Microbiologia Mdica 2006/2007

Aula Prtica n. 3
Cultura de microrganismos necessidades nutritivas. Meios de cultura: composio,
preparao, armazenamento, utilizao. Tcnicas de sementeira.

CULTURA DE MICRORGANISMOS - MEIOS DE CULTURA

Conhecer as caractersticas gerais dos meios de cultura relativamente a

composio.
Conhecer as condies de incubao dos meios de cultura.
Compreender a grande diversidade de necessidades nutricionais e
ambientais entre os microrganismos.
Compreender a utilidade do exame cultural.
Conhecer a classificao geral dos meios de cultura.
Conhecer e caracterizar meios de cultura comuns no laboratrio.
Saber escolher meios de cultura consoante os objectivos pretendidos.
Conhecer as tcnicas de preparao de meios de cultura desidratados.

TEXTO DE APOIO:

Meios de cultura: composio, preparao e uso.

Preparao de alguns meios de cultura.

MEIOS DE CULTURA

INTRODUO

O estudo microscpico das caractersticas morfolgicas (dimenso,

forma e tipo de associao) e das caractersticas de colorao ,
geralmente, insuficiente para a obteno de uma identificao satisfatria
do agente patognico. Assim, para conhecer as propriedades, fisiolgicas e
bioqumicas necessrio cultivar as clulas microbianas no laboratrio. A
cultura de microrganismos consiste no crescimento de populaes
microbianas em meios de cultura laboratoriais. Uma cultura que tem apenas
um tipo de microrganismo conhecida por cultura pura, uma cultura que
tem mais do que um tipo de microrganismo uma cultura mista. A cultura
de microrganismos consiste num passo rotineiro do exame microbiolgico,
sendo feito simultaneamente com o exame microscpico ou imediatamente
depois.

Com a cultura de microrganismos pretende-se:

Aumentar a quantidade de microrganismos, que por vezes, ocorrem em

nmero reduzido na amostra, para facilitar posteriormente a
identificao.
Procurar isolar os tipos de microrganismos existentes numa populao
microbiana mista.
Diferenciar entre grupos de microrganismos atravs da aparncia
macroscpica das colnias e das reaces bioqumicas com o meio.
Caracterizar e identificar os microrganismos atravs das caractersticas
das suas colnias, em um ou mais meios de cultura, e pelas suas
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capacidades de produzirem alteraes qumicas em diferentes meios de

cultura.
Quantificar microrganismos.
Analisar substncias de ocorrncia natural.

CARACTERSTICAS GERAIS DOS MEIOS DE CULTURA

Para a cultura de microrganismos necessrio existirem meios de

cultura apropriados que simulem ou at melhorem as condies naturais do
ambiente em que se desenvolvem.
Um meio de cultura um substrato nutritivo capaz de permitir a
nutrio e o crescimento dos microrganismos (bactrias, fungos, algas,
parasitas) fora do seu ambiente biolgico natural, ou seja, uma
preparao de nutrientes utilizada para o crescimento de microrganismos
em laboratrio.
A sobrevivncia e o crescimento dos microrganismos depende de um
adequado suprimento de nutrientes e de um ambiente fsico favorvel. No
entanto, h uma grande diversidade de necessidades nutricionais e
ambientais entre os microrganismos e por isso que s compreendendo as
suas necessidades que se consegue ter sucesso na cultura de
microrganismos no laboratrio.

Composio dos meios de cultura

Os meios de cultura devem conter os nutrientes em quantidades e

propores correctas para a manuteno e multiplicao dos
microrganismos. A maior parte dos microrganismos utiliza substncias de
baixo peso molecular que so, frequentemente, derivadas da degradao
enzimtica de nutrientes complexos. Por isso, os nutrientes indispensveis
ao organismo em causa devem estar sob forma assimilvel.
As necessidades nutricionais dos microrganismos so satisfeitas no
laboratrio atravs da variedade de meios de cultura existentes. Os
microrganismos tm necessidades nutricionais variveis de acordo com a
espcie, no entanto, h determinadas substncias cuja necessidade
comum a todos.

Constituintes essenciais ou bsicos

gua
A gua um componente importante e sempre presente em altas
quantidades. Todas as clulas requerem gua no meio para que os
nutrientes de baixo peso molecular possam atravessar a membrana celular.
A gua utilizada nos meios de cultura deve ser destilada, pois a gua de
consumo contm minerais que podem reagir com os constituintes do meio
formando precipitados, alm de substncias antispticas (ex. cloro) que
podem interferir com o crescimento microbiano.

Fonte de energia
As actividades metablicas das clulas s podem ocorrer se houver energia
disponvel na clula. Os microrganismos podem ser divididos em duas
categorias de acordo com a sua fonte de energia:
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- fototrficos: usam a energia radiante como nica fonte de energia,

atravs da fotossntese.
- quimiotrficos: dependem da oxidao de compostos qumicos como
fonte de energia. Alguns microrganismos usam molculas orgnicas (como a
glicose), enquanto outros usam compostos inorgnicos (como o H 2S e o
NaNO2).

Fonte de carbono
O carbono um elemento essencial necessrio ao crescimento microbiano.
Entre os microrganismos h duas categorias de acordo com as suas
necessidades nutricionais:
- autotrficos: usam carbono inorgnico na forma de dixido de carbono
como nica ou principal fonte de carbono. Estes microrganismos podem ser
cultivados num meio de cultura s com compostos inorgnicos, pois no
necessitam de compostos orgnicos e podem ser inibidos por eles.
- heterotrficos: usam compostos orgnicos como principal fonte de
carbono. Estes microrganismos no podem ser cultivados num meio s com
compostos inorgnicos, pois eles necessitam de nutrientes orgnicos,
principalmente glicose.

Fonte de hidrognio e de oxignio

As necessidades de hidrognio e de oxignio so, geralmente, satisfeitas ao
mesmo tempo que as de carbono, uma vez que esses elementos fazem
parte de muitos compostos, usados como fonte de carbono e de energia.

Fonte de azoto
O azoto tambm um elemento essencial para a sntese de muitas
macromolculas celulares particularmente protenas e cidos nucleicos.
Alguns microrganismos utilizam o azoto atmosfrico (N 2), outros contam
com compostos inorgnicos como a amnia e os sais de nitrato, enquanto
outros necessitam de compostos orgnicos que contm azoto como os
aminocidos.
Uma das principais fontes de azoto de origem comercial so as peptonas.
Estas so obtidas a partir da hidrlise cida, alcalina ou enzimtica de
matrias proteicas de origem animal ou vegetal e incluem aminocidos,
peptdeos e polipeptdeos. As peptonas so hidrossolveis e no coagulveis
pelo calor o que permite que os meios de cultura sejam esterilizados no
autoclave.

Fonte de enxofre e de fsforo

O enxofre faz parte de alguns aminocidos e por isso um componente das
protenas. As suas fontes incluem compostos orgnicos como os
aminocidos sulfurados, compostos inorgnicos como os sulfatos, e ainda o
enxofre elementar.
O fsforo necessrio para a formao dos cidos nucleicos e para a
sntese dos compostos orgnicos de alta energia - adenosina trifosfato
(ATP). O fsforo fornecido na forma de sais de fosfato para ser usado por
todas as clulas microbianas.

Elementos metlicos
A maior parte das clulas necessita de alguns ies metlicos como clcio,
potssio, magnsio, ferro, mangansio, zinco, cobre, molibdnio, nquel,
cobalto e sdio para as suas vrias actividades celulares. Estes ies so
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necessrios em quantidades nfimas (micronutrientes), sendo usados como

cofactores e activadores de enzimas.

Factores de Crescimento:

So substncias essenciais para o metabolismo bacteriano, pois so

componentes celulares ou precursores desses componentes que no podem
ser sintetizados pelos microrganismos (aminocidos, purinas, pirimidinas e
vitaminas). Os microrganismos que no conseguem sintetizar esses
componentes dentro da clula necessitam de uma fonte externa.
As vitaminas so substncias orgnicas que contribuem para o
crescimento celular e so essenciais, em pequenas concentraes, para as
actividades celulares. So tambm fontes de coenzimas que so
necessrias para a formao de sistemas enzimticos activos.
So factores de crescimento o sangue (factores x e v e soro),
aminocidos, extracto de leveduras, lquido asctico, etc. A aco de
algumas destas substncias reside na sua capacidade de adsorver
substncias txicas do meio exterior.

Substncias Inibidoras:

Incluem corantes, antibacterianos, sais biliares, NaCl, alterao do

pH, etc.

Indicadores de pH:

Indicam se o microrganismo ou no capaz de utilizar o substrato

alterando o pH e originando mudanas de cor do meio de cultura.

Substncias solidificantes (inertes):

So aquelas que conferem consistncia ao meio. Utilizam-se o agar

ou gelose, a gelatina e o gel de slica.

Condies de incubao dos meios de cultura

Para que haja crescimento microbiano necessrio que um meio de

cultura fornea nutrientes, mas tambm preciso que fornea um ambiente
fsico adequado a cada microrganismo.
A temperatura, o pH e a atmosfera gasosa so trs dos mais
importantes factores fsicos que influenciam o crescimento e sobrevivncia
dos microrganismos.

Temperatura

O crescimento microbiano depende directamente de como a

temperatura afecta as membranas, os ribossomas e outros componentes e
as enzimas celulares. Com o aumento da temperatura, a actividade
enzimtica aumenta at ao ponto em que ocorre desnaturao irreversvel
da estrutura proteica das enzimas. Geralmente, temperaturas da ordem dos
70 C destroem a maioria das enzimas essenciais e causam morte celular.
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Por outro lado, medida que a temperatura baixa ocorre inactivao das
enzimas e o metabolismo celular diminui gradualmente levando
consequentemente inibio do crescimento celular (aos 0 C as reaces
bioqumicas cessam na maior parte das clulas).

Cada microrganismo requer um intervalo de temperatura limitado de

acordo com a sensibilidade dos seus sistemas enzimticos ao calor. Assim,
para cada espcie temos a considerar:
- Temperatura mnima de crescimento: a temperatura mais baixa qual o
crescimento ainda ocorre. Abaixo desta temperatura a actividade
enzimtica inibida e as clulas ficam metabolicamente inactivas de modo
que o crescimento pra.
- Temperatura mxima de crescimento: a temperatura mais alta qual o
crescimento ainda ocorre. Acima desta temperatura a maior parte das
enzimas destruda e o organismo morre.
- Temperatura ptima de crescimento: a temperatura qual a taxa de
reproduo mxima, o microrganismo cresce mais rapidamente; no
entanto, no necessariamente a temperatura ptima ou ideal para as
outras actividades enzimticas da clula. A temperatura ptima para uma
espcie microbiana no fica no meio do intervalo de temperatura, mais
prxima do limite superior. A temperatura ptima de um determinado
microrganismo est correlacionada com a temperatura do seu habitat
normal.

Os microrganismos podem ser classificados em trs grandes grupos

atendendo s suas exigncias de temperatura:

Psicrfilos
Crescem abaixo dos 20 C, sendo a sua temperatura ptima de 15 C ou
mais baixa. Uma das caractersticas deste grupo o facto de crescerem
entre os 0 e os 10 C, o que permite, por exemplo, que possam crescer em
alimentos armazenados no frigorfico. Alguns crescem a temperaturas
inferiores a 0 C e por isso em alimentos congelados.

Mesfilos
Crescem entre os 20 e os 45 C. Tm capacidade para crescer
temperatura do corpo humano (37 C) e assim neste grupo inclui-se a
grande maioria dos microrganismos patognicos.

Termfilos
Crescem a temperaturas superiores a 45 C, sendo o ptimo entre os 50 e
os 60 C. Algumas bactrias so capazes de sobreviver fervura, mesmo
que no sejam capazes de crescer (termodricos). Muitos dos formadores
de esporos suportam a ebulio durante 15 minutos devido aos seus
resistentes endsporos.

pH
O crescimento e sobrevivncia dos microrganismos muito
influenciado pelo pH do meio ambiente e cada espcie tem a capacidade de
crescer dentro de um intervalo (mnimo, ptimo e mximo) especfico de
pH. O pH ptimo para o crescimento microbiano, para o qual mxima a
multiplicao, aproximadamente no meio do intervalo de pH onde o
crescimento ocorre.
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O aumento ou diminuio do pH leva a uma diminuio da taxa de

reaces qumicas devido destruio das enzimas celulares e por
conseguinte afecta a taxa de crescimento e finalmente a sobrevivncia do
microrganismo.
Diferentes espcies de microrganismos tm diferentes tolerncias de
pH e estes pH especficos reflectem a adaptao do organismo ao seu
ambiente natural. No entanto, h determinadas espcies que esto
adaptadas para crescer a vrios valores da escala de pH.
Os microrganismos acidfilos crescem a baixos valores de pH (1-
5,5), os alcalfilos desenvolvem-se a valores elevados de pH (8,5-11,5) e
os neutrfilos preferem pH 5,5-8.
Pode-se considerar que para a maioria das bactrias o pH mnimo
para o crescimento 4 e o mximo 9, sendo o ptimo entre 6 e 8
(neutrfilos). Os fungos preferem ambientes ligeiramente cidos, sendo o
seu pH ptimo entre 4 e 6.
Os meios de cultura esto ajustados para um pH volta de 7, pois
este o valor geralmente mais vantajoso para o crescimento da maioria das
bactrias. preciso ter em conta que as actividades metablicas dos
microrganismos levam produo de compostos cidos (a partir da
degradao dos hidratos de carbono) ou bsicos (a partir da degradao
proteica) que causam alteraes no pH do meio que podem inibir o
crescimento dos microrganismos. Para evitar grandes variaes de pH
necessrio adicionar tampes aos meios de cultura (adio de
concentraes equimolares de sais de cidos fracos e sais de bases fracas).
Muitos meios contm aminocidos, peptonas e protenas que devido s suas
propriedades anfotricas, funcionam como tampes naturais.

Atmosfera gasosa

Os microrganismos apresentam uma grande diversidade em relao

sua capacidade de usar o oxignio livre para a respirao celular. Estas
variaes nas necessidades de oxignio reflectem as diferenas nos
sistemas enzimticos bioxidativos presentes nas vrias espcies. Na maior
parte das clulas o oxignio atmosfrico necessrio para o processo
bioxidativo da respirao, no entanto h clulas que no tem o sistema
enzimtico para a respirao em presena do oxignio e por conseguinte
necessitam de usar uma forma anaerbia de respirao ou fermentao.

Assim, os microrganismos so classificados em grupos fisiolgicos

atendendo ao seu comportamento em relao ao oxignio:

Aerbios estritos (ex. Mycobacterium, Legionella, fungos filamentosos)

So os que necessitam da presena de oxignio para crescer e podem faz-
lo numa atmosfera com 21 % de oxignio (ao ar). Esto dependentes da
respirao aerbia, utilizando o oxignio como aceitador final de electres.

Microaerfilos (ex. Helicobacter pylori, Campylobacter jejuni)

Necessitam de oxignio como os aerbios, mas s conseguem crescer com
concentraes de oxignio menores do que as que existem na atmosfera (
21%); crescem melhor com concentraes de oxignio entre 1 e 15%.

Anaerbios estritos (ex. Clostridium botulinum)

So aqueles que podem ser intoxicados pelo oxignio, que no crescem
na atmosfera e no usam o oxignio. Obtm energia por processos que no
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envolvem a utilizao de oxignio (usam processos fermentativos ou

respirao anaerbia).
Nestes organismos a presena de oxignio atmosfrico leva formao de
metabolitos txicos como o perxido de hidrognio e o radical superxido
(O2-), visto que no possuem as enzimas dismutase do superxido (converte
o io superxido em perxido de hidrognio) e catlase e/ou peroxidases
(convertem o perxido de hidrognio em gua e oxignio).
Por conseguinte pequenas quantidades de oxignio atmosfrico so letais
para estes microrganismos. No laboratrio, utilizam-se jarras de anaerobiose
em que o oxignio removido retirando-se o ar ou por reaco qumica.

Anaerbios aerotolerantes (ex. bactrias lcticas)

So aqueles que no beneficiam do oxignio, pois so organismos que
utilizam, exclusivamente, processos metablicos anaerbios (fermentao).
Crescem igualmente bem na presena de oxignio, pois produzem catlase
e/ou superxido dismutase (ao contrrio dos anaerbios).

Aerbios ou anaerbios facultativos (ex. Escherichia coli,

Saccharomyces cerevisiae):
So aqueles que crescem em presena ou em ausncia de oxignio. No
entanto, crescem melhor em presena do que em ausncia de oxignio, no
sendo dependentes do oxignio atmosfrico. Usam preferencialmente o
oxignio para a respirao aerbia, mas num meio pobre em oxignio
utilizam processos bioenergticos como a fermentao ou a respirao
celular anaerbia, utilizando compostos como nitratos ou sulfatos como
aceitadores finais de electres.

Procedimentos para determinar as necessidades de oxignio:

As necessidades de oxignio podem ser determinadas inoculando-se

o microrganismo em questo num tubo de ensaio contendo o meio slido
fundido, agitando-se o tubo para dispersar os microrganismos atravs do
meio e por fim deixando solidificar o meio para assegurar que as clulas
fiquem dispersas. Aps incubao, o microrganismo vai crescer na parte do
meio que contm a concentrao apropriada de oxignio, mostrando quais
as suas necessidades:

aerbios estritos: apresentam crescimento superfcie.

anaerbios estritos: o crescimento limitado ao fundo do tubo.
anaerbios facultativos: apresentam crescimento atravs de todo o meio,
mas predominando na parte superior do tubo.
anaerbios aerotolerantes: apresentam crescimento uniforme atravs de
todo o tubo.
microaerfilos: crescem numa zona ligeiramente abaixo da superfcie.

CLASSIFICAO DOS MEIOS DE CULTURA

Composio Qumica

Quimicamente definidos ou sintticos

So constitudos por quantidades conhecidas de substncias
orgnicas e/ou inorgnicas quimicamente puras e bem definidas, ou seja, a
sua composio qumica conhecida.
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Estes meios so, geralmente, usados na cultura de microrganismos

autotrficos, como as algas, ou de microrganismos heterotrficos pouco
exigentes.
Podem ser usados para determinar as necessidades nutricionais
precisas de um microrganismo. Adicionando ou retirando um constituinte a
este tipo de meios permite verificar se esse constituinte essencial ou no
para o crescimento de um determinado microrganismo.

Quimicamente complexos ou artificiais

Resultam da adio de substncias naturais de composio qumica

mal definida a um meio sinttico, ou seja, a composio qumica exacta no
se conhece.
So usados para simular e at melhorar o ambiente natural dos
microrganismos a ser estudados. So usados por rotina na cultura de
microrganismos
So compostos por um nmero limitado de substncias complexas,
extractos de plantas ou animais, cujas composies qumicas exactas no
so conhecidas: extracto de carne, peptonas (protenas parcialmente
degradadas por enzimas como os hidrolisados de casena do leite e os
hidrolisados de protenas de soja), extracto de leveduras, sangue, soro,
leite, extracto de solo, etc. Todos estes produtos adicionados ao meio de
cultura estimulam a crescimento da maior parte dos microrganismos
heterotrficos.

Estado Fsico

Lquidos ou caldos

So aqueles que no tm agente solidificante. No permitem

distinguir os diferentes tipos de microrganismos pelo aspecto morfolgico
porque no h formao de colnias organizadas.
So usados para o estudo da morfologia bacteriana, para aumentar o
nmero de microrganismos e para vrias provas bioqumicas (ex. provas
fermentativas).

Slidos

Obtm-se a partir dos meios de cultura lquidos aps adio de uma

substncia solidificante em determinada quantidade.
Os meios slidos tm a vantagem de apresentar uma superfcie
endurecida onde os microrganismos podem crescer, formando colnias.
Cada colnia um aglomerado de clulas visvel macroscopicamente que
teve origem a partir da multiplicao de uma s clula e que representa o
crescimento de uma s estirpe de microrganismos.
Estes meios permitem observar a morfologia das colnias, isolar
culturas puras, conservar e armazenar estirpes bacterianas e observar
reaces bioqumicas especficas.
Um meio completamente slido requer uma concentrao de agar
entre 1,5 e 2%, enquanto para se obter um meio semi-slido so
necessrias concentraes entre 0,2 e 0,5%.

Semi-slidos
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Obtm-se tambm a partir de meios de cultura lquidos aps adio

de um agente solidificante em menor proporo que nos meios slidos.
Estes meios de cultura so usados no estudo da mobilidade activa
dos microrganismos. Podem tambm ser usados em estudos fermentativos
e na promoo de crescimento anaerbio.

Agentes solidificantes

Agar ou Gelose:

o agente solidificante mais utilizado pelos microbiologistas. um

polissacardeo complexo rico em galactose, mas sem valor nutricional,
extrado de algas marinhas. No um nutriente para a maior parte dos
microrganismos e no metabolizado durante o crescimento microbiano.
um excelente agente solidificante, pois liquefaz-se a cerca de 100
C (o ponto de liquefaco aos 96 C) mantendo-se nesse estado fundido
at aos 42 C quando passa a gel slido. Assim, os microrganismos,
principalmente os patognicos, podem ser cultivados a 37 C ou a
temperaturas ligeiramente mais altas sem o meio de cultura se liquefazer
durante a incubao. Por outro lado, como a maior parte dos
microrganismos no morre a 45 C, podem ser adicionados ao meio fundido
antes deste ser colocado em tubos ou placas de Petri para solidificar. Alm
de ser possvel adicionar aos meios fundidos certas substncias termolbeis
previamente esterilizadas por filtrao.

Gelatina:

obtida a partir de cartilagens e aponevroses de mamferos. Tem

como inconvenientes principais estar liquefeita s temperaturas usadas,
geralmente, para incubar os microrganismos patognicos para o Homem (
37 C), pois s solidifica aos 22 C, e poder ser digerida por aco dos
microrganismos.
Actualmente, est em desuso, sendo s utilizada para estudar
microrganismos que actuem sobre ela, ou seja, que possuam a enzima
gelatinase (prova da hidrlise da gelatina).

Slica gel:

uma substncia inorgnica inerte e inatacvel por enzimas

microbianas. Devido aos seus custos s usada em trabalhos de grande
rigor cientfico.

Objectivos Funcionais

Simples ou bsicos

So os meios que apenas possuem os nutrientes bsicos ou

essenciais, por isso s crescem microrganismos pouco exigentes que
tenham grande capacidade de sntese. Como so meios pobres em
nutrientes so insuficientes para suportar o crescimento de microrganismos
mais exigentes.
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Exemplos:

gua Peptonada: contm gua, peptonas e cloreto de sdio.

Ricos ou enriquecidos

A partir dos meios bsicos, por adio de outros nutrientes,

produzem-se todo o tipo de meios complexos e ricos. Estes meios so
usados para a cultura de microrganismos exigentes que tm
necessidades nutricionais altamente elaboradas e especficas. Estes
microrganismos no crescem ou crescem com dificuldade em meios
bsicos e por isso requerem a adio de factores de crescimento (so
substncias essenciais para o seu metabolismo, mas que eles no so
capazes de sintetizar). Nestes meios pode haver tambm capacidade de
adsoro de substncias txicas.
Estes meios permitem o crescimento generalizado de todos os
microrganismos da amostra. Assim, utilizam-se quando se quer
quantificar os microrganismos de uma amostra ou se pretende fazer
crescer todos os microrganismos que existam num produto que em
princpio deveria estar estril (ex. sangue), j que qualquer crescimento
sinal de patogenicidade.
Um meio rico contm uma grande variedade de substncias
orgnicas como: extracto de carne, extracto de levedura, sangue, soro,
lquido asctico, infuso de corao e crebro, etc.

Exemplos:

Agar Sangue: composto por 5 a 10% de sangue desfibrinado, animal ou

humano, o que vai enriquecer o meio em nutrientes. O sangue s
adicionado ao meio liquefeito quando a temperatura se encontra entre
45-48 C, para que os glbulos vermelhos fiquem intactos.
Agar Chocolate: tambm composto por sangue, mas este adicionado
ao meio quando a sua temperatura de 80 C. utilizado para o
crescimento de microrganismos exigentes como os do gnero Neisseria.
Brain-Heart infusion: um meio muito rico que contm infuso de crebro
e corao de vitela. utilizado para microrganismos exigentes como os
do gnero Streptococcus e Neisseria.

Selectivos (slidos) ou de enriquecimento (lquidos)

Alm dos nutrientes necessrios para o crescimento de todos os

microrganismos, estes meios especficos contm um ou mais compostos
qumicos que so essenciais devido sua especificidade funcional.
Estes meios so usados para isolar grupos especficos de
microrganismos, pois seleccionam um determinado microrganismo de um
produto polimicrobiano (expectorao, fezes, saliva, etc.). No entanto,
preciso ter em conta que no h meios de cultura 100% selectivos, podendo
crescer eventualmente outros microrganismos.
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So meios que permitem o crescimento de um tipo de

microrganismos em detrimento de outro ou de outros, pois so formulados
para suprimir o crescimento dos microrganismos que no interessam ao fim
em vista, permitindo o crescimento dos microrganismos que se desejam
isolar. Assim, o favorecimento de um tipo de microrganismo pode dever-se a
uma aco inibidora sobre os restantes (condiciona o crescimento de uns)
ou aco estimuladora do microrganismo pretendido (mais raro) ou
ambas, ou seja, inibe o crescimento de um tipo de microrganismos
enquanto aumenta o crescimento de outro.
Os meios lquidos com inibidores do crescimento microbiano no
permitem uma seleco to precisa como nos meios slidos, h um
enriquecimento do contedo microbiano do meio. Estes caldos estimulam o
crescimento de um microrganismo especfico, que se torna assim a espcie
dominante porque se sobrepe aos seus competidores. Permitem aumentar
a concentrao de microrganismos que esto em minoria no ambiente.
Os agentes de seleco podem ser produtos qumicos, corantes
(eosina, verde de malaquita, azul de metileno, violeta cristal, verde
brilhante, etc.), antimicrobianos, sais minerais (tetrationato de sdio, nitrato
de potssio, telurito de potssio, cloreto de sdio, etc.), sais biliares,
asparagina (promove o crescimento), etc.

Exemplos:
Agar Sabouraud: favorece o crescimento dos fungos, pois tem um pH
baixo (5,6) e uma alta concentrao de glicose, alm disso o crescimento
bacteriano est inibido devido presena de um antibacteriano no meio.
Meio de Lwenstein-Jensen e Meio de Middlebrook: so meios com
glicerol e verde de malaquita (corante) que inibem outras bactrias
permitindo isolar o Mycobacterium tuberculosis. O primeiro meio contm
asparagina que um favorecedor do crescimento desta espcie
bacteriana.
Caldo Verde Brilhante: condiciona o crescimento de cocos Gram positivo e
favorece o crescimento de bacilos Gram negativo, principalmente da
famlia Enterobacteriaceae devido presena de sais biliares e do
corante verde brilhante.
Caldo de Tetrationato e Caldo de Selenito: o tetrationato e o selenito de
sdio so substncias inibidoras de bactrias intestinais e de muitos
cocos Gram positivo. Estes meios so utilizados no isolamento de
Salmonella e de Shigella a partir de produtos (gua, alimentos, fezes,
urina, etc.) onde a concentrao destes patognicos baixa em relao
ao resto da populao normal.

Diferenciais

Estes meios permitem separar grupos de microrganismos atravs da

sua aparncia no meio (caractersticas morfolgicas ou bioqumicas).
Tm incorporado substncias qumicas (indicadores) que, aps a
inoculao e a incubao, assinalam alteraes caractersticas na aparncia
do crescimento microbiano (colnias) e/ou no meio que rodeia as colnias
(geralmente por mudana de cor do meio onde existe a colnia) o que
permite a sua diferenciao e identificao. Do informao acerca do
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comportamento e do metabolismo dos microrganismos, permitindo a

visualizao de actividades metablicas.
Um meio com um hidrato de carbono e um indicador de pH permite
detectar se o acar foi ou no metabolizado, pois este quando fermentado
origina como produtos terminais cidos orgnicos que fazem diminuir o pH e
por isso mudam a cor do meio assinalando as caractersticas fermentativas
do microrganismo em estudo.

Exemplos:

Meio de Simmons: o citrato neste meio a nica fonte de carbono, assim

se houver crescimento microbiano significa que o citrato est a ser
metabolizado. Isto origina uma variao de pH (aumento de pH) que
detectada pelo azul de bromotimol que passa de verde a azul.
Agar Sangue: este meio com glbulos vermelhos intactos fornece
informao acerca da capacidade hemoltica dos microrganismos.
Distingue as bactrias no hemolticas (gama-hemlise) das bactrias
alfa-hemolticas (hemlise parcial) e das bactrias beta-hemolticas
(hemlise total).
Agar Cled (Cystine Lactose Electrolyte Deficient Media): um meio
diferencial, pois como contm lactose e um indicador de pH (azul de
bromotimol) permite detectar se o acar foi ou no metabolizado.
usado para cocos Gram positivo e para bacilos Gram negativo, e permite
travar o crescimento em toalha dos Proteus.

Simultaneamente selectivos e diferenciais

Exemplos:

Agar MacConkey: um meio selectivo, pois contm sais biliares e o

corante violeta de cristal para inibir o crescimento de bactrias Gram
positivo permitindo que as Gram negativo cresam. Por outro lado, um
meio diferencial, pois como contm lactose e um indicador de pH
(vermelho neutro) permite distinguir entre as bactrias Gram negativo
que fermentam (ex. E.coli) e as que no fermentam (ex. Salmonella e
Shigella) esse hidrato de carbono. As colnias das bactrias
fermentadoras de lactose aparecem rosadas enquanto as outras ficam
incolores e at transparentes.
Agar Manitol Sal: um meio selectivo pois, como tem uma grande
concentrao salina (7,5% NaCl) inibe a maior parte dos microrganismos
permitindo o crescimento das bactrias da famlia Micrococcaceae (cocos
Gram positivo). um meio diferencial, pois tem presente o lcool manitol
e um indicador de pH (vermelho de fenol) que passa de vermelho a
amarelo se o microrganismo fermentar o manitol.
Agar SS: a presena de sais biliares e do corante verde brilhante tornam-o
um meio selectivo, pois inibem muitas bactrias Gram positivo. bom
para o isolamento de Salmonella e Shigella. um meio diferencial devido
presena de lactose e de um indicador de pH (vermelho neutro) que
permite distinguir os microrganismos fermentadores da lactose (colnias
rosa) dos no fermentadores (colnias da cor do meio).
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Agar EMB (Eosine Methylene Blue) ou Meio de Levine: um meio

selectivo, pois parcialmente inibidor para microrganismos Gram positivo
devido ao azul de metileno, e por conseguinte o crescimento dos Gram
negativo mais abundante. um meio diferencial, pois a presena de
lactose e do corante eosina permite diferenciar as bactrias
fermentadoras das no fermentadoras da lactose. Os microrganismos
fermentadores da lactose levam baixa de pH, de modo que as colnias
aparecem com aspecto verde metalizado. Os que no fermentam a
lactose produzem colnias incolores, mas devido sua transparncia
aparecem com a cor do meio, ou seja, prpura. Este meio permite
identificar os Gram negativo patognicos atravs da caracterizao
visual, porque eles raramente fermentam a lactose.

Meios de transporte

So meios estveis que no permitem que os microrganismos se

desenvolvam, mas mantendo a viabilidade de todos os microrganismos da
amostra sem alterarem as suas concentraes.
So usados para armazenamento temporrio de amostras para serem
transportadas para o laboratrio, nas mesmas condies em que se
encontravam no momento da colheita.

Meios de manuteno

Permitem manter as culturas durante algum tempo, pois os

microrganismos vo crescendo, mas lentamente.

PREPARAO GERAL DE MEIOS DE CULTURA DESIDRATADOS

Os meios de cultura desidratados so produzidos por Laboratrios

comerciais, de tal modo que o nome e a composio de cada meio
praticamente semelhante para todas as marcas. So fornecidos em p ou
em grnulos e a sua preparao faz-se pela simples adio de gua
destilada, bidestilada ou desionizada (obtido pela aco de resinas troca-
ies) em determinada proporo que se encontra expressa no rtulo da
embalagem.

Rehidratao

Num recipiente de vidro pesa-se cuidadosamente o p relativo ao

volume que pretendemos obter, segundo as indicaes do fabricante. Esses
componentes do meio vo ser agora dissolvidos em gua destilada,
bidestilada ou desionizada, e depois com a ajuda do calor aquece-se at
dissoluo completa.
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Ajuste do pH

Nesta fase pode ser ajustado o pH do meio para valores compatveis

com as bactrias, ou seja, pH 7, que se encontra definido pelo fabricante
para cada meio de cultura. Podem-se adicionar solues tampo (ex. fosfato
de sdio ou de potssio) para manter o valor do pH constante.
Em provas fermentativas adicionam-se tambm os indicadores de pH
(ex. vermelho de fenol), caso no faam j parte da composio do meio.

Distribuio

Distribui-se o meio de cultura em quantidades apropriadas por

recipientes apropriados (tubos de ensaio, frascos ou bales).

Esterilizao

Embora os meios sejam vendidos esterilizados, na fase de

rehidratao deixam de o ser e ento necessrio esteriliz-los de novo
para evitar a presena de microrganismos contaminantes e de outras
formas de vida. O mtodo de esterilizao utilizado condicionado pela
composio do meio de cultura.
A esterilizao dos meios de cultura pode ser feita de vrios modos:

* Em autoclave (aplicao do calor hmido sob presso):

O calor hmido o mtodo mais efectivo para matar os

microrganismos pois causa desnaturao e coagulao das protenas vitais
como as enzimas, enquanto o calor seco (estufa) causa oxidao dos
constituintes orgnicos da clula (isto os microrganismos vo-se
queimando lentamente). A desnaturao ocorre com temperaturas
inferiores e menor tempo de exposio do que a oxidao (ex. os
endsporos de Bacillus anthraccis so destrudos em 2-15 min. pelo calor
hmido enquanto com o calor seco demora mais de 180 min. a 140 C para
obter o mesmo resultado).
A maneira mais prtica de aplicar o calor hmido atravs do
autoclave, que consiste num sistema fechado de volume constante em que
um aumento de presso permite um aumento de temperatura. O autoclave
permite temperaturas altas, um aquecimento mais rpido e uma grande
penetrao de calor.
neste aparelho que se esterilizam por rotina os meios de cultura,
solues e materiais contaminados. Normalmente a esterilizao dos meios
de cultura faz-se por exposio ao vapor a 121 C e 15 lbs de presso
durante 15 minutos ou mais, dependendo do tipo de material a esterilizar.

* Por filtrao:

Quando na composio de um meio de cultura entram substncias

que no podem sofrer temperaturas elevadas (ex. gelatina) recorre-se
filtrao desses elementos termolbeis.
Utilizam-se filtros de membrana (de celulose), encontrando-se
disponveis uma grande variedade de poros de diferentes dimenses.
Geralmente usam-se membranas com poros de 0,2 m de dimetro que no
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permitem a passagem dos microrganismos, ficando assim o meio

esterilizado.
A filtrao uma excelente maneira de reduzir a populao
microbiana sem ocorrer destruio directa dos microrganismos, pois o filtro
simplesmente os remove.

Acondicionamento

Quando no se pretende usar o meio de cultura de imediato, este

deve ser conservado ao abrigo da luz, a uma temperatura entre 0 e 5 C no
perodo determinado pelo fabricante, evitando a sua desidratao. Para o
utilizar faz-se a redistribuio para recipientes j esterilizados onde se iro
posteriormente semear os microrganismos.
Os meios slidos para poderem ser redistribudos tem de ser
aquecidos at ficarem liquefeitos, transferidos para um banho de gua a 48-
50 C para arrefecerem, e finalmente distribudos por recipientes. J no
recipiente preciso deixar o meio arrefecer mais para solidificar (Figura 6).
Os meios slidos no estado liquefeito podem ser colocados em
tubos de ensaio (com tampa para evitar a contaminao e a desidratao
do meio de cultura) ou em placas de Petri. Para se obter um tubo em
rampa deixa-se arrefecer e solidificar o meio de cultura numa posio
inclinada, criando assim uma rampa mais ou menos pronunciada. So
usados para manter culturas puras. Por outro lado, deixando arrefecer o
meio num tubo na posio vertical temos um tubo em cilindro. Estes
tubos so usados, por exemplo, para estudar as necessidades em oxignio
dos microrganismos.
Os meios em placa de Petri proporcionam grandes reas de
superfcie para o isolamento e o estudo dos microrganismos. As placas de
Petri so formadas por duas metades, uma base (que contm o meio de
cultura) e uma tampa. H placas de Petri de vrios tamanhos sendo as
usadas por rotina de aproximadamente 9 cm de dimetro.
Os meios lquidos so distribudos em tubos de ensaio, bales ou
frascos tambm devidamente rolhados.

CULTURA DE MICRORGANISMOS - SEMENTEIRAS

OBSERVAO E CRTICA DOS RESULTADOS DAS SEMENTEIRAS
CARACTERSTICAS CULTURAIS DOS MICRORGANISMOS

Conhecer procedimentos para a cultura de microrganismos.

Compreender a importncia das tcnicas asspticas na cultura de
microrganismos.
Conhecer princpios e procedimentos das diversas tcnicas de
sementeira em placa.
Executar sementeiras em diferentes meios de cultura em placa para
isolamento de colnias a partir de produtos polimicrobianos.

TEXTO DE APOIO:
 Microbiologia Mdica 2006/2007

Semear a designao microbiolgica para a introduo, num meio

de cultura adequado, de um inculo de origem biolgica ou cultural.

Os instrumentos usados para a execuo das sementeira so:

- ansas simples ou calibradas.
- fio recto.
- pipeta Pasteur.
- vareta de Drigalsky.
- zaragatoa.
- outros

Os meios de cultura slidos podem ser distribudos de forma variada

de acordo com o que se pretende: em bales tipo Erlermeyer ou outros,
tubos em rampa, em cilindro e em placas de Petri.
Os meios de cultura lquidos (caldos) so habitualmente distribudos
em bales ou tubos.

A passagem de bactrias de um meio de cultura para outro

chamada repicagem.

Tcnicas de sementeira.
Meios slidos:
Em picada.
Em estria.
Esgotamento.
Em toalha.
Shake.

Meios lquidos:
Disperso.

O isolamento bacteriano pode ser obtido atravs de processos:

mecnicos - tcnica de sementeira por esgotamento.
biolgicos - utilizao de meios de cultura selectivos.

Incubao em estufa a 36 - 37 C

Observao do crescimento bacteriano.

Em meios slidos:

O crescimento traduz-se pelo aparecimento de colnias, isto ,

aglomerados de clulas resultantes da multiplicao bacteriana a partir de
um nico ancestral.

Nessas colnias devem ser averiguadas as seguintes caractersticas,

principalmente quando observadas em placas de Petri:

- tamanho ponta de alfinete, pequeno, mdio e grande.

- cor/pigmentao diversificadas.
- forma - circular, irregular, rizide e em toalha.
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- textura lisa, rugosa e mucide.

- brilho opacas e brilhantes.
- elevao - sem relevo (achatadas), com ligeiro relevo, relevo
marcado, convexo e mamilonadas.
- margens inteiras, lobadas, onduladas, serradas e
filamentosas.

Em meios lquidos

O crescimento nos caldos pode ser apreciado por:

- turvao - fina, uniforme, floculenta.
- sedimento.
- pelcula ou anel (crescimento superfcie)