética da enzima for de

Michaelis-Menten (se a relação entre a velocidade da reação e a [substrato] é definida pela
equação da hipérbole retangular), então obtém-se uma reta cujo declive é Km/Vmax e cuja
ordenada na origem é 1/Vmax, sendo 1/Km a abcissa do ponto da reta cuja ordenada é nula.
O conhecimento da constante de Michaelis-Menten (Km) é importante para se realizar uma
reação enzimática em condições de saturação do substrato (5 a 10x o valor de Km).
 Enzimas de importância clínica (soro) - anticoagulantes podem provocar erros de inibição enzimática - Velocidade da reação é proporcional a [enzima]
Teste Dosagem da atividade plasmática da
Fosfatase Alcalina (FA)
Enzima AST - Substância liberada pelo tecido
lesionado
Metodologia Cinética colorimétrica crescente de tempo
fixo (cor estável por 120min)
Função A FA do soro hidrolisa a timolftaleína
monofosfato liberando timolftaleína, que
tem cor azul em meio alcalino
Leitura Atividade enzima é proporcional à
Avaliação ativ. quantidade de Timolftaleína formada, que é
enzima medida colorimetricamente (590nm)
Reação
Linearidade Reação linear até 500 U/L com cinética de
ordem zero. Para valores de abs > 2,0, diluir
amostra de soro de tal forma que a [enzima]
seja diminuída para os valores
recomendados da linearidade do método.
Em seguida repete o teste e multiplica o
valor obtido pelo fator de diluição.
pH ótimo da reação 8,5 - 10,5
Cálculo FA (U/L) = (A(amostra)/min /
A(padrão)/min) x 45U/L
Significado clínico:  na doença hepática colestática (Cirrose,
valores elevados obstrução biliar intra e extra-hepática),
recuperação fraturas, Iperatividade em
Etilistas; hiperparatireoidismo,crescimento;
marcador de atividade do osteoblasto na
doença óssea.
Dosagem da atividade plasmática da Aspartato
Aminotransferase (AST/TGO)
Cinética-UV decrescente de múltiplos pontos
Transferência reversível de agrupamento amina
entre aac.
A velocidade de oxidação do NADH+ a NAD+
(340nm ) é proporcional à atividade da AST na
amostra.
400 U/L
7,4
TGO (U/L) = (∆A(amostra)/min /
∆A(calibrador)/min) x 112U/L
Indicador de dano hepatocelular; dano muscular e
infarto do miocárdio.
Relação AST/ALT > 1 cirrose alcoólica, hipatites
crônicas, congestão hepática e tumor(fígado).
AST/ALT < 1 hepatite virótica aguda.
Dosagem da atividade plasmática da Isoenzima
CK-MB (coração)
Isoenzima: duas ou mais formas, mesma função
catalítica
Isoenzima encontrada predominantemente no
músculo cardíaco
Imunoinibição
Amostra incubada com o reagente que contém
anticorpo que inibe atividade enzimática do
monômero CK-M. Mede-se CK-B que corresponde à
metada da atividade da CK-MB
Cinética-UV crescente
Cataliza conversão da creatina em fosfocreatina.
Quantidade de NADP+ reduzida (340nm) é
proporcional à atividadeda CK-MB
Até 600 U/L
6,7
Calcular a média das diferenças de absorbância por
minuto (∆A/min) e utilizar este valor para cálculo do
resultado. CK-MB (U/L) = ∆A/min x 8360
A isoenzima (CK-MB) é encontrada
predominantemente no músculo cardíaco -
Diagnóstico precoce e monitoramento do infarto
do miocárdio. Entre 3 a 5h [sérica] se eleva; atinge
pico após 12-24h; e permanece por 2 a 3 dias
Dosagem da Bilirrubina direta e
total
Bilirrubina - Substância
metabolizada e retirada do plasma
pelo fígado
Cinética colorimétrica crescente de
tempo fixo (cor estável por 30 min)
Produto da degradação do heme
HEME. Duas formas
conjugada(solúvel) e não
conjugada(insolúvel em H2O).
Diazo-bilirrubina formado (abs
529nm) é diretamente proporcional
à [bilirrubina] na amostra.
Bilirubina indireta é calculada pela
diferença entre bilirrubina total e
direta.
Até 25,0mg/dL
BT(mg/dL)=(Media(abs)amostra /
Média(abs)padrão) * 14,0
BD(mg/dL)=(Media(abs)amostra /
Média(abs)padrão) * 3,1
BI = BT-BD
Se o trato biliar ficar bloqueado, a
bilirrubina não será excretada -
Doença colestática; Falha no
mecanismo de conjugação dentro
do hepatócito - dano
hepatocelular - [bilirrubina
 conjugada]
Aumento da hemólise
(kernicterus); captação deficiente
pelos hepatócitos; defeitos na
reação de conjugação -
[bilirrubina indireta, não
conjugada]
Hepatites - [bilirrubina conjugada
e não conjugada]
Valores diminuídos Hipotireoidismo, hipofosfatemia, - - -
desnutrição, doença celíaca.
Tempo ótimo de 10' 30''(fase lag) 60'' 120'' 5'(fase lag) 6' 7' -
reação
Localização principal Fígado (doença obstrutiva), osso e epitélio Fígado (hepatócitos - citoplasma 40% e M. cardíaco Bilirrubina não conjugada ou
do trato biliar. mitocôndria 60%), M.esquelético e em menor indireta circula no sangue ligada à
concentração rins e pâncreas (PM 110.000 Da). albumina; Conjugada no fígado e
escretada para a bile, atingindo o
intestino delgado.
Cálculo da atividade Produto formado Multicalibrador ou padrão-calibrador 112U/L Coeficiente de absortividade molar do NADP+ () = Multicalibrador ou padrão-
enzimática (U/L): fator = 45 - [P] = 0,45 mmol/L 6,22x103Lmol-1cm-1 calibrador
Padrão [Padrão] no tubo de ensaio do sistema Cinética: BT = 14,0 e BD = 3,1
reacional: C1.V1 = C2.V2
Assim:

Ponto final

Coef. de absortividade molar: valor constante de

absorbância da molécula em solução, na
concentração de 1 mol/L (1M), medida em
determinado comprimento de onda (nm), usando
uma cubeta de 1 cm de diâmetro.
Valores referência 13-43U/L - Adultos 5-34U/L 25U/L BD (conj) 0,1 a 0,3mg/100mL
56-156 U/L crianças até 12 anos BI (não conj) menor que
Uma unidade é igual a quantidade de 1,0mg/100mL
enzima que libera por hidrólise 1 micromol BT 0,3 a 1,0mg/100mL
de timolftaleína por minuto, por litro de soro
nas condições do teste.
Interferentes Hemólise, EDTA, Citrato, fluoreto, oxalato. Hemólise, lipemia, bilirrubina Triglicerídios > 170mg/dL;
Atividade da FA diminui quando há Alcolismo crônico (aumenta de 18 a 100% amostras muito hemolisadas;
deficiência de zinco. atividade da AST). Uso prolongado de esteroides,
aspirina, anabolizantes.
Bilirrubina Indireta: lipossolúvel, circula ligada à albumina. Bilirrubina livre; Não há colúria (bilirrubina na urina) e há urobilinogênio - (Icterícia pré-hepática/hemolítica ou Icterícia hepática).
Bilirrubina conjugada: conjugada ao ác. glucurônico no fígado; hidrossolúvel; excretável pela bile/rins (Icterícia pós-hepática/obstrutiva). bilirrubina conjugada, com colúria; ↓urobilinogênio fecal (fezes claras);
Absortividade molar: característico de uma substância. Indica a quantidade de luz absorvida num determinado comprimento de onda. (L mol-1 cm-1)
Fosfatase ácida (FAC) pH ótimo entre 4,5 e 7,0. Enzima presente em elevada concentração na
glândula prostática, eritrócitos, plaquetas, ossos, fígado, rins e baço. Diagnóstico e
monitoração do câncer prostático (forma metastisada). VR: 0,5 a 1,9U/L
Critérios para uma análise espectrofotométrica satisfatória:
 Especificidade da reação colorimétrica
 proporcionalidade entre a cor e a concentração
 estabilidade da cor
 repordutibilidade
 limpidez da solução
 alta sensibilidade.

Por que é mais exato medir a absorbância na faixa entre 0,2 e 0,9? Pois geralmente nesta faixa
de absorbância a maioria das substâncias apresentam uma relação linear entre a absorbância e
a concentração, sendo portanto possível a aplicação da Lei de Beer. Como a metodologia
obedece a lei de Lambert-Beer, pode-se efetuar os cálculos através do Fator de Calibração
(FC).
Sehr geehrter Herr Sczepanski,

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Mit freundlichen Grüssen

Milena Tapia-Xavier